مقالة منهجية

دراسة التفاعلات بين الخلايا النخاعية والخلايا التائية المستضدة المستضدة المستضدة في المختبر وفي الجسم الحي

1.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68013

⸱

يوليو 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

في هذه المقالة

ملخص

بالنظر إلى نماذج xenograft المحدودة المتاحة لدراسة التفاعلات بين الخلايا العربة البشرية والخلايا النخاعية ، أنشأنا نماذج في المختبر وفي الجسم الحي لفهم تأثيرات البلاعم البشرية على خلايا عربة الطفل. يمكن تعميم النتائج لتقييم أدوار البلاعم في البيئة المكروية للورم واختبار العلاجات المناعية التي تستهدف البلاعم.

الملخص

أدى العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) إلى نجاحات سريرية ملحوظة في علاج الأورام الخبيثة الدموية. ومع ذلك ، فإن معظم المرضى ينتكسون في غضون 1-2 سنوات. تم تحديد العديد من الآليات التي تؤدي إلى مقاومة عربات الأطفال ، بما في ذلك تثبيط الخلايا التائية بواسطة الخلايا النخاعية المثبطة للمناعة. أظهرت الأدلة المتزايدة أن الخلايا الوحيدة والضامة في البيئة الدقيقة للورم (TME) تساهم في ضعف أداء عربة التسوق والنتائج السريرية. النماذج قبل السريرية لدراسة التفاعلات بين البلاعم البشرية وخلايا عربة الأطفال محدودة. هنا ، نناقش مناهج فهم تأثيرات البلاعم البشرية على خلايا عربة التسوق في المختبر وفي الجسم الحي. نصف نماذج الزراعة المشتركة في المختبر لإظهار أن البلاعم المثبطة للمناعة تمنع وظائف عربة الطفل. بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا عن نموذج xenograft حيث يتم تطعيم البلاعم البشرية والخلايا السرطانية تحت الجلد في فئران NSG لدراسة تفاعلات البلاعم الشبيهة ب M2 مع خلايا CART والخلايا السرطانية. يمكن استخدام هذه النماذج لتقييم أدوار الضامة في TME واختبار العلاجات المناعية للسرطان التي تستهدف البلاعم.

المقدمة

حقق العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري الذاتي (CART) نجاحات سريرية في علاج الأورام الخبيثة الدموية الانتكاسية أو المقاومة للعلاج ، مما أدى إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على ستة منتجات CART تستهدف CD19 أو مستضد نضوج الخلايا البائية (BCMA) 1. على الرغم من النشاط الأولي المثير للإعجاب للعلاج بخلايا كارتة ، فإن معظم المرضى ينتكسون خلال أول 1-2 سنوات بعد العلاج2. تم تحديد العديد من آليات مقاومة عربات الأطفال التائية ، بما في ذلك لياقة الخلايا التائية دون المستوى الأمثل ، وهروب المستضد ، وضعف ثبات عربة الأطفال ، بالإضافة إلى التثبيط بوساطة البيئة المكروية للورم المثبط للمناعة (TME) 2،3. غالبا ما تشكل الخلايا النخاعية ، مثل الخلايا الوحيدة والضامة ، جزءا كبيرا من TME وقد ثبت أنها مثبطات رئيسية للخلايا المناعية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا التائية4،5. تم الإبلاغ عن الآثار الضارة للخلايا النخاعية في سياق الفعالية العلاجية لخلايا كارتة في النماذج قبل السريرية وفي التجارب السريرية لكل من أورام الدم والأورام الصلبة3،6. يمكن أن يحدث التثبيط بوساطة النخاع من بداية عملية تصنيع عربة التسوق - لقد ثبت أن الخلايا الوحيدة في منتج الفصادة الأولية تمنع توسع عربة الأطفال خارج الجسم الحي 7،8. بالنظر إلى الأدلة المتراكمة على تثبيط عربة الدم النخاعي بوساطة النخاع ، تهدف العديد من الدراسات إلى هندسة خلايا CART لاستهداف والقضاء على البلاعم المثبطة للمناعة في TME للحصول على استجابات مناعية أفضل5. ومع ذلك ، فإن الآليات الكامنة وراء التفاعلات بين خلايا CART والضامة المثبطة للمناعة لا تزال غير واضحة بشكل كامل. بالإضافة إلى ذلك ، هناك نماذج محدودة متاحة للجمهور لهذه التفاعلات. لذلك ، هناك حاجة ملحة لنماذج تدرس التفاعلات بين البلاعم البشرية وخلايا عربة الأطفال في المختبر وفي نماذج الفئران.

هنا ، نصف طريقة يتم فيها زراعة خلايا CART (CART19) البشرية المستهدفة ب CD19 مع الخلايا السرطانية CD19 + والضامة المستقطبة الشبيهة ب M2 خارج الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا عن نموذج فأر xenograft يتم فيه تطعيم الفئران التي تعاني من نقص المناعة تحت الجلد بكل من الخلايا المستهدفة والضامة البشرية ، مما يسمح بتقييم العلاجات المناعية ذات الأهمية في بيئة بها ضامة مثبطة للمناعة. على وجه التحديد ، قمنا بتحليل التكاثر الخاص بمستضد CART في وجود أو عدم وجود البلاعم المثبطة للمناعة في المختبر ، مما أظهر تثبيطا كبيرا في تمدد الخلايا التائية في كل من ألواح الزراعة المشتركة المباشرة والمباشرة. في نموذج xenograft الخاص بنا ، تم تطعيم فئران NSG تحت الجلد بالخلايا السرطانية والضامة البشرية المعلقة في Matrigel لفحص العلاج. أظهر هذا النموذج الحيواني بنجاح أن الضامة البشرية المثبطة للمناعة المتمايزة خارج الجسم الحي كانت قادرة على تعزيز تطور الورم في فئران NSG. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن اختبار فعالية العلاجات المثبطة للمناعة التي تستهدف البلاعم ، بما في ذلك الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة والبيولوجية والعلاجات الأخرى القائمة على الخلايا. ومع ذلك ، نظرا لقيود استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة لدراسة TME البشري ، فإن النماذج المقترحة هي الأنسب لدراسات إثبات المفهوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع البروتوكول أدناه إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في Mayo Clinic ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) وقسم الطب المقارن بموجب بروتوكول لجنة رعاية المؤسسية واستخدامها A00001767.

1. إعداد الخلايا الوحيدة الكلاسيكية البشرية للدراسة في المختبر

  1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) عن المتبرعين بالدم الأصحاء كما هو موضحسابقا 9. باختصار ، قم بتخفيف الدم الكامل بنسبة 2٪ FBS في PBS بنسبة حجم 1: 1 ، متبوعا بعزل PBMC في وسط تدرج الكثافة.
  2. عزل الخلايا الوحيدة الكلاسيكية البشرية (CD14 + CD16-) من PBMCs المحصودة عن طريق اختيار الخرزة المغناطيسية السلبية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). باختصار ، اغسل العدد المناسب من PBMCs بمخزن عازل وأعد تعليق الخلايا بالحجم المشار إليه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتسمية الخلايا باستثناء الخلايا الوحيدة الكلاسيكية مع كوكتيل الأجسام المضادة والميكروبات المغناطيسية. اجمع الخلايا الوحيدة الكلاسيكية من التدفق ، مع الاحتفاظ بالخلايا غير الوحيدة في الأعمدة.
    ملاحظة: افترض أن 5٪ من PBMCs بأكملها عبارة عن خلايا وحيدة كلاسيكية واضبط عدد خلايا البداية من PBMCs وفقا لذلك. احفظ PBMCs المتبقية لتأكيد نقاء مجموعة الخلايا الوحيدة في الخطوة 1.7. يجب دائما عزل الخلايا الوحيدة الكلاسيكية عن PBMCs الطازجة دون حفظ مسبق بالتبريد.
  3. احسب عدد الخلايا الوحيدة المعزولة باستخدام عداد الخلايا (جدول المواد) وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت لعزل الخلية لتصل إلى 1 × 106 خلايا / مل كتركيز نهائي. خذ 100 ميكرولتر من تعليق الخلية وانقله إلى صفيحة مسطحة القاع سعة 96 بئرا.
  4. انقل 1 × 105 PBMCs إلى نفس اللوحة مثل عنصر تحكم سلبي في البوابات لتأكيد نقاء سكان الخلايا الأحادية الكلاسيكية عن طريق قياس التدفق الخلوي. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. احتفظ بالخلايا الوحيدة المعزولة على الجليد خلال الخطوات 1.5-1.12.
  5. اغسل عن طريق تعليق الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطفية بعناية.
  6. لكل عينة ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من محلول FACS يحتوي على 0.3 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت (الإثارة عند 405 نانومتر) ، و 0.5 ميكرولتر من CD14 المضاد للإنسان المترافق مع APC10 (1 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 0.5 ميكرولتر من CD1611 المترافق مع PE المضاد للإنسان (1 نانوغرام / ميكرولتر. جدول المواد).
    ملاحظة: للحفاظ على اتساق التلوين ، قم بعمل مزيج رئيسي لعينات متعددة وفقا لعدد العينة الإجمالي. انقل 50 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل بئر.
  7. أضف 50 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل بئر واخلط الخلايا برفق لتجنب الفقاعات. احتضان الخلايا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  8. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطفية بعناية.
  9. اغسل بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطاففية بعناية وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي (جداول المواد).
  10. بوابة CD14 + CD16- السكان. تأكد من أن عدد CD14 + CD16- أعلى من 90٪ من الخلايا الحية للحصول على نقاء مثالي. بوابة CD14 + CD16 - عدد الفرديين المباشرين.
    ملاحظة: من المفترض أن المستخدمين على دراية بتحليل قياس التدفق الخلوي.

2. M0 تمايز البلاعم عن الخلايا الوحيدة الكلاسيكية البشرية

ملاحظة: تم اقتباس تمايز البلاعم الشبيه ب M2 من الخلايا الوحيدة الكلاسيكية البشرية من منشور سابق12.

  1. قم بتدوير الخلايا الوحيدة المعزولة عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطافية. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 × 106 خلايا / مل.
  2. أضف GM-CSF المؤتلف البشري للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل (جدول المواد) واخلطه جيدا. انقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى صفيحة 48 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة وأضف 50 ميكرولتر إضافية من وسائط زراعة الخلايا. تأكد من أن كل شرط يحتوي على 3 تكرارات للقراءة النهائية في اليوم 11.
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين إضافة المزيد من مجموعات التجارب وفقا لذلك. يتضمن هذا البروتوكول فقط المزارع المشتركة التجريبية للخلايا السرطانية والخلايا التائية مع أو بدون ضامة تشبه M2 (الجدول 1).
  3. انقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى صفيحة أخرى مكونة من 48 بئرا وأضف 50 ميكرولتر إضافية من وسائط زراعة الخلايا للتنميط الظاهري للبلاعم. تأكد من تضمين بئر واحد للتنميط الظاهري للبلاعم M0 والآخر للتنميط الظاهري للضامة الشبيهة ب M2.
  4. أضف 200 ميكرولتر من PBS في الآبار المحيطة لمنع تبخر زراعة الخلايا. احتضان الخلايا الوحيدة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام لتفريق الخلايا إلى ضامة M0.
  5. لدراسة التفاعلات بين البلاعم المتمايزة وخلايا CART19 المتطابقة مع المتبرع ، قم بعزل 1 × 107 خلايا T من PBMCs لنفس المتبرع وقم بإنشاء خلايا CART19 بعد إجراء إنتاج عربة التسوق لمدة 8 أيام كما هو موضحسابقا 9،13،14.
    ملاحظة: يتم إنشاء خلايا عربة التسوق التي تمت تكليفها باستخدام مجال إشارات CD28 من 5 × 106 خلايا T كما هو موضح سابقا9،13،14. في موازاة ذلك ، يتم إنشاء الخلايا التائية غير المحولة (UTD) باتباع نفس العملية9،13،14. سيتم استخدام الخلايا التائية UTD كعنصر تحكم سلبي في تكاثر الخلايا التائية للتحكم في الانتشار الخيفي.

3. تمايز البلاعم الشبيه ب M2 من البلاعم M0 من خلال الزراعة المشتركة مع الخلايا المستهدفة

  1. في اليوم 7 ، خذ الصفيحة المكونة من 48 بئرا مع البلاعم M0 واحتضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل. خلايا الماصة بقوة باستمرار مع إبقاء اللوحة على الجليد.
    ملاحظة: يعتمد طول حضانة الجليد على مدى التصاق البلاعم ، والتي يمكن أن تختلف بسبب تباين المانحين. الخلط الأول هو جمع البلاعم غير الملتصقة بشكل فضفاض ، لذلك يجب أن تكون عملية سحب العينات لمدة 5 دقائق كافية.
  2. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل (جدول المواد) مبرد مسبقا على الثلج. أضف 200 ميكرولتر من PBS المثلج إلى آبار الصفيحة المكونة من 48 بئرا وقم ببسط الخلايا المتبقية بقوة كل 10 دقائق حتى يتم فصل معظم البلاعم عن القاع. بعد كل سحب العينة، افحص الخلايا تحت المجهر واضبط وقت حضانة الثلج حسب الحاجة، مع أوقات حضانة أطول للخلايا الأكثر التماسك.
  3. انقل البلاعم M0 المنفصلة المتبقية إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل على الجليد. امزج الخلايا بعناية وعد الخلايا على عداد الخلايا.
  4. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطفية. أعد التعليق في PBS المثلج للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 × 106 خلايا / مل.
  5. انقل 200 ميكرولتر من الخلايا إلى صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا (جداول المواد). قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطفية بعناية. كعنصر تحكم سلبي في البوابات ، أضف ملطخا جيدا إضافيا بعلامات السكان الأصليين فقط.
  6. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS مكملا ب 1 ميكرولتر من محلول حجب مستقبلات Fc لكل عينة. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطفية بعناية.
    ملاحظة: من المهم احتضان البلاعم مسبقا باستخدام المخزن المؤقت الذي يحجب مستقبلات Fc قبل تلطيخ العلامة الفعلي لمنع النتائج الإيجابية الكاذبة.
  7. بالنسبة للعينة البئر ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 0.3 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت (الإثارة عند 405 نانومتر) ، و 0.5 ميكرولتر من CD14 المضاد للإنسان المترافق APC10 (1 نانوغرام / ميكرولتر) ، 0.5 ميكرولتر من CD206 المضاد للإنسان المترافق APC / Cy715 (2 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 0.5 ميكرولتر من CD163 16 المترافق مع PerCP المضاد للإنسان16 (2 نانوغرام / ميكرولتر ؛ جدول المواد). للتحكم في البوابات السلبية ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 0.3 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت و 0.5 ميكرولتر من CD14 المضاد للإنسان المترافق APC.
  8. أضف 50 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل بئر واخلط الخلايا برفق لتجنب الفقاعات. احتضان الخلايا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  9. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطفية بعناية.
  10. يغسل بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطاففية بعناية وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  11. قم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي وقم ببوابة مجموعة الخلايا CD14 + CD206 + CD163 + . استخدم التعبير عن CD163 و CD206 على البلاعم M0 كخط أساس للأنماط الظاهرية الشبيهة ب M2. من المتوقع هجرة السكان من CD163منخفضةCD206إلى CD163 عالية أوCD206 عالية في الضامة الشبيهة ب M2. يمكن أن يعتمد حجم التحول السكاني على المانحين.
  12. قم بإعداد خط الغرض من الخلايا السرطانية والاعتماد على عداد الخلايا.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول خط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح CD19 + غير الملتصقة ، JeKo-1 ، كهدف. يمكن اختبار خطوط الخلايا السرطانية الأخرى وقدرتها على التفريق بين البلاعم الشبيهة ب M0 إلى M2 حسب الحاجة.
    1. حافظ على خلايا JeKo-1 باستخدام وسائط الثقافة المقترحة من البائع (جدول المواد) عند 1 × 106 خلايا / مل في قارورة زراعة الأنسجة. امزج الخلايا السرطانية في القارورة وعدها بعداد الخلايا.
  13. قم بتدوير الخلايا المستهدفة عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق واستنشق المواد الطافية. أعد تعليق الخلايا المستهدفة بوسائط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: قم بإعداد العدد المناسب من الخلايا السرطانية بناء على عدد المجموعات التجريبية. تأكد من وجود 2 × 105 خلايا مستهدفة لكل مجموعة زراعة مشتركة تشبه M2 ، بما في ذلك لوحة التنميط الظاهري M2.
  14. انقل 100 ميكرولتر من الخلايا السرطانية إلى مجموعات الزراعة المشتركة للبلاعم الشبيهة ب M2 في صفيحة 48 بئرا المحضرة في اليوم 0 والماصة برفق للخلط. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى.
    ملاحظة: تم اختبار نسبة 2: 1 من البلاعم JeKo-1: M0 لتمايز النمط الظاهري الشبيه ب M2. يمكن اختبار النسب الأخرى حسب الحاجة.
  15. في اليوم 8 ، ضع لوحة التنميط الظاهري الشبيهة ب M2 على الجليد ، وافصل الخلايا بقوة ، واستعد للتنميط الظاهري كما هو موضح في الخطوات 3.4-3.11.
    ملاحظة: البلاعم الشبيهة ب M2 أكثر التماسك من الضامة M0 ، لذلك من المتوقع الحاجة إلى حضانة جليدية أطول. يستخدم هذا البروتوكول فقط PBS الجليدي والجليدي البارد لفصل البلاعم لتقليل الضغط على الخلايا.
  16. اجمع بين ملفات قياس التدفق الخلوي للتنميط الظاهري M0 من اليوم 7 مع التنميط الظاهري الشبيه ب M2. بوابة CD206 و CD163 لمجموعة الخلايا الأم CD14 + لعينة البلاعم M0 وتطبيق نفس استراتيجية البوابات على عينة البلاعم الشبيهة ب M2 لتصور التحول السكاني.
  17. لإدخال الخلايا التائية في المزارع المشتركة ، حصاد اليوم 8 CART19 و UTD الخلايا التائية التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.5 ونقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل. تخلط جيدا مع ماصة وتعد بعداد الخلايا.
  18. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وشفط المواد الطفية بعناية. أعد تعليق الخلايا التائية CART أو UTD في وسائط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 × 106 خلايا / مل.
  19. قم بإعداد خط الخلايا السرطانية والاعتماد على عداد الخلايا. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وشفط المواد الطافية.
  20. أعد تعليق الخلايا السرطانية بوسائط زراعة الخلايا للوصول إلى التركيز النهائي 2 × 106 خلايا / مل. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا السرطانية إلى آبار الزراعة المشتركة بدون ضامة تشبه M2 (الجدول 1).
  21. انقل 100 ميكرولتر من الخلايا التائية CART أو UTD إلى آبار الزراعة المشتركة المناسبة (الجدول 1). يجب أن تحتوي الزراعة المشتركة النهائية مع البلاعم الشبيهة ب M2 على خلايا سرطانية وخلايا تائية وبلاعم بنسبة 2: 2: 1. استخدم المزارع المشتركة بدون البلاعم كضوابط.
  22. للحفاظ على الحجم النهائي متسقا عبر المجموعات ، أضف 100 ميكرولتر أخرى من وسائط زراعة الخلايا إلى الآبار التي لا تحتوي على الضامة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
    ملاحظة: إذا تم استخدام خلايا عربة التسوق الخيفية ، فيجب على المستخدمين تضمين خلايا UTD T المتطابقة مع المتبرع في المزارع المشتركة كعنصر تحكم مناسب للكشف عن أي توسع للخلايا التائية الناجم عن التجانس. في هذه الحالة ، يجب إذابة خلايا CART و UTD T التي تم إنشاؤها مسبقا بالتبريد واستعادتها بشكل صحيح ، متبوعة بما لا يقل عن 3-4 ساعات من الراحة قبل إضافتها إلى المزارع المشتركة.

4. تحليل تكاثر المزارع المشتركة الخاصة بالمستضد

  1. في اليوم 11 ، ضع لوحة الزراعة المشتركة على الجليد وخلايا الماصة بقوة. امزج الخلايا جيدا وانقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: تتمثل القراءة الأساسية للمزارع المشتركة في تحديد توسع الخلايا التائية ، لذا فإن فصل البلاعم ليس ضروريا ما لم يخطط المستخدمون لتحليل علامات أخرى على البلاعم في نفس اللوحة أيضا.
  2. أضف 200 ميكرولتر من PBS المثلج إلى آبار العينة والماصة بقوة. انقل المحلول المتبقي إلى نفس أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
  3. افحص الآبار تحت المجهر (10x) للتأكد من حصاد الخلايا المعلقة بالكامل. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطفية.
  4. قم بتعليق الخلايا من جميع الظروف باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ونقله إلى صفيحة مسطحة القاع سعة 96 بئرا. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطفية بعناية.
  5. تحضير 50 ميكرولتر من محلول FACS يحتوي على 0.3 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت (الإثارة عند 405 نانومتر) و 0.5 ميكرولتر من CD317 المترافق مع APC (1 نانوغرام / ميكرولتر; جدول المواد) لكل عينة جيدا. أضف 50 ميكرولتر من محلول التلوين في كل بئر واخلط الخلايا بعناية باستخدام ماصة لتجنب الفقاعات.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، سيكون هناك كريات كبيرة الخلية. للتأكد من تلطيخ جميع الخلايا التائية ، تحقق من الجزء السفلي من اللوحة للتأكد من عدم وجود كريات خلوية متبقية بعد الخلط جيدا.
  6. احتضان الخلايا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطفية بعناية.
  7. يغسل بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. صب المواد الطاففية بعناية وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  8. قم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي. قم بتوصيل خلايا CD3 + وحدد العدد المطلق لخلايا CD3 + الحية على النحو التالي:
    figure-protocol-1
  9. قم برسم بياني للعدد المطلق لخلايا CD3 + في كل حالة باستخدام GraphPad Prism.
    ملاحظة: من المتوقع أن تحتوي المزارع المشتركة التي تحتوي على الضامة الشبيهة ب M2 بعدد أقل بكثير من الخلايا التائية CD3 مقارنة بالظروف في غياب الضامة الشبيهة ب M2.

5. تأثير البلاعم الشبيهة ب M2 على خلايا عربة التسوق في نظام الوصلة

ملاحظة: تفصل صفائح Transwell فعليا الضامة الشبيهة ب M2 عن خلايا CART المحفزة وتسمح فقط للجزيئات القابلة للذوبان بالانتقال بين أنواع الخلايا ، مما يتيح للمستخدمين دراسة ديناميكيات التفاعلات المستقلة عن التلامس بين البلاعم وخلايا CART (الشكل 1).

  1. اعزل 1 × 106 خلايا وحيدة كلاسيكية بشرية وتأكد من نقاء السكان عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.10. قم بتدوير 1 × 106 خلايا وحيدة عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطافية.
    ملاحظة: قد يرغب المستخدمون في إنشاء خلايا CART ذاتية المنشأ وخلايا UTD المطابقة للمتبرع كما هو موضح في الخطوة 2.5.
  2. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 × 106 خلايا / مل. أضف GM-CSF المؤتلف البشري للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 10 نانوغرام / مل واخلطه جيدا.
  3. انقل 200 ميكرولتر من الخلايا المعلقة إلى البئر السفلي لصفيحة 24 بئرا (0.4 ميكرومتر) مع 3 مكررات تقنية. أضف 100 ميكرولتر إضافية من وسائط زراعة الخلايا إلى كل بئر وتأكد من تغطية قاع البئر بالكامل. أضف 300 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى 3 آبار أخرى للظروف التي لا تحتوي على البلاعم (تحكم إيجابي).
  4. أضف 200 ميكرولتر من PBS في الآبار المحيطة لمنع تبخر زراعة الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
  5. في اليوم 7 ، قم بإعداد 1.4 × 106 خلايا سرطانية JeKo-1 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وشفط المواد الطافية.
  6. أعد تعليق الخلايا السرطانية بوسائط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 × 106 خلايا / مل. أضف 200 ميكرولتر من الخلايا السرطانية إلى الآبار السفلية لجميع حالات العينة واخلطها جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى. استخدم الآبار السفلية مع JeKo-1 فقط كتحكم إيجابي.
  7. في اليوم 8 ، يوم الحصاد 8 ، تم إنشاء خلايا CART و UTD T في الخطوة 5.1. وإعادة تعليق الخلايا التائية في وسط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: إذا تم استخدام خلايا العربة الخيفية ، فيجب على المستخدمين تضمين خلايا UTD T المتطابقة مع المتبرع في المزارع المشتركة كما هو موضح في الخطوة 3.22.
  8. عد وإعداد 1.4 × 106 خلايا JeKo-1. انقل الخلايا السرطانية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. استنشاق المواد الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 × 106 خلايا / مل. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا التائية المحضرة و 100 ميكرولتر من الخلايا السرطانية إلى كل بئر علوي لجميع حالات العينة.
  10. امزج الخلايا جيدا في البئر العلوي واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  11. في اليوم 11 ، قم بخلط الخلايا في الغرفة العلوية ونقلها إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. اغسل الآبار العلوية ب 200 ميكرولتر من PBS وانقل الخلايا المتبقية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
  12. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطفية. إجراء مقايسة تكاثر الخلايا التائية كما هو موضح في الخطوات 4.4-4.9.
    ملاحظة: يمكن للضامة الشبيهة ب M2 المستقطبة JeKo-1 أن تمنع تكاثر الخلايا التائية الخاصة بالمستضد بطريقة مستقلة عن التلامس. يمكن اختبار نماذج الأورام الأخرى حسب الحاجة.

6. إنشاء نموذج xenograft مع كل من البلاعم البشرية والورم في فئران NSG

  1. اعزل 1 × 107 خلايا وحيدة كلاسيكية بشرية وتأكد من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.10. استخدم فئران NSG المطعمة ب JeKo-1 وحدها كعنصر تحكم لتأكيد التأثيرات المؤيدة للورم للضامة الشبيهة ب M2 ، كما هو موضح في الشكل 2.
    ملاحظة: يقوم هذا البروتوكول بتطعيم فئران NSG ب 5 × 105 ضامة بشرية تحت الجلد. يبلغ تعافي البلاعم بعد الانفصال في اليوم 7 حوالي 50٪. يمكن للمستخدمين ضبط أرقام الخلايا وفقا لذلك والتأكد من إعداد خلايا إضافية.
  2. قم بتدوير الخلايا الوحيدة المعزولة عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطافية. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 × 106 خلايا / مل.
  3. أضف GM-CSF المؤتلف البشري للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 10 نانوغرام / مل واخلطه جيدا. انقل الخلايا الوحيدة إلى قارورة زراعة الأنسجة T25 واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
  4. في اليوم السابع ، قم بعمل ماصة الخلايا بقوة على الجليد كل 10 دقائق وفحص الخلايا تحت المجهر حتى يتم فصل معظم البلاعم. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل على الجليد ، واغسل القارورة باستخدام PBS المثلج لفك الخلايا المتبقية ، ودمج الخلايا في الأنبوب المخروطي.
  5. عد الخلايا على عداد الخلايا. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطفية.
  6. اغسل الخلايا وأعد تعليقها باستخدام 5 مل من PBS المثلج. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطفية.
  7. أعد تعليق الخلايا في PBS المثلج للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 × 107 خلايا / مل. انقل محلول الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واحتفظ به على الجليد.
  8. قم بإعداد 1.5 × 107 خلايا لوسيفيراز + JeKo-1 ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    ملاحظة: نظرا لقلة عدد الخلايا المحقونة ، فإن التصوير الحيوي (BLI) ضروري لمراقبة عبء الورم. يمكن زيادة عدد البلاعم والخلايا السرطانية للحقن تحت الجلد حسب الحاجة. إذا كانت الأورام مرئية ويمكن الوصول إليها عن طريق الفرجار بعد الحقن، فيمكن استخدام الخلايا السرطانية البرية بدلا من ذلك.
  9. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق واستنشق المواد الطافية. أعد تعليق الخلايا في PBS المثلج للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 4 × 107 / مل.
  10. انقل نفس الحجم من البلاعم والخلايا السرطانية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد آخر سعة 1.5 مل واخلطه جيدا. أضف نفس الحجم من مصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان في محلول الخلية المختلطة واخلطها جيدا على الثلج.
    ملاحظة: يجب إذابة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد طوال الليل لمنع التصلب. في هذه المرحلة ، يحتوي كل 100 ميكرولتر من محلول الخلية على 5 × 105 ضامة و 1 × 106 JeKo-1 معلقة في مصفوفة الغشاء القاعدي ، والتي تستخدم نفس نسبة عدد الخلايا المستخدمة في بروتوكول تمايز البلاعم الشبيه ب M2 في المختبر .
  11. كعنصر تحكم ، قم بنقل خلايا JeKo-1 المحضرة المتبقية بنفس الحجم من PBS المثلج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل ، مع إضافة نفس الحجم من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى محلول الخلية وخلطها جيدا على الجليد.
  12. تحضير 10 فئران من الإناث والذكور NOD-SCID-γ-/- (NSG) تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع (~ 20 جم) للتخدير الاستنشاقي مع 2.5٪ إيزوفلوران. إدخال تخدير الأيزوفلوران باستخدام جهاز تخدير مستنشق القوارض. يتم تسليم الأيزوفلوران المتبخر إلى غرفة ومرحلة ساخنة مع مخاريط الأنف.
  13. ضع الفئران في غرفة التخدير لمدة 1-2 دقيقة. انقل الفئران إلى مخاريط الأنف على المسرح المسخن بمجرد فقدان ردود الفعل الوضعية واليمنى18. حافظ على الفئران في مرحلة التسخين طوال العملية. ضع مرهم العين على كلتا عيني الفئران لمنع تلف القرنية بسبب فقدان منعكس الوميض أثناء التخدير.
  14. احلق الجناح الأيمن لكل فأر بعناية لكشف الجلد بعد تخدير الفئران. قم بتحميل حقنة 0.5 مل ب 100 ميكرولتر من خليط خلايا JeKo-1-macrophage وقم بإزالة الفقاعات في المحلول بعناية.
  15. ارفع الجلد المكشوف يدويا بعناية وأدخل الإبرة في المنطقة المرفوعة. استمر في رفع الجلد بالإبرة واضغط على إصبع واحد في موقع الحقن. حاول ألا تحرك الإبرة بمجرد إدخالها لمنع الثقوب العرضية وتسرب الخلايا.
  16. حرر الخلايا ببطء في الطبقة تحت الجلد وقم بإزالة الإبرة بعناية. كرر الحقن تحت الجلد لجميع الفئران ال 10 NSG ، حيث تتلقى 5 فئران كلا من JeKo-1 والضامة و 5 فئران تتلقى JeKo-1 وحدها.
  17. تحضير D-luciferin (جدول المواد) بتركيز 15 مجم / مل. قم بتحميل حقنة 0.5 مل مع 200 ميكرولتر من D-luciferin وحقنها في كل فأر داخل الصفاق.
  18. ضع الفئران المخدرة على المسرح لمدة BLI بعد 10 دقائق من حقن D-luciferin. قم بإجراء BLI لكل فأر وقم بتسجيله كخط أساس (اليوم 0) لعبء الورم. ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصها.
    ملاحظة: يحتاج المستخدمون إلى التأكد من عدم ترك الفئران المخدرة دون رقابة حتى تستعيد وعيها للحفاظ على الاستلقاء القصي بعد إجراء التصوير.
  19. مراقبة عبء الورم بمقدار BLI 2x في الأسبوع حتى يتم الوصول إلى نقاط النهاية التجريبية أو الإنسانية. يتم الوصول إلى نقطة النهاية الإجمالية للبقاء على قيد الحياة بمجرد أن يكون حجم الورم عند 2000مم 3 أو أكثر، محسوبة بالصيغة أدناه:
    figure-protocol-2
    ملاحظة: يمكن تعديل طول مراقبة الورم بناء على الغرض من التجارب والقراءات المطلوبة. نظرا لصغر حجم الورم في أول 2-3 أسابيع ، يوصى باستخدام BLI لمؤشر عبء الورم. بمجرد أن تصبح الأورام مرئية ويمكن الوصول إليها عن طريق الفرجار ، يوصى باستخدام قياسات BLI والفرجار لتحليل الورم بدقة.
  20. لدراسة التفاعلات بين البلاعم البشرية المطعمة وخلايا CART19 الذاتية في فئران NSG ، قم بتوليد وزرع البلاعم البشرية المتمايزة خارج الجسم الحي كما هو موضح في الخطوات 6.1-6.16. عزل الخلايا التائية الذاتية من نفس المتبرع بالدم في الخطوة 6.1 باتباع بروتوكول تصنيع عربة التسوق لمدة 8 أيام كما هو موضح سابقا9،13،14.
    ملاحظة: يتم التعامل مع كل ماوس NSG ب 2 × 106 خلايا CART19. يجب على المستخدمين إنشاء ما لا يقل عن 2 × 107 خلايا عربة لعلاج 10 فئران. يتم حفظ خلايا عربة التسوق بالتبريد في اليوم 8 وتخزينها حتى يتم تطعيم JeKo-1 / الضامة في الفئران ، بعد 5 أيام من الحقن تحت الجلد.
  21. بعد 5 أيام من حقن الورم / البلاعم ، قم بترتيب الفئران بشكل عشوائي بناء على BLI كما هو موضح في الخطوات 6.17-6.18. قم بإذابة خلايا CART وتحضيرها كما هو موضح في الخطوة 3.22. اغسل خلايا عربة التسوق باستخدام PBS وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  22. قم بتعليق خلايا CART في PBS للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 × 107 خلايا / مل. قم بتحميل حقنة 0.5 مل ب 100 ميكرولتر من خلايا CART المحضرة وحقنها في كل فأر مطعمة بالورم عن طريق الوريد من خلال الوريد الذيلي.
  23. مراقبة عبء الورم بواسطة BLI مرة واحدة في الأسبوع لمدة 4 أسابيع.
    ملاحظة: نظرا للوظائف المثبطة للمناعة للبلاعم البشرية المطعمة ، من المتوقع أن يكون ضعف الأنشطة المضادة للأورام في عربة التسوق وارتفاع عبء الورم في الفئران التي تم حقنها ب JeKo-1 / البلاعم.

7. تأكيد النمط الظاهري الشبيه ب M2 في البلاعم البشرية المطعمة عن طريق تلطيخ التألق المناعي

  1. لتأكيد النمط الظاهري الشبيه ب M2 الناجم عن JeKo-1 في البلاعم البشرية المطعمة الموصوفة في الخطوة 6 عن طريق تلطيخ التألق المناعي ، اتبع الخطوات 6.1-6.19 وقم بزيادة عدد البلاعم المحقونة و luciferase + JeKo-1 إلى 5 × 106 خلايا و 1 × 107 خلايا لكل فأر NSG ، على التوالي.
    ملاحظة: يجب على المستخدمين التأكد من أن الحجم النهائي للحقن لكل فأرة هو 100 ميكرولتر.
  2. في اليوم 7 ، قتل فئران NSG بواسطة ثاني أكسيد الكربون2 ، وقم بخلع عنق الرحم ، وتأكد من فقدان ردود فعل القرنية كما هو موضحسابقا 19. ضع الفئران على منضدة العمل مع توجيه الأورام لأعلى. رش 70٪ من الإيثانول على مواقع الورم وحصاد الأورام المطعمة بعناية بالمقص والملقط.
  3. نقل أنسجة الورم إلى 50 مل أنابيب مخروطية مملوءة ب 20-30 مل من 4٪ بارافورمالدهيد للتثبيت كما هو موضحسابقا 20. الحفظ بالتبريد والأنسجة السرطانية للاستئصال المناعي وفقا للبروتوكولالمنشور سابقا 20.
  4. ينزلق أنسجة الورم مع الجسم المضاد للفأر CD206 المضاد للإنسان المقترن ب AF546 (1:50) والجسم المضاد للأرانب المضاد للإنسان iNOS المقترن ب AF647 (1: 100) المخفف في مخزن تلطيخ التألق المناعي ، متبوعا بتلوين النواة وحفظها كما هو موضحسابقا 21.
    ملاحظة: للحصول على أفضل نتائج التلوين، يجب على المستخدمين إجراء معايرة الأجسام المضادة وفقا لذلك، خاصة عند استخدام خطوط خلايا سرطانية مختلفة.
  5. احصل على صور التألق المناعي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عند 40x. للتأكد من أن البلاعم البشرية المطعمة تطور نمطا ظاهريا يشبه M2 ، توقع أن ترى تعبيرا عن CD206 البشري والحد الأدنى من التعبير عن iNOS البشري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نماذج في المختبر وفي الجسم الحي لدراسة التفاعلات بين البلاعم البشرية المثبطة للمناعة وخلايا عربة الأطفال بسبب الطبيعة المعقدة وديناميكيات التفاعلات ونماذج الطعم الغريب المحدودة الموجودة. باتباع البروتوكول ، يتم تمييز الخلايا الوحيدة الكلاسيكية البشرية المعزولة لاكتساب أنماط ظاهرية تشبه M2 وتصبح مثبطة للمناعة وظيفيا.

لتأكيد نقاء الخلايا الوحيدة الكلاسيكية البشرية المعزولة ، قم بتشغيل عينات ملطخة على مقياس التدفق الخلوي وقم بتحليلها عن طريق البو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أظهر العلاج بخلايا عربة الماء العديد من النجاحات السريرية في علاج مجموعات فرعية من المرضى الذين يعانون من أورام خبيثة دموية ، لكن معظم المرضى ينتكسون في غضون 1-2 سنوات بعد تسريب CART1،2. تم تحديد العديد من آليات مقاومة عربة التسوق المحتملة ، ووجد أن الخلايا النخاعية المثبطة للمناعة تلعب دورا مهما في تثبيط مناعة TME وفشل CART اللاحق3،4،5<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

SSK هي مخترعة لبراءات الاختراع في مجال العلاج المناعي لمستقبلات القلب المرخصة لشركة Novartis (من خلال اتفاقية بين Mayo Clinic وجامعة بنسلفانيا ونوفارتيس) و MustangBio (من خلال Mayo Clinic) و Sendero (من خلال Mayo Clinic). RLS و SSK مخترعان لبراءات الاختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخصة ل Humanigen (من خلال Mayo Clinic). KY و RLS و TH و BK و ES و SSK هم مخترعون لبراءات الاختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخصة لشركة Immix. تتلقى SSK تمويلا بحثيا من Kite و Gilead و Juno و BMS و Novartis و Humanigen و MorphoSys و Tolero و Sunesis / Viracta و LifEngine Animal Health Laboratories Inc. و Incyte و Lentigen. شاركت SSK في اجتماعات استشارية مع Kite / Gilead و Humanigen و Juno / BMS و Capstan Bio و Novartis. عملت SSK في مجلس سلامة البيانات والمراقبة مع Humanigen و Carisma. عملت SSK كمستشارة لشركة Torque و Calibr و Novartis و Capstan Bio و Carisma و Humanigen.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من خلال مركز Mayo Clinic الشامل للسرطان (SSK) ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ومركز Mayo Clinic للعلاجات الحيوية التجديدية (SSK) ومنحة المعاهد الوطنية للصحة R37CA266344-01 (SSK) ومنحة وزارة الدفاع CA201127 (SSK).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حقنة 0.5 ملفيشر العلمية329461
أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملإيبندورف1415-2508 
أنبوب مخروطي 15 ملكورنينج لايف ساينسز352097
لوحة ترانسويل 24 بئر (0.4 μ m)كورنينج لايف ساينسز3397
أنبوب مخروطي 50 ملكورنينج لايف ساينسز352098
APC / Cy7 المقترن المضاد للإنسان CD206بيوليجند321119الجسم المضاد للتدفق
CD14 مضاد للإنسان مقترن ب APCبيوليجند325607الجسم المضاد للتدفق
CD3 مضاد للإنسان مقترن ب APCبيوليجند344811الجسم المضاد للتدفق
حل الشطف autoMACSميلتيني بيوتيك130-091-222المخزن المؤقت لعزل الخلايا الوحيدة الطبقية 
مصفوفة غشاء الطابق السفليكورنينج لايف ساينسزCLS356237مصفوفة غشاء القاعدة القابلة للذوبان
وسائط زراعة الخلايا10٪ مصل AB بشري 1٪ بنسلين - ستربتومايسين - جلوتامين في X-VIVO 15 وسط الخلايا المكونة للدم الخالي من المصل
طقم عزل الخلية الأحادية الكلاسيكية ، بشريميلتيني بيوتيك130-117-337
نظام CytoFLEX   ب5-R3-V5بيكمان كولترج04652مقياس التدفق الخلوي
د-لوسيفيرينالتكنولوجيا الحيوية الذهبيةالحظ -1 جي
D-PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco)جيبكو14190250 
مرهم العينثيرموفيشر19-090-832
مخزن مؤقت FACS2٪ FBS 1٪ أزيد الصوديوم في PBS
مصل أبقار الجنينكورنينج لايف ساينسز35-011-السيرة الذاتية
صفيحة مسطحة القاع 96 بئركورنينج لايف ساينسزCLS3997
مصل AB البشري المجمع المعطل بالحرارة   ؛البحوث المبتكرة4931
الإنسان TruStain fcX (حل حجب مستقبلات لجنة الاتصالات المتقدمة)بيوليجند422301
سائل الأيزوفلوران   ؛  بيرامال فارما المحدودة66794-017-10
نظام التصوير IVIS Spectrum في الجسم الحيبيركين إلمر124262
وسائط زراعة خط الخلية JeKo-110٪ FBS 1٪ بنسلين - ستربتومايسين - جلوتامين في وسط RPMI-1640
طقم بقع الخلايا الميتة المائية القابل للإصلاح الحي / الميت ، لإثارة 405 نانومترإنفيتروجينL34966
عمود LSميلتيني بيوتيك130-042-401اختيار حبة سلبية
ليمفوبربتقنيات الخلايا الجذعية07811وسط تدرج الكثافة
حل مخزون MACS BSAميلتيني بيوتيك130-091-376المخزن المؤقت لعزل الخلايا الوحيدة الطبقية 
الجسم المضاد CD206 المضاد للإنسان مع AF546   ؛سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-376232
موافقه. Cg-Prkdcscid  فئران Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG)مختبر جاكسون  5557
PE المقترن المضاد للإنسان CD16بيوليجند302007الجسم المضاد للتدفق
البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين (100x) ، سائلجيبكو10378-016
CD163 المترافق المضاد للإنسان PerCPبيوليجند333625الجسم المضاد للتدفق
الأجسام المضادة iNOS المضادة للإنسان مع AF647   ؛بروتين تكسي إل 647-18985
المؤتلف البشري GM-CSFتقنيات الخلايا الجذعية78015
RPMI-1640 متوسطجيبكو11875093
SepMate-50 IVDتقنيات الخلايا الجذعية85450عزل PBMC عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة 
أزيد الصوديوم ، 5٪ (وزن / حجم)ريكا للكيماويات7144.8-16
صفيحة 48 بئرا معالجة بزراعة الأنسجةكورنينج لايف ساينسز3548
محلل صلاحية الخلية XR للخلايا السادسةبيكمان كولترعداد الخلية
X-VIVO 15 خلية متوسطة خالية من المصل المكونة للدملونزا04-418س

المراجع

  1. Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  4. Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
  5. Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  6. Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
  7. Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
  8. Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
  9. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  10. Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
  11. Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
  12. Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
  13. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
  16. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  17. Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
  18. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  19. Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  20. Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
  21. Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
  22. Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
  23. Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
  24. Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة