يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تعمل المنتجات النهائية المتقدمة للجليكاسیون على توعية الخلايا العصبية البشرية الشبيهة بالحسية لتدفق الكالسيوم الناجم عن الكابسيسين

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68036

⸱

مايو 2, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pain and Signaling, Butantan Institute, 2Center of Excellence in New Target Discovery, Butantan Institute, 3Innovation and Development Laboratory, Innovation and Development Center, Butantan Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ترتبط زيادة المنتجات النهائية للجليكاسیون المتقدمة المشتقة من الكولاجين (AGEs) باستمرار بالأمراض المؤلمة. هنا ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان الجليكيشن يحسس الخلايا العصبية الحسية لإثارة الكابسيسين.

الملخص

ترتبط المنتجات النهائية المتقدمة المشتقة من الكولاجين (AGEs) باستمرار بالأمراض المؤلمة ، بما في ذلك هشاشة العظام والاعتلال العصبي السكري والاضطرابات التنكسية العصبية. تكتسب الخلايا العصبية البشرية الشبيهة بالحسية المتمايزة عن خط الخلايا SH-SY5Y وظائف مؤيدة للألم عند تعرضها ل AGEs عن طريق إطلاق المادة P وتنظيم تعبير الفانيلويد المحتمل للمستقبل العابر 1 (TRPV1). هنا ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان هذا المستقبل نشطا وظيفيا وما إذا كانت عملية الجليكيشن تحسس الخلايا العصبية الحسية لإثارة الكابسيسين. تم الحصول على خلايا الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية من تمايز خلايا SH-SY5Y مع حمض الريتينويك عبر جميع أنواع الريتينويك وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. حضانة مصفوفة الكولاجين السكري خارج الخلية (ECM-GC) يحاكي حافزا مؤيدا لدخول الألم. تم تحضين الخلايا الضابطة بمصفوفة كولاجين خارج الخلية غير السكرية (ECM-NC). تم استخدام مجموعة فحص تدفق الكالسيوم Fluo-8 لتقييم تدفق الكالسيوم ، والذي تم تحفيزه بواسطة الكابسيسين. تظهر النتائج أن الجليكيشن يزيد من تدفق الكالسيوم مقارنة بالخلايا المعالجة بالكولاجين الطبيعي ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية تعبر عن قنوات TRPV1 الوظيفية وأن الجليكيشن يزيد من إثارة الكابسيسين. تشير هذه البيانات إلى خلايا الخلايا العصبية الحسية الشبيهة بحساسية AGEs ، مما يؤدي إلى إشارات مؤيدة للألم. تشير نتائجنا معا إلى أننا أنشأنا نموذجا وظيفيا يستجيب للكابسيسين يمكن أن يكون مفيدا لفحص المرشحين لإدارة الحالات المؤلمة.

المقدمة

Glycation هي عملية غير إنزيمية ولا رجعة فيها وعفوية ترتبط فيها البروتينات ، مثل الكولاجين ، بجزيئات السكر المختزلة ، مما يؤدي إلى منتجات نهائية متقدمة للجليكاسیون (AGEs). قد تنشط AGEs مستقبلات الغشاء الخلوي ، مما يؤدي إلى تنشيط المسارات داخل الخلايا ، مثل بروتين كيناز المنظم للإشارة خارج الخلية (ERK) 1/2 ، وبروتين كيناز المنشط بالميتوجين p38 (MAPK) ، وكينازات c-jun n-terminal (JNKs) ، و rho-GTPases ، و phosphoinositol-3-kinase (PI3K) ، و Janus kinase / محول إشارة ومنشط النسخ (JAK / STAT) ، وبروتين كيناز C (PKC) ، مما يزيد من إطلاق الجزيئات المسببة للالتهابات والإجهاد التأكسدي1. يضعف الكولاجين السكري أيضا بنية وخصائص المصفوفة خارج الخلية ، وترتبط زيادة AGEs المشتقة من الكولاجين باستمرار بالأمراض المؤلمة ، بما في ذلك هشاشة العظام والاعتلال العصبي السكري والاضطرابات التنكسيةالعصبية 2،3.

أثبتت مجموعتنا سابقا أنه يمكن تمييز خط خلايا SH-SY5Y إلى خلايا عصبية شبيهة بالحسية لأن هذه الخلايا تعبر عن القنوات المشاركة في الشعور بالألم ، مثل قنوات الصوديوم (Nav 1.7 و Nav 1.8 و Nav 1.9) ومستقبلات عابرة من النوع 1 من الفانيلويد المحتمل (TRPV1) ، وهي علامات توجد عادة في الخلايا العصبية الحسيةالمحيطية 4. TRPV1 هي قناة كاتيونية غير انتقائية منفذة لأيونات الكالسيوم وحساسة لتحفيز الكابسيسين. الأهم من ذلك ، عندما تتعرض الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية لمصفوفة الكولاجين السكري (ECM-GC) ، فإنها تكتسب وظائف مؤيدة للألم عن طريق زيادة تعبير c-Fos ، وهو عامل نسخ يشارك في تنشيط الخلايا العصبية ، وإطلاق المادة P ، وهو ببتيد عصبي يشارك على نطاق واسع في الالتهاب العصبي والألم. تستجيب هذه الخلايا للمسكنات ، مثل المورفين ، النموذج الأولي للمواد الأفيونية ، مما يقلل من إطلاق المادة P التي يسببها ECM-GC. تشير هذه البيانات معا إلى أن هذا النموذج يستجيب لجزيء مؤيد ومضاد للألم4،5.

تعد مراقبة تغيرات تركيز Ca2+ داخل الخلايا أمرا ضروريا لدراسة العديد من العمليات الخلوية. في الخلايا العصبية ، يمكن أن تكون أداة مفيدة للتنبؤ بتلف الخلايا العصبية وخصائص الحماية العصبية للأدوية. الكابسيسين ، العنصر النشط اللاذع للفلفل الحار ، هو ناهض أكثر موارد دراسة لمستقبلات TRPV15 وأداة قيمة لدراسة آليات الألم وفحص المسكنات الجديدة المحتملة. أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا العصبية الحسية الأولية من العقد الجذرية الظهرية للقوارض المحتضنة بارتفاع الجلوكوز تظهر زيادة كبيرة في تدفق الكالسيوم الناجم عن الكابسيسين6. ومع ذلك ، لا تزال غير معروفة ما إذا كانت قناة TRPV1 نشطة وظيفيا في نموذج الخلية الخاص بنا وما إذا كان الكولاجين السكري يحسس خلايا الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية لإثارة الكابسيسين ، والتي قد تنشط مسارات الإشارات المحسوبة للألم. لذلك ، هدفنا إلى تطوير بروتوكول فعال من حيث التكلفة باستخدام أدوات بسيطة لمراقبة الكالسيوم في الوقت الفعلي في الخلايا الشبيهة بالحسية مع ضمان تحليل موثوق. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لمساعدة الباحثين على المضي قدما في خطوات التفريق بين خلايا SH-SY5Y في الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية وكيفية توعيتها بالمحفزات المؤيدة للألم. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في اكتشاف مركبات مسكنة أو واقية من الأعصاب جديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

مزرعة 1. SH-SY5Y والتمايز إلى خلايا عصبية شبيهة بالحسية

ملاحظة 1: يجب أن تتم جميع الخطوات الواردة في هذا القسم تحت غطاء التدفق الصفحي ، ويجب أن تكون جميع المحاليل والإمدادات معقمة.

  1. أولا ، قم بإعداد قارورة ثقافة (25 سم2) بإضافة 5 مل من وسط الاستزراع.
    ملاحظة: لإذابة هذا النوع من الخلايا وتوسيعه وصيانته ، استخدم مزيجا من وسط الاستزراع: Dulbecco Modified Eagle's و Ham's Medium F12 (DMEM / F12) مكملا بمصل بقري جنيني معطل للحرارة بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. بعد ذلك ، قم بإزالة أنبوب التبريد الذي يحتوي على خلايا SH-SY5Y من النيتروجين السائل واحتفظ به على الجليد. قم بإذابة الخلايا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  3. أضف 1 مل من وسط المزرعة الكامل إلى التبريد، وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل، وأضف 3 مل من وسط المزرعة الكامل (DMEM/F12 مكمل بمصل بقري الجنين المعطل حراريا بنسبة 10٪)، واخلطه عن طريق سحبه بشكل متكرر وتوزيعه مرة أخرى في الأنبوب باستخدام ماصة.
  4. قم بعرض الخلايا في أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 290 جم. تخلص من المادة الطافية لإزالة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وهو عامل وقائي بالتبريد يستخدم لمنع تكوين بلورات الجليد أثناء تجميد الخلايا.
  5. أضف 1 مل من وسط المزرعة إلى حبيبات الخلية ، واخلطها جيدا باستخدام ماصة ، وضعها في قارورة ثقافة مقاس 25 سم2 لتوسيع الخلايا. ضع الخلايا في حاضنة في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80٪ من التقاء. للتمايز العصبي ، يوصى باستخدام خلايا SH-SY5Y حتى مرور الخلية العشرين.
  6. قم بإعداد مصفوفة الكولاجين خارج الخلية (100 ميكروغرام / مل) عن طريق تخفيف الكولاجين من النوع الأول من ذيل الفئران في PBS المعقم ، وصب 1 مل من هذا المحلول في طبق بتري (35/10 مم) للطلاء.
  7. احتضان هذا في حاضنة في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 ساعة تقريبا.
  8. بعد هذه الفترة ، اغسل الطبق مرتين باستخدام PBS معقم ، ثم عد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer.
  9. لعد الخلايا ، اغسل أولا قارورة المزرعة مقاس 25 سم2 التي تحتوي على الخلية ب 5 مل من PBS المعقم لإزالة كل وسط الاستزراع. ثم قم بإزالة PBS المعقم ، وأضف 3 مل من 0.05٪ التربسين إلى الخلايا ، وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 3-5 دقائق تقريبا لإكمال انفصال الخلية.
  10. بعد ذلك ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة ، وأضف 6 مل من وسط الثقافة إلى قارورة الثقافة ، وانقل هذا المحلول إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي بوزن 290 جم لمدة 5 دقائق.
  11. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا جيدا في 1 مل من وسط الثقافة الكامل.
  12. أخيرا ، عد الخلايا باستخدام غرفة عد Neubauer. امزج 20 ميكرولتر من الخلايا و 20 ميكرولتر من التريبان الأزرق ، وأضف 10 ميكرولتر من هذا الخليط إلى غرفة نيوباور. عد الخلايا الحية التي لا تلطخ باللون الأزرق.
  13. اللوحة 5 × 104 خلايا / مل في طبق بتري (35/10 مم) على نفس وسط الثقافة الموصوف من قبل. استخدم الحجم الإجمالي البالغ 1 مل لكل طبق.
  14. ثم انتظر لمدة 24 ساعة لبدء بروتوكول التمايز العصبي. لذلك ، قم بإزالة وسط المزرعة واستبدله ب 1 مل من DMEM / F12 مكملا بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 2٪ ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، و 10 ميكرومتر حمض الريتينويك المتحول بالكامل (RA 10 ميكرومتر).
  15. انتظر لمدة 48 ساعة واستبدل وسط الاستزراع كل يوم لمدة 3 أيام. ضع الخلايا في حاضنة في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
  16. في اليوم الخامس ، قم بإزالة الوسط من الخلايا وأضف 1 مل من وسط الثقافة الخالي من المصل المكملة بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ البشري (BDNF 50 نانوغرام / مل) في كل طبق.
    ملاحظة: تم اختبار BDNF من شركات مختلفة (انظر جدول المواد). لقد عملوا جميعا بنفس الطريقة.
  17. في اليوم السابع من التمايز ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المعقم مرة واحدة واستخدم الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية للتجارب. إذا كان من المستحيل استخدام هذه الخلايا على الفور للتجارب ، فأضف وسيطا خاليا من المصل لإبقائها على قيد الحياة حتى الاستخدام.
    ملاحظة: في نهاية التمايز العصبي ، من الضروري غسل الخلايا باستخدام PBS المعقم لإزالة BDNF المتبقي ، وتجنب سمية الخلايا.

2. الكولاجين السكري وعملية الجليكيشن

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات الواردة في هذا القسم تحت غطاء التدفق الصفحي ، ويجب أن تكون جميع المحاليل والمستلزمات معقمة.

  1. تحضير جليكاسیون الكولاجين عن طريق احتضان الكولاجين من النوع الأول من الحالة الليفية لذيل الفئران (3.89 مجم / مل) مع 200 ملي مولار د-ريبوز ، و 160 ملي مولار د-جلوكوز ، و 200 ملي مولار D-threose عند 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام.
    ملاحظة: لتحضير الكولاجين السكري ، قم بوزن السكريات بناء على وزنها الجزيئي واخلطها مع الكولاجين من النوع الأول من الحالة الليفية لذيل الفئران (3.89 مجم / مل).
  2. احتضان زراعة الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية لمدة 24 ساعة باستخدام مصفوفة الكولاجين السكري خارج الخلية (ECM-GC ، 100 ميكروغرام / مل) أو مصفوفة الكولاجين الطبيعية خارج الخلية (ECM-NC ، 100 ميكروغرام / مل) المحضرة في وسط مزرعة DMEM / F12 بدون مكملات المصل والمضادات الحيوية.

3. فحص تدفق الكالسيوم

  1. لتدفق الكالسيوم ، استخدم مجموعة فحص تدفق الكالسيوم وقم بإعداد المحاليل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، كما هو موضح أدناه.
  2. في البداية ، قم بإعداد 1 مل من تحميل الصبغة Fluo-8 عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من محلول مخزون Fluo-8 في 998 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص 1x (مزيج من المخزن المؤقت HBSS و 10x Pluronic F127 Plus.
    ملاحظة: حل العمل هذا مستقر لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. في وقت لاحق ، احتضان 250 ميكرولتر من هذا المحلول في كل طبق مطلي من الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية التي تم تمييزها ومعالجتها مسبقا باستخدام ECM-NC أو ECM-GC لمدة 30 دقيقة في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية. ثم أخرج الطبق من الحاضنة واحتفظ به في RT (في الظلام) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يصبح هذا المحلول ساما للخلايا إذا تم استقراء حضانة 2 ساعة. تحضير محلول الكابسيسين خلال فترة الحضانة.

4. تحريض الكابسيسين

ملاحظة: الكابسيسين ، ناهض TRPV1 ، تم استخدامه للحث على تدفق الكالسيوم في الخلايا.

  1. قم بوزن وتخفيف الكابسيسين في 1٪ إيثانول وماء عالي النقاء. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول بتركيز 2 ميكرومتر ، والذي تم تخفيفه أيضا في ماء عالي النقاء.
    ملاحظة: يجب صنع محلول الكابسيسين في يوم الاستخدام. تخفيف الكابسيسين أولا في الإيثانول ثم في الماء. خلاف ذلك ، سوف يسرع.
  2. أضف 250 ميكرولتر من محلول الكابسيسين 2 ميكرومتر إلى كل طبق بتري 35/10 مم بحيث يكون التركيز النهائي 1 ميكرومتر.
    ملاحظة: كان تركيز محلول المخزون من الكابسيسين 2 ميكرومتر لضمان تشتت أفضل وتجنب قمم التألق المعزولة.

5. تصوير تدفق الكالسيوم وتحليل المجهر متحد البؤر

ملاحظة: تم إجراء التصوير في مجهر متحد البؤر مجهز بهدف 20x / 0.75NA وليزر إثارة 488 نانومتر (كثافة 0.5٪). تم الكشف عن الانبعاث عند 520 نانومتر. تم مسح الخلايا ضوئيا في محاور xy (512 × 512 بكسل) بمرور الوقت (t) بسرعة 600 هرتز مع فاصل اكتساب يبلغ 433 مللي ثانية ووقت اكتساب إجمالي قدره 5 دقائق. تم إجراء التصوير عند 37 درجة مئوية للحفاظ على الحالة الفسيولوجية للخلايا باستخدام برنامج الفحص المجهري.

  1. قم بإعداد حقنة تحتوي على 250 ميكرولتر من محلول الكابسيسين 2 ميكرومتر (سيكون التركيز النهائي في اللوحة 1 ميكرومتر) وقم بتوصيلها بمجموعة أوريد فروة الرأس - نوع الفراشة 23 GA معقمة. قم بتأمين المحقنة باستخدام حامل مختبر ومشبك.
  2. ضع طبق بتري على مرحلة المجهر ، وحذر شديد ، ضع إبرة فروة الرأس في طبق بتري ، وتجنب ملامسة القاع ، ولا ينبغي غمر طرف الإبرة في السائل.
    ملاحظة: يمكن استخدام شريط لاصق لإصلاح وضع فروة الرأس.
  3. ابحث عن حقل به عدد كاف من الخلايا (أكثر من 20) واضبط التركيز باستخدام ضوء المجال الساطع.
  4. ابدأ الوضع المباشر بليزر 488 نانومتر واضبط معلمات التركيز والإضاءة.
  5. ابدأ تسجيل الاستحواذ ، وبعد فترة خط الأساس (t = 0 إلى t = 60 ثانية) ، ضع 250 ميكرولتر من 2 ميكرومتر كبسيسين وادفع مكبس المحقنة برفق لتحفيز تدفق الكالسيوم إلى الخلايا.
    ملاحظة: كان وقت الحصول على التسجيل النهائي حوالي 300 ثانية لكل لوحة.

6. المعالجة اللاحقة / تحليل البيانات

  1. قم بإجراء تحليل الخلية باستخدام برنامج الفحص المجهري في وضع القياس الكمي . أولا ، قم بتحليل خلايا سبايك الفلورية قبل وبعد حافز الكابسيسين.
  2. قم بإنشاء منطقة اهتمام (ROI) في كل خلية سريعة الاستجابة ، أي الخلايا التي تعرض ارتفاعا مضان بعد الكابسيسين. تأكد من رسم عائد الاستثمار في منطقة الخلية بأكملها ، كما هو موضح أعلاه (الشكل 1).
  3. تصدير البيانات في ملف قيم مفصولة بفواصل (CSV) لتحليلها لاحقا.
  4. وبدلا من ذلك، يجري التحليل باستخدام البرمجيات المتاحة مجانا FIJI7 (https://fiji.sc).
    1. لفتح ملفات الصور ، استخدم المكون الإضافي Bio-Formats بالانتقال إلى File > Import > Bio-Formats وتحديد الملف.
  5. بعد ذلك ، استخدم أداة العدسة المكبرة للتكبير وأداة التحديد اليدوي لرسم منطقة الاهتمام (ROI) حول الخلايا المستجيبة.
  6. بعد رسم كل عائد استثمار ، اضغط على مفتاح T لإضافته إلى مدير عائد الاستثمار. كرر هذه العملية لجميع الخلايا ذات الأهمية (الشكل 2).
  7. بمجرد إضافة جميع عائد الاستثمار، انتقل إلى نافذة مدير العائد على الاستثمار، وحدد جميع عائد الاستثمار، ثم انتقل إلى تحليل > تعيين القياسات في القائمة الرئيسية.
  8. بعد ذلك، ارجع إلى مدير عائد الاستثمار وحدد المزيد > القياس المتعدد لقياس الكثافة عبر جميع الإطارات. ستظهر النتائج في نافذة جديدة ؛ قم بالتصدير كملف CSV بالانتقال إلى ملف > حفظ باسم.
    ملاحظة: يمكن تحليل ملف CSV في برنامج Excel وجداول بيانات Google وGraphPad. استخدم المعادلة ΔF / F0 = (F (t) - F0) / F0 لتحويل قيم شدة التألق التي تم الحصول عليها باستخدام مجموعة Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit إلى مقياس نسبي لتغير تدفق الكالسيوم. هنا ، يمثل F0 التألق الأساسي ، محسوبا على أنه متوسط الكثافة من الصور الملتقطة من t = 0 s إلى t = 60 ثانية قبل التحفيز بالكابسيسين. F (t) هي قيمة الحد الأقصى لشدة التألق التي لوحظت بعد التحفيز ، مما يسمح بتقييم ذروة تدفق الكالسيوم. يسلط هذا النهج الضوء على الزيادة في التألق بالنسبة لخط الأساس ، حيث يشير الارتفاع في ΔF / F0 إلى ارتفاع مستوى الكالسيوم داخل الخلايا.

figure-protocol-1
الشكل 1: مثال على عائد الاستثمار في الخلايا المحددة لتحليل تدفق الكالسيوم في برنامج LAS X. (أ) واجهة LAS X في وضع القياس الكمي. يظهر المستطيل الوردي علامة تبويب القياس الكمي. يظهر المستطيل الأصفر أداة الرسم متعدد الخطوط ، ويظهر المستطيل السماوي أدوات التصغير والتكبير. (ب) مجال الرؤية (FOV) الذي تم التقاطه. (ج) تكبير مجال الرؤية لتسهيل رسم عائد الاستثمار في الخلية بأكملها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الشكل 2: مثال على عائد الاستثمار في الخلايا المختارة لتحليل تدفق الكالسيوم في برمجيات فيجي. (أ) واجهة فيجي توضح القائمة الرئيسية والأداة. يظهر المربع الأحمر أداة العدسة المكبرة، ويظهر المربع الأخضر تحديد اليد الحرة. (ب) مجال الرؤية (FOV) الذي تم التقاطه مع التكبير وعائد الاستثمار المرسوم. (ج) نافذة مدير العائد على الاستثمار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  1. إذا كانت الصورة خارج نطاق التركيز البؤري، فجرب ما يلي:
    1. تحقق من التصاق الشريط ؛ إذا تم فكها ، فقد يتسبب ذلك في تحول الإبرة والتأثير على التركيز.
    2. أعد توصيل الإبرة بشريط إضافي لزيادة الاستقرار.
    3. استبدال الإبر القياسية. استخدم أطراف إبرة الأسنان المثنية مسبقا لتحسين المحاذاة على اللوحة.
  2. إذا كانت الخلايا تعرض إشارة مشبعة، فجرب الخطوات التالية:
    1. تقليل كثافة الليزر وإعدادات الكسب.
    2. تحقق من وقت حضانة الكاشف. إذا تجاوز توصية الشركة المصنعة ، فقد يؤدي ذلك إلى تشبع الإشارة ، مما يعقد اكتشاف تدفق الكالسيوم.
  3. اتبع هذه الاقتراحات الإضافية لتحري الخلل وإصلاحه:
    1. المعايرة المنتظمة: تأكد من معايرة معدات التصوير بانتظام للحفاظ على جودة التركيز واكتشاف الإشارة.
    2. تغييرات المستند: احتفظ بسجل لأي تعديلات تم إجراؤها على البروتوكول للرجوع إليها في المستقبل ولتسهيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
    3. التعديلات التفاعلية: إذا استمرت المشكلات ، ففكر في الاختبار بتركيزات كاشف مختلفة أو طرق بديلة لاكتشاف الإشارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تمايز خلايا SH-SY5Y إلى خلايا عصبية شبيهة بالحس
تظهر صور الفحص عالية المحتوى أن بروتوكول التمايز العصبي يغير مورفولوجيا الخلية SH-SY5Y. تعرض الخلايا العصبية الشبيهة بالحسية (الخلايا المتمايزة) جسما خلويا مستديرا يعرض شبكة واسعة من الخيوط العصبية. إنها تشكل فروعا من إسقاطات عصبية أكثر استطالة تربط الخلايا العصبية المحيطة ، وهو ما يتوافق مع ميزات الخلايا العصبية الناضجة (الشكل 3) 4. الأهم من ذلك ، أن هذه الخلايا تعرض مستويات متزايدة من TRPV1 عند مقار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مستقبلات الألم هي مجموعات فرعية متخصصة من الخلايا العصبية الحسية التي تتوسط الألم. تعبر هذه الخلايا عن قنوات أيونات الجهد والترابط ، مثل TRPV1 ، التي يؤدي تنشيطها إلى تدفق الكالسيوم وإطلاق الببتيدات العصبية والناقلات العصبية التي تنظم انتقال الألم. هنا ، نصف بروتوكولا لتفريق SH-SY5Y إلى خلايا عصبية شبيهة بالحسية لتقييم تدفق الكالسيوم الناجم عن الكابسيسين8،9. الأهم من ذلك ، أظهرنا أنه بمحاكاة بيئة مؤيدة للألم مع الكولاجين السكري ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تمتلك MCB و AMCT و VOZ براءة اختراع في عملية تحديد الكيانات الجزيئية المتورطة في آلام هشاشة العظام (BR102018008561-1).

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Grant رقم 2015/50040-4 و 2020/13139-0, مؤسسة ساو باولو للأبحاث و GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 و 2024/04023-0.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الريتينويك المتحولةبالكامل توكرس695
BDNFTocrisTOCR-2837
BDNFSigma-AldrichB3795
نوع الفراشة 23GA معقمبيكتون ديكنسون أسيبتو38833814مجموعة وريد فروة الرأس
كابسيسينسيجما ألدريتشM2028
D-glucoseSigma-AldrichG5767
DMEM / F12Gibco12500062القاعدية المتوسطة
D-riboseSigma-AldrichR7500
D-threoseSigma-AldrichT7392
Fluo-8 Calcium Flux Assay KitAbcamab112129No wash
مصل الأبقار الجنين المعطل بالحرارةGibcoA5670801
محتوى عال الفحص الأجهزة الجزيئية برنامج
Microsystemsبرنامج الفحص المجهري
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsLeica TCS SP8مجهر متحد البؤر
بنسلين ستربتومايسينجيبكو15140130
طبق بتري (35/10 مم)Greiner bio-oneذيل 627965
الفئران من النوع الأول الكولاجينCorning354236
SH-SY5Yميرك94030304-1VLخط خلايا الورم الأرومي العصبي
LASX Leica

المراجع

  1. Bierhaus, A., et al. Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products. J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).
  2. Hudson, B. I., et al. Blockade of receptor for advanced glycation endproducts: A new target for therapeutic intervention in diabetic complications and inflammatory disorders. Arch Biochem Biophys. 419 (1), 80-88 (2003).
  3. Dandia, H., Makkad, K., Tayalia, P. Glycated collagen - a 3D matrix system to study pathological cell behavior. Biomater Sci. 7 (8), 3480-3488 (2019).
  4. Bufalo, M. C., et al. Human sensory neuron-like cells and glycated collagen matrix as a model for the screening of analgesic compounds. Cells. 11 (2), 247(2022).
  5. Frias, B., Merighi, A. Capsaicin, nociception and pain. Molecules. 21 (6), 797(2016).
  6. Lam, D., et al. RAGE-dependent potentiation of TRPV1 currents in sensory neurons exposed to high glucose. PLoS One. 13 (2), e0193312(2018).
  7. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  8. Li, F., et al. TRPV1 activity and substance P release are required for corneal cold nociception. Nat Commun. 10 (1), 5678(2019).
  9. Mickle, A. D., Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Sensory TRP channels:the key transducers of nociception and pain. Prog Mol Biol Transl Sci. 131, 73-118 (2015).
  10. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  11. Vetter, I., et al. Characterisation of Nav types endogenously expressed in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. Biochem Pharmacol. 83 (11), 1562-1571 (2012).
  12. Dekker, L. V., et al. Analysis of human Nav1.8 expressed in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Eur J Pharmacol. 528 (1-3), 52-58 (2005).
  13. Lam, P. M. W., Hainsworth, A. H., Smith, G. D., Owen, D. E., Davies, J., Lambert, D. G. Activation of recombinant human TRPV1 receptors expressed in SH-SY5Y human neuroblastoma cells increases [Ca2+]i initiates neurotransmitter release and promotes delayed cell death. J Neurochem. 102 (3), 801-811 (2007).
  14. Koplas, P. A., Rosenberg, R. L., Oxford, G. S. The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurosci. 17 (10), 3525-3537 (1997).
  15. Tominaga, M., et al. The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron. 21 (3), 531-543 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TRPV1 Fluo 8 confocal SH SY5Y
تعمل المنتجات النهائية المتقدمة للجليكاسیون على توعية الخلايا العصبية البشرية الشبيهة بالحسية لتدفق الكالسيوم الناجم عن الكابسيسين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.