مقالة منهجية

الطفرات شبه العشوائية المحفزة للضوء الأزرق على الحمض النووي الخارجي المحدد في سلالة الإشريكية القولونية BL21

DOI:

10.3791/68283

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الموضح طرقا مبسطة للتعرف على أي حمض نووي خارجي مع توليد طفرات فقط على تلك الحمض النووي الخارجي في الإشريكية القولونية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام تقنيات الطفرات على نطاق واسع في تربية التباين والتطور الموجه وهندسة البروتين. ومع ذلك ، يمكن لمعظم الطرق فقط إحداث طفرات عشوائية في الحمض النووي الجيني لا يمكن السيطرة عليها ، مما يؤدي إلى تشوهات أو حتى تأثيرات مميتة. هنا ، من خلال الاستفادة من اندماج ثلاثة أنظمة: محرر قاعدة السيتوزين (CBE) ، وعناصر p-Mag / n-Mag المحفزة للضوء الأزرق ، وتقسيم T7 RNA polymerase ، تشتمل هذه الطريقة الموضحة على نظام طفرات شبه عشوائي يمكن التحكم فيه بالضوء الأزرق ، وخاص بمنطقة الحمض النووي ، وشبه عشوائي.

يمكن لهذا النظام أن يتحور السيتوزين إلى الثايمين على الحمض النووي بدءا من محفز T7 وينتهي بفاصل T7. يمكن أن يتحور أي جين خارجي في اتجاه مجرى مروج T7. تم تصميم هذه الأدوات أيضا في جزأين لجعل النظام يمكن التحكم فيه بالضوء الأزرق. تم إنشاء الجزء الأول عن طريق دمج CBE مع n-Mag وجين بوليميراز N-terminal-T7 RNA. تضمن الجزء الثاني دمج p-Mag مع بوليميراز الحمض النووي الريبي C-terminal-T7. تحت الضوء الأزرق ، تم تجميع هذين الجزأين ليعملوا كمولد طفرات على الحمض النووي بين محفز T7 وفاصل T7. بدون الضوء الأزرق ، يتم فصل p-Mag عن n-Mag ، مما يؤدي إلى تحرير CBE من تحرير الحمض النووي.

الهدف من هذا البروتوكول هو توليد طفرات عشوائية خاصة بالمنطقة في الإشريكية القولونية مع التحكم في الضوء الأزرق والتحقق من صحة البلازميدات المتحولة. يمكن تكييف النظام مع نظام تطور في الجسم الحي حيث يمكن اختيار وظيفة الجين المعني ، ويمكن جمع الطفرات المطلوبة لمزيد من الدراسة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرة العشوائية والانتقاء الطبيعي هي القوى الرئيسية التي تدفع التطور ، والتي ولدت تباينا جينيا كبيرا عبر الأنواع. تم استخدام العملية التطورية كأداة قوية لهندسة البروتينات ذات الوظائف المحسنة أو الجديدة1. قدرت معدلات الطفرات الطبيعية من تكرار الحمض النووي بحوالي واحد من كل 109 قواعد لكل انقسام خلوي في بدائيات النوى المتعددة وحقيقيات النوى2. معدلات الطفرات الطبيعية المنخفضة تجعل من غير العملي توليد تنوع جيني كبير في المختبرات. ركزت الدراسات على تطوير طرق تزيد من معدلات الطفرات لتغطية أكبر عدد ممكن من المواقع في جين معين في غضون فترة زمنية معقولة.

تم تطوير أنظمة متعددة لتحقيق معدلات طفرات أعلى في دراسات التطورالمختبري 3،4،5،6،7،8،9،10. تستفيد أنظمة التطور في المختبر من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المعرض للخطأ ، أو طفرات التشبع الموجه للموقع ، أو تصميم المكتبة الحسابية لإدخال طفرات في الجينات ذات الأهمية1. يتم تحويل مكتبات الحمض النووي إلى خلايا مضيفة حيث يتم فحص منتجات البروتين أو اختيارها. لا تقترن خطوات الطفرات والاختيار في التطور المختبري ، مما يحد من كفاءة وحجم السكان الذين يمكن إنشاؤهم11. تغلبت أنظمة التطور في الجسم الحي على القيود من خلال إدخال أنظمة الطفرات في الخلايا وإقران الطفرات وخطوات الاختيار لتمكين التطور المستمر. في وقت سابق في الطفرات في الجسم الحي ، استخدمت طرق الطفرات الكيميائية3،4 والسلالات المطفرة5،6. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تعاني من معدلات طفرات منخفضة ، ونقص في السيطرة ، وطيف طفري ضيق أو غير متساو12. طورت الدراسات الحديثة أنظمة تطور جديدة ومحسنة في الجسم الحي ، ممثلة في OrthoRep ، وهو نظام تكرار الحمض النووي المتعامد المعرض للخطأ7،8 ؛ MutaT7 ، اندماج سيتيدين ديميناز إلى بوليميراز T7 RNA9 ؛ و EvolvR ، اندماج نيكاز Cas9 إلى بوليميراز الحمض النوويالمعرض للخطأ 10. تحتوي هذه الطرق على خلايا مضيفة مختلفة وسياق مستهدف وسهولة التنفيذ.

T7 RNA polymerase (T7 RNAP) ، وهو مكون رئيسي لنظام MutaT7 ، تمت دراسته وهندستته على نطاق واسع في مجال البيولوجيا التركيبية. تم التعبير عن أجزاء T7 RNAP بشكل مشترك على مستويات مختلفة في نقاط زمنية مختلفة لبناء مخصص موارد13. تم بناء T7 RNAP مقسم مع شظايا طرفية C ذات خصوصية مختلفة من المروج لإنشاء بوابة منطقيةAND 14. أدت قدرة شظايا T7 RNAP على التجميع لإعادة تكوين بوليميراز وظيفي إلى تطوير أجهزة استشعار حيوية منشطة بالضوء والجزيء الصغير حيث يؤدي تثمير شركاء التفاعل المدمجين في كل من المحطات N و C ل T7 RNAP إلى توليد ناتج النسخ15. تم أيضا دمج T7 RNAP المنقسم في مجالات n-Mag و p-Mag لبناء التحكم في التعبير الجيني المحفز للضوء في الإشريكيةالقولونية 16. عند تنشيط الضوء الأزرق ، تتضاءل مجالات Magnet ، مما يجعل مجالين من T7 RNAP المنقسم قريبا مكانيا لتنفيذ وظيفة البوليميراز. يتيح هذا النظام التحكم الدقيق في التعبير الجيني الزماني المكاني مع التعبير القاعدي المنخفض والنطاق الديناميكي الكبير.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لبناء نظام طفرات شبه عشوائي يمكن التحكم فيه بالضوء الأزرق ، في الجسم الحي (الشكل 1). إنه مبني على rAPOBEC1 deaminase المدمجة في n-Mag-N-T7 RNAP. يتيح التعبير المشترك ل p-Mag-C-T7 RNAP من نفس البلازميد التحكم في الضوء الأزرق في البوليميراز وأنشطة تحرير القاعدة. يجمع النظام بين قدرة التحرير الأساسية ل rAPOBEC1 مع انقسام T7 RNAP الذي يتم التحكم فيه بالضوء. تم التحقق من صحته في الإشريكية القولونية باستخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كجين مستهدف حيث يتم تحديد شدته عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). بالمقارنة مع نظام MutaT7 الأصلي ، يقدم نظامنا الذي يتم التحكم فيه بالضوء الأزرق طفرات شبه عشوائية في الجين المستهدف عن طريق تعديل الفاصل الزمني للضوء. بدلا من تحويل جميع السيتوزين إلى قواعد اليوراسيل في الجين المستهدف ، فإنه يولد ملف تعريف طفرة أكبر عن طريق تحرير مجموعة فرعية من النيوكليوتيدات من خلال التحكم في الضوء. يمكن تكييف النظام بسهولة مع نظام التطور في الجسم الحي حيث يمكن استبدال GFP بجينات أخرى ذات أهمية ويمكن اختيار الوظيفة عن طريق لياقة الخلية أو البقاء على قيد الحياة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح البروتوكول التالي كيفية إجراء تصميم طفرات الحمض النووي الخارجية باستخدام نظام طفرات البوليميراز CBE-Mag-T7 (الخطوة 1). بمجرد إنشاء بلازميد الحمض النووي الخارجي ، يتم وصف خطوات تحويل البلازميدات للتعبير عن طفرات البوليميراز CBE-Mag-T7 في بكتريا قولونية سلالة BL21 عن طريق إضافة الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) متبوعا بالإشعاع بالضوء الأزرق لبدء الطفرات (الخطوات 2-9.2). تم تنفيذ خطوات مراقبة الجودة لتقييم عدد الطفرات التي تم إنشاؤها إما على GFP أو الحمض النووي الخارجي باستخدام تسلسل سانجر (الخطوات 9.3-11.2).

1. تصميم الحمض النووي الخارجي وبناء نظام طفرات البوليميراز CBE-Mag-T7

  1. ابحث عن تسلسل الحمض النووي الخارجي أو (كدنا) باستخدام الأدوات عبر الإنترنت (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene أو https://www.uniprot.org/).
    ملاحظة: هنا ، استخدمنا تسلسل GFP كحمض نووي خارجي للطفرات السيتوزين.
  2. استبدل الحمض النووي gfp بالحمض النووي المعني باستخدام مجموعة استنساخ مناسبة.
    ملاحظة: نستخدم NheI لإزالة الحمض النووي gfp في البلازميد الأصلي في مجموعة تجميع مستعمرة الحمض النووي. البديل هو العمل مع الشركات من أجل تخليق الحمض النووي. انظر الملف التكميلي 1 لتسلسل البلازميد.
  3. قم بتجميع جميع الجينات مع نظام طفرات البوليميراز CBE-Mag-T7 ودمجها في العمود الفقري pET-11a مع مقاومة الأمبيسلين.
    ملاحظة: لقد عملنا مع شركة تخليق الحمض النووي لبناء هذا البلازميد ، وحصلنا على بكتيريا مخزون الجلسرين التي تحتوي على البلازميد المستهدف.

2. تنشيط سلالة البكتيرية

  1. ماصة 10 ميكرولتر من بكتيريا مخزون الجلسرين على حافة صفيحة أجار LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. قم بربط البكتيريا من هذه البقعة عبر اللوحة باستخدام حلقة معقمة.
  2. احتضان اللوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية طوال الليل في حاضنة بكتيرية.

3. تضخيم البلازميد

  1. اختر مستعمرة واحدة من اللوحة وقم بتلقيحها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 15 مل من وسط LB يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
  2. ضع المزرعة في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة لمدة 14-16 ساعة.

4. استخراج البلازميد

  1. خذ 5-15 مل من المزرعة البكتيرية طوال الليل وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي. جهاز طرد مركزي عند 18,894 × جم لمدة 1 دقيقة.
  2. اجمع الحبيبات البكتيرية وقم بإزالة كل المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 500 ميكرولتر من عازلة إعادة التعليق عن طريق الدوامة أو سحب العينات.
  3. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل إلى الأنبوب ، واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب 8-10x ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتحلل الخلايا.
    ملاحظة: تأكد من التحلل الكامل عن طريق التأكد من عدم وجود مادة ندفية بيضاء مرئية.
  4. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن إلى عمود الدوران الموجود في أنبوب التجميع. جهاز طرد مركزي عند 18,894 × جم لمدة دقيقتين وتخلص من التدفق. ضع العمود مرة أخرى في أنبوب التجميع.
  5. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحييد إلى المحللة البكتيرية ، واخلطها برفق عن طريق قلب الأنبوب 8-10x حتى يظهر راسب أبيض ، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. جهاز طرد مركزي عند 18,894 × جم لمدة 5 دقائق ، ونقل المادة الطافية إلى عمود مرشح. جهاز طرد مركزي عند 18،894 × جم لمدة 1 دقيقة لتصفية المحلول.
  7. أضف 0.3 ضعف حجم الأيزوبروبانول إلى المحلول المصفى ، واخلطه عن طريق العكس. انقل الخليط إلى عمود الدوران المتوازن.
  8. جهاز الطرد المركزي عند 18,894 × جم لمدة 1 دقيقة ، وتخلص من التدفق ، ثم ضع العمود مرة أخرى في أنبوب التجميع.
  9. اغسل العمود ب 750 ميكرولتر من محلول الغسيل ، وجهاز الطرد المركزي عند 18،894 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتخلص من التدفق.
  10. قم بالطرد المركزي للعمود مرة أخرى عند 18،894 × جم لمدة 1 دقيقة لإزالة عازلة الغسيل المتبقية.
  11. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي جديد. أضف 100-200 ميكرولتر من محلول الشطف إلى مركز غشاء العمود. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق وجهاز الطرد المركزي عند 18,894 × جم لمدة دقيقتين. قم بتخزين الحمض النووي البلازميد عند -20 درجة مئوية.

5. تحويل البلازميد (بكتريا قولونية BL21 خلايا مختصة كيميائيا)

  1. خذ 50 ميكرولتر من خلايا BL21 المذابة المختصة كيميائيا على الجليد. أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد من الخطوة 4.11 واخلطها برفق. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  2. صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ثم انقل الأنبوب على الفور إلى الجليد لمدة دقيقتين.
  3. أضف 500 ميكرولتر من وسط LB المعقم إلى كل أنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة للسماح بالاسترداد.
  4. جهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية الزائدة ، مع ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر. احتضن رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

6. التعبير عن مولد طفرة البوليميراز CBE-Mag-T7 (شكل غير نشط)

  1. اتبع الخطوات 5.1-5.4. قبل نشر الخلايا ، قم بتطبيق 1 ملي مولار IPTG بشكل موحد على سطح أجار LB مع الأمبيسلين. استخدم الماء منزوع الأيونات كعنصر تحكم للمقارنة مع المجموعات المعالجة ب IPTG.
  2. بعد زراعة جميع المستعمرات ، اختر 10-20 مستعمرة للاستزراع في 5 مل من وسط LB الذي يحتوي على 1 ملي مولار IPTG في 100 مل أنابيب زجاجية مستديرة القاع مع غطاء لولبي فينولي وبطانة مطاطية عند 16 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات.
    ملاحظة: يمكن تخزين جميع المستعمرات عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل قبل الانتقال إلى الخطوة 7.

7. قم بتنشيط مولد طفرة البوليميراز CBE-Mag-T7

  1. اجمع البكتيريا في أنابيب زجاجية مستديرة القاع سعة 100 مل مع غطاء لولبي فينولي وبطانة مطاطية وأجهزة طرد مركزي عند 18,894 × جم لمدة دقيقتين.
  2. قم بتغيير الوسيط إلى LB المتوسط بدون أي IPTG.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للتأكد من أن مولد طفرة البوليميراز CBE-Mag-T7 لا يمكنه تحرير نفسه. لقد صممنا نظام lacI / O لحماية مجموعات جينات البوليميراز CBE-Mag-T7.
  3. قم بتشعيع اللوحة بجهاز مشع واحد بالضوء الأزرق (470 نانومتر ، 4 ميجاوات / سم2) أثناء الزراعة عند 37 درجة مئوية للوقت المحدد مسبقا. قم بإجراء تسلسل Sanger للتحقق من الطفرات والتحقق مما إذا كان التعرض الأطول يزيد من تكرار الطفرات.
    ملاحظة: هنا ، قمنا بتعيين التعرض للضوء الأزرق لمدة 0 و 8 و 16 و 24 ساعة.

8. اختيار الطفرات لزيادة وظيفة البروتين واستمرار الطفرات

ملاحظة: هنا ، نستخدم جين gfp كحمض نووي خارجي للطفرات ونبحث عن طفرات يمكن أن تعزز كثافة الفلورسنت لبروتين GFP.

  1. اختر المستعمرات ، وقم بتسمية الموضع على طبق ، وقم بتلقيح المستعمرات المجمعة في 100 ميكرولتر من ddH2O.
  2. انقل 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى لوحة 96 بئرا واقرأ شدة GFP عند Ex / Em = 488/510 نانومتر.
  3. كرر الخطوات من 6.3 إلى 9.2 حتى يمكن تحديد بعض المستعمرات الواضحة.

9. أوقف الطفرات وتحقق من الطفرات

  1. بعد إجراء عدة ساعات من التشعيع بالضوء الأزرق ، انقل جميع البكتيريا إلى مكان مظلم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى.
  2. اتبع نفس خطوات استخراج البلازميد كما هو موضح في الخطوة 4.
  3. صمم البادئات الأمامية والخلفية لتسلسل Sanger.
    ملاحظة: هنا ، نستخدم ATGGTGAGCAAGGGCGAGGCTGT كأساس أمامي و TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG كأساس عكسي لتسلسل Sanger.

10. تحليل البيانات وحساب تكرار الطفرات

  1. اعرض الطفرة عن طريق فتح ملف .ab1 وتحقق من القمم يدويا.
  2. قم بتحليل تكرار الطفرات باستخدام أدوات عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، أداة Mutation Surveyor).
  3. قم بتحميل ملف بيانات Sanger إلى الأداة عبر الإنترنت وابدأ في تحليل معدل الطفرة.

11. تحضير مخزون الجلسرين البكتيري

  1. تلقيح مستعمرة واحدة في أنبوب يحتوي على 5 مل من وسط LB مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  2. امزج المزرعة البكتيرية مع 50٪ جلسرين بنسبة 1: 1. Aliquot في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطرق الموضحة في هذا البروتوكول هي لإنشاء طفرات في الحمض النووي الخارجي باستخدام مولد طفرة بوليميراز الحمض النووي الريبي المقسم CBE-Mag-T7. يتم دمج الجينات اللازمة لبناء نظام طفرة بوليميراز الحمض النووي الريبي CBE-Mag-T7 والجين المستهدف للطفرات في العمود الفقري البلازميد pET-11a. تم إجراء التحول الناجح وتشعيع الضوء الأزرق دون أي ضرر للحمض النووي الجيني البكتيري ، كما هو موضح من خلال أرقام المستعمرات الطبيعية والمماثلة على LB-agar (الشكل 2).

تم الكشف عن طفرات في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء أداة تحرير القاعدة الموجهة بالبوليميراز لأول مرة بواسطة Cravens et al. في عام 2021 ، باستخدام استراتيجية اندماج البروتين17. تم دمج الطفرات في أربعة نيوكليوتيدات من الحمض النووي بنجاح بمعدلات أكبر من 10-4 طفرات لكل نقطة أساس. ومع ذلك ، نظرا لأنه تم إدخال الطفرات باستمرار بين T7 promotor و Terminator دون تحكم إضافي من قبل الباحثين18 ، لا يمكن الحفاظ على الطفرات "الجيدة" من التحرير المستمر. لمعالجة هذا القيد ، نقوم بدمج نظا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةصقرCLS352070
الأمبيسيلينالكيماويات العلمية الحراريةج60977.14
مشع الضوء الأزرقThorlabsLIU470A
طقم استنساخ تجميع الحمض النووي   ؛نيبE5520S
تخليق الحمض النووي / Prmersعلم الجينوم BGI
EndoFree Plasmid Midi Kit   ؛سي دبليو بيوCW2106Sالمخزن المؤقت P1: المخزن المؤقت لإعادة التعليق ، المخزن المؤقت P2: المخزن المؤقت للتحلل ، المخزن المؤقت E3: المخزن المؤقت للتوازن ، المخزن المؤقت PS: المخزن المؤقت للتحييد ، المخزن المؤقت PW: المخزن المؤقت للغسيل ، المخزن المؤقت الخالي من Endo-Free EB: المخزن المؤقت لتنقية الحمض النووي ، RNase A Endo-Remover FM: المخزن المؤقت لإزالة السموم الداخلية ، أعمدة الدوران DM مع أنابيب التجميع
الجلسرينفيشر للكيماوياتجي 33-4
شاكر محضنثيرمو ساينتفيكSK2001CPKG
IPTG (الأيزوبروبيلثيو - وبيتا ؛ - جالاكتوسيد)إنفيتروجين15529019
قارئ الصفيحة الصغيرةثيرمو ساينتفيكفاريوسكان لوكس
مجهر لايكاماركة ماركة 4000B
مولتيسكان لكرة القدمالكيماويات العلمية الحرارية
طلقة واحدة BL21 (DE3) بكتريا قولونية مختصة كيميائياإنفيتروجينC600003
طقم تنقية البلازميد Midi السريع منخفض السموم الداخلية PureLinkإنفيتروجينطائرة A36227
بيركس  أنابيب طرد مركزي مستديرة للخدمة الشاقة ، مع غطاء لولبي فينولي وبطانة مطاطيةكورنينج  8422CLS8422100

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
  2. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
  3. Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T. A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments. Science. 229 (4710), 242-247 (1985).
  4. Lai, Y. P., Huang, J., Wang, L. F., Li, J., Wu, Z. R. A new approach to random mutagenesis in vitro. Biotechnol Bioeng. 86 (6), 622-627 (2004).
  5. Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B. An efficient random mutagenesis technique using an e. Coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385 (1996).
  6. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  7. Ravikumar, A., Arrieta, A., Liu, C. C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol. 10 (3), 175-177 (2014).
  8. Ravikumar, A., Arzumanyan, G. A., Obadi, M. K. A., Javanpour, A. A., Liu, C. C. Scalable, continuous evolution of genes at mutation rates above genomic error thresholds. Cell. 175 (7), 1946-1957.e13 (2018).
  9. Moore, C. L., Papa, L. J. 3rd, Shoulders, M. D. A processive protein chimera introduces mutations across defined DNA regions in vivo. J Am Chem Soc. 140 (37), 11560-11564 (2018).
  10. Halperin, S. O., et al. Crispr-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature. 560 (7717), 248-252 (2018).
  11. Molina, R. S., et al. In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers. 2, 37(2022).
  12. Badran, A. H., Liu, D. R. Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat Commun. 6, 8425(2015).
  13. Segall-Shapiro, T. H., Meyer, A. J., Ellington, A. D., Sontag, E. D., Voigt, C. A. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase. Mol Syst Biol. 10 (7), 742(2014).
  14. Shis, D. L., Bennett, M. R. Library of synthetic transcriptional and gates built with split T7 RNA polymerase mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5028-5033 (2013).
  15. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  16. Baumschlager, A., Aoki, S. K., Khammash, M. Dynamic blue light-inducible T7 RNA polymerases (Opto-T7RNAPS) for precise spatiotemporal gene expression control. ACS Synth Biol. 6 (11), 2157-2167 (2017).
  17. Cravens, A., Jamil, O. K., Kong, D., Sockolosky, J. T., Smolke, C. D. Polymerase-guided base editing enables in vivo mutagenesis and rapid protein engineering. Nat Commun. 12 (1), 1579(2021).
  18. Nayak, D., Siller, S., Guo, Q., Sousa, R. Mechanism of T7 RNAP pausing and termination at the T7 concatemer junction: A local change in transcription bubble structure drives a large change in transcription complex architecture. J Mol Biol. 376 (2), 541-553 (2008).
  19. Furuya, A., Kawano, F., Nakajima, T., Ueda, Y., Sato, M. Assembly domain-based optogenetic system for the efficient control of cellular signaling. ACS Synth Biol. 6 (6), 1086-1095 (2017).
  20. Dionisi, S., Piera, K., Baumschlager, A., Khammash, M. Implementation of a novel optogenetic tool in mammalian cells based on a split T7 RNA polymerase. ACS Synth Biol. 11 (8), 2650-2661 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

T7
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة