يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد ثقافات كروية بشرية طبيعية عائمة بحرية

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68440

⸱

يوليو 3, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cell Biology (Cancer Research), Medical Faculty, University of Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا وعمليا للغاية ولكنه موثوق به للزراعة الكروية المشتركة المباشرة للخلايا الظهارية الرائدة البشرية والخلايا الليفية دون الاعتماد على مصفوفة.

الملخص

أصبحت أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) شائعة بشكل متزايد نظرا لقدرتها على إعادة إنتاج خصائص الخلايا الطبيعية والبنى ، وبالتالي محاكاة الهياكل الشبيهة بالأنسجة في المختبر. من بين هذه النماذج ، تمثل ثقافة مجاميع الخلايا الكروية (ما يسمى بالكرويات) المضمنة في مصفوفة شبه صلبة خارج الخلية (ECM) نموذجا متقدما لثقافة الخلايا القريبة في الجسم الحي ، لأنها تسمح بحالات وظيفية مختلفة للخلايا نتيجة لتفاعلات الخلية والخلية والخلية ECM ، بالإضافة إلى تدرجات الأكسجين والمغذيات. نظرا لأن الكرات الكروية أقل تطلبا من الناحية الفنية وغير مكلفة نسبيا للحصول عليها ، فإنها تستخدم بشكل متكرر في فحص الأدوية واختبار السمية ، مما يتيح الفحص عالي المحتوى لاختبار أدوية جديدة في المرحلة قبل السريرية. لهذا الغرض ، يتم إعادة إنشاء الهياكل ثلاثية الأبعاد للأورام المختلفة في الغالب. في الوقت نفسه ، يعد Matrigel حاليا أحد أكثر أجهزة ECM استخداما ويعتبر المعيار الذهبي في الزراعة الكروية والعضوية ، على الرغم من أن هذه مصفوفة ثلاثية الأبعاد تعتمد على تجارب الفئران ، والتي يرتبط استخراجها - مثل التجارب على بشكل عام - بمخاوف أخلاقية كبيرة. هنا ، نقدم بروتوكولا خاليا من المصفوفة للزراعة الكروية المشتركة المباشرة للخلايا الظهارية القصبية البشرية والخلايا الليفية ، والتي يمكن اعتبارها طريقة زراعة مشتركة محسنة ، خاصة فيما يتعلق بالتواصل والتفاعلات بين الخلايا الليفية الظهارية داخل الكرويات المعنية ، دون الاعتماد على مصفوفة حاملة (قائمة على). من خلال إنشاء هذه الثقافات الكروية الظهارية الليفية العائمة بحرية كمنصة موجهة للمريض في المختبر لنمذجة سمية الأنسجة الطبيعية (الرئوية) للأساليب العلاجية للسرطان ، ليس فقط تقليل عدد التجارب ولكن أيضا يمكن تحقيق استبدال مناسب وهادف للتجارب المقابلة على.

المقدمة

تظل مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) ، حيث يتم زراعة الخلايا أحادية الطبقة المسطحة وتوسيعها ثم طلاءها لإجراء فحوصات البحث القائمة على الخلايا ، طريقة سهلة ومريحة وفعالة من حيث التكلفة ومستخدمة على نطاق واسع لإجراءات الفحص قبل السريرية القياسية1،2. لدراسة الحديث المتبادل التفاعلي (paracrine) بين أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر ، يمكن استخدام وسيط مكيف من نوع خلية لتحفيز نوع آخر من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، ظهرت طرق مختلفة للزراعة المشتركة ، على سبيل المثال ، طرق غير مباشرة ، عندما يتم فصل الخلايا المزروعة بشكل مشترك جسديا باستخدام غشاء صغير يسهل اختراقه. تشتمل "أنظمة Transwell" هذه على إدراج (الغشاء الصغير الذي يسهل اختراقه) يتم وضعه في لوحة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية. ثم يتم زرع نوع واحد من الخلايا وزراعته على الغشاء ، ويشترك في نفس الوسائط مثل النوع الآخر الذي ينمو على البئر المصاحب ، مما يسمح باتصالات باراكرين ثنائية الاتجاه2. قد يتم زرع نوعي الخلايا على جانبي الغشاء ، مما يشكل المزيد من ثقافة مشتركة مباشرة من خلية إلى خلية ، وهي مناسبة للتحقيق في الأنسجة ذات البنيةالحاجزية 3،4.

ومع ذلك ، فإن الاستجابات الخلوية لأنظمة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد المتقدمة هذه لا تعكس دائما نتائج التجارب المقابلة على وحتى الدراسات السريرية ، والتي ترجع ، من بين أمور أخرى ، إلى عدم وجود إشارات مباشرة بين أنواع الخلايا المختلفة وبالتالي عدم وجود منظمات خلوية شبيهة بالجسم الحي. لذلك ، أصبحت أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) شائعة بشكل متزايد بسبب قدرات خصائص الخلايا الشبيهة بالخلايا الطبيعية والبنى التي تحاكي الهياكل الشبيهة بالأنسجة في المختبر5،6. من بين هذه النماذج ، توفر ثقافة مجاميع الخلايا الكروية ، التي تسمى الكرات ، المضمنة في مصفوفات شبه صلبة خارج الخلية نموذجا أكثر تقدما للزراعة المشتركة للخلية حيث يمكن تحقيق حالات خلوية وظيفية مختلفة تتبع تفاعلات الخلية والخلية والخلية ECM بالإضافة إلى تدرجات الأكسجين والتغذية7. يجب إنشاء هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد المطلوبة الأكثر تعقيدا في الجسم الحي في المختبر والحفاظ عليها متجانسة فيما يتعلق بأحجام تجميع الخلايا مع تعزيز تطور الخلايا وتمايزها ، مع الحفاظ على كونها فعالة وسريعة ومتسقة ومريحة7،8.

باستخدام الخصائص الطبيعية للتجميع الذاتي والالتصاق ، عادة ما يتم إنشاء الكرات الكروية (بشكل أساسي الورم الكروي) باستخدام تقنية القطرة المعلقة9،10. كواحدة من أولى التقنيات المستخدمة لتوليد أجسام جنينية ، أصبح اختبار القطرة المعلقة طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتوليد العديد من الأجسام الكروية المتجانسة بناء على مبادئ الجاذبية والتوتر السطحي قبل تضمين ECM باستخدام Matrigel ، "المعيار الذهبي" للمصفوفات خارج الخلية ، على الرغم من كونه يعتمد على الفأر. تم بذل جهد كبير لتوليد كرويات في مناهج خالية من السقالات8،11. على سبيل المثال ، يمكن إنشاء الكرات باستخدام زجاجة زراعة الخلايا مع المحرض ، وبالتالي منع بذر الخلايا ، وهي أبسط طريقة لإنتاج الكرويات على نطاقواسع 12.

أصعب شيء في تعقيد مزارع الخلايا وبالتالي في إنشاء نظام ذو قيمة فسيولوجية كما هو الحال في بدائل المختبر الشبيهة بالجسم الحي في المختبر هي بروتوكولات معقدة مع العديد من الخطوات المختلفة (والتي لا تزال بحاجة إلى إنشائها). على سبيل المثال ، يعد إنشاء الهياكل الخلوية أولا باستخدام طريقة ، وحصادها ، ثم تضمينها في مصفوفة ، وخاصة استخدام المصفوفات التي ليس من السهل التعامل معها ، خطوات حاسمة تتطلب مزيدا من الإقناع قبل استخدام الطريقة بشكل روتيني وتسلسلي. استخدمنا هنا لوحة مرفق منخفضة للغاية بتنسيق 96 بئر ، والذي لا يسمح تقريبا بربط الخلية بأدوات الثقافة لإنشاء كرويات ثلاثية الأبعاد معقدة للخلايا الظهارية الرئوية والخلايا الليفية. تتشكل الكرويات الناتجة بشكل موحد للغاية وسريع إلى حد ما في غضون 24 ساعة ، مما يقصر الجدول الزمني التجريبي. يتم إجراء الزراعة المطولة ، وبالتالي نمو الخلايا الموثوق بها والتمايز في نفس البئر طوال الفترة بأكملها ، بحيث يجب استبدال الوسط فقط خلال فترة الزراعة بأكملها بعد الطلاء الأولي فقط. لذلك ، نقدم بروتوكولا بسيطا وسريعا وعمليا للغاية لتوليد كرويات الرئة البشرية التي تكرر شكليا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء بمستويات قريبة من الفسيولوجية. ميزة أخرى هي أنه يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع الخلايا الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة (خزانة السلامة الحيوية). للاطلاع على تركيبات الوسائط المستخدمة في هذه الدراسة ، راجع الجدول 1.

1. تحضير المواد التجريبية

  1. زراعة وتوسيع الخلايا الظهارية الرئوية الطبيعية للإنسان (HBEC3-KT) على أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية القياسية (قوارير T75) في وسط النمو الظهاري الطبيعي باستخدام حاضنة قياسية13 (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: لتحسين النمو ، يمكن استكمال الوسط أيضا بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS).
  2. زراعة الخلايا الليفية البشرية (HS-5) في RPMI Medium مكملة بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ والبنسلين / الستربتومايسين10،14 (انظر الجدول 1).
  3. تحضير وسط عضوي رئوي متفرع (BLO-Medium) عن طريق استكمال DMEM / F12 مع N-2 و B27 و البنسلين والستربتومايسين وألبومين مصل الأبقار و monothioglycerol وحمض الأسكوربيك و KGF / FGF7 و FGF10 و ATRA و CHIR99021. (انظر الجدول 1 وجدول المواد).
    ملاحظة: يوصى بتحضير الوسط طازجا ، على الأقل مع إضافة KGF / FGF7 و FGF10 و ATRA و CHIR99021. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الوسيط في غضون فترة زمنية قصيرة ، يوصى فقط بفترة تخزين قصيرة لبضعة أيام (حتى أسبوع واحد) عند 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام وسيط التمايز العضوي PneumaCult في مجرى الهواء المتاح تجاريا.

2. تحضير الخلايا الظهارية والخلايا الليفية

ملاحظة: استخدم كلا النوعين من الخلايا عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء. تحضير كل نوع خلية على حدة.

  1. قم بإزالة وسيط الثقافة والتخلص منه.
  2. اغسل الخلايا عن طريق شطف طبقة الخلية لفترة وجيزة باستخدام 5 مل من PBS.
  3. قم بإضافة 2 مل من 0.5٪ Trypsin-EDTA ، تليها حضانة قصيرة عند 37 درجة مئوية لمدة 4-8 دقائق.
  4. حصاد الخلايا المستديرة والمنفصلة تقريبا عن طريق إضافة وسائط نمو طبيعية أو PBS مكملة بنسبة 10٪ FCS باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل.
  5. قم برفع الحجم المناسب لأعلى ولأسفل عدة مرات في قارورة T75 (على طول سطح النمو) لفصل كتل الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل.
  6. حصاد الخلايا الليفية HS5 على التوالي باستخدام التربسين TE عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
  7. حبيبات كل نوع من أنواع الخلايا (وبالتالي خالية من التربسين) عن طريق الطرد المركزي (على سبيل المثال ، 300-400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة [RT]) وإعادة تعليقها (كل من الخلايا الظهارية والخلايا الليفية) في 1-2 مل من وسط النمو الظهاري الطبيعي قبل العد.
  8. تحديد أرقام الخلايا القابلة للحياة باستخدام حجم مناسب من الخلايا المعلقة ؛ تم تخفيف كل منها 1/5 باستخدام 0.4٪ Trypan Blue Stain في غرفة عد Neubauer تحت المجهر.

3. توليد الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد الخلايا الليفية الظهارية

  1. قم بتخفيف العدد المطلوب من الخلايا في وسط النمو الظهاري الطبيعي باستخدام أنبوب سعة 15 مل. احسب 2000 خلية ظهارية مع 50 الخلايا الليفية في 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من ألواح الآبار البالغ عددها 96 صحاحة. أعداد الخلايا الناتجة الكافية لصفيحة واحدة 96 بئر هي 200,000 خلية HBEC و 5,000 الخلايا الليفية HS5 في 10 مل من وسط النمو الظهاري الطبيعي.
  2. امزج برفق باستخدام ماصات مصلية معقمة سعة 10 مل.
  3. انقل تعليق الخلية إلى خزان كاشف معقم للحصول على ماصة دقيقة متعددة القنوات.
  4. قم بزرع الخلايا في لوحة توصيل منخفضة للغاية عن طريق نقل 100 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات (12 قناة).
  5. احتضان في ظل ظروف زراعة الخلايا القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في جو رطب.
    ملاحظة: يتم تقييم تكوين الكرة الكروية من خلال الفحص المجهري المنتظم باستخدام المجهر المقلوب وتصوير الكرويات لكل نقطة زمنية مرغوبة.
  6. بعد 4 أيام ، أضف 100 ميكرولتر من BLO-Medium لكل بئر إلى الكرويات المتولدة.
  7. احتضان أكثر في ظل ظروف زراعة الخلايا القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 في جو رطب.

4. إجراء تغيير منتظم للوسائط

  1. بعد 7-8 أيام ، قم بإجراء تغيير منتظم للوسائط. لذلك ، ضع اللوحة بزاوية طفيفة حتى تغرق الكرات في اتجاه الإمالة وفقا للجاذبية.
  2. قم بشفط المادة الطافية بعناية وبأفضل ما يمكن باستخدام طرف ماصة 100-200 ميكرولتر.
  3. أعد وضع اللوحة أفقيا واملأها ب 100-150 ميكرولتر من وسط BLO لكل بئر (باستخدام ماصة متعددة القنوات)
  4. احتضان أكثر في ظل ظروف زراعة الخلايا القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في جو رطب أو ابدأ تجربة / علاج.
    ملاحظة: يمكن استزراع الكرات لفترات أطول (تصل إلى 21 يوما). بعد ذلك ، يجب إجراء تغيير متوسط كامل مرتين على الأقل في الأسبوع.

5. التحليلات النهائية (حصاد الكرويات)

  1. قم بإجراء فحص وتوثيق مجهري منتظم عن طريق التقاط الصور مع قياسات الحجم الكروي وحسابات الحجم ، مما يسمح أخيرا بتحديد نمو الكروية وتغيرات النمو المحتملة بعد العلاجات.
  2. لتصوير الخلايا الحية في النقاط الزمنية المرغوبة ، احتضان الكرويات لمدة 15 دقيقة إضافية باستخدام 1 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 (أو DAPI) لتلوين النوى وتحليلها بواسطة المجهر الفلوري.
  3. قم بتجميع الكرويات في النقطة الزمنية المطلوبة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر مع قطع المخرج (يحافظ على معقمه) لزيادة القطر. لذلك ، استنشق الوسائط التي تحتوي على الكروية أيضا. اجمع وجمع الكرويات في أنبوب 2-5 مل. بعد 2-5 دقائق ، عندما تغرق الكرويات بسبب الجاذبية ، قم بإزالة المادة الطافية وانتقل إلى التحليل النهائي.
  4. لتوليد محللات البروتين الكروي الكامل ، أضف المخزن المؤقت للتحلل المثلج مباشرة (150 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP40 ، 0.5٪ صوديوم ديوكسيكولات ، 0.1٪ صوديوم دودسيل سلفات ، 50 مليمول / لتر تريس / حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8 ، مكملا بكوكتيل مثبط للبروتياز) إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكرويات المحصودة. بعد دورتين إلى ثلاث دورات من التجميد والذوبان ، حدد محتوى البروتين في المحللات وانتقل إلى التحليل النهائي ، على سبيل المثال ، تحليل اللطخة الغربية15.
  5. لتوليد محللات الحمض النووي الريبي الكروية الكاملة ، أضف المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكرويات المحصودة وقم بعزل الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة عزل الحمض النووي الريبي المعنية المستخدمة.
  6. بالنسبة للكيمياء المناعية (IHC) وتلوين التألق المناعي ، اتبع الخطوات 5.6.1-5.6.3.
    1. عالج الكرويات المحصودة ب 1-2 مل من محلول ملحي مخزن 4٪ من بارافورمالدهيد / فوسفات (PBS) لمدة 30 دقيقة ثم يخضع لاحقا لتضمين البارافين والتقطيع (3-5 ميكرومتر).
    2. قبل تلطيخ الفلورسنت المناعي ، قم بإعداد العينات باستخدام سلسلة تنازلية من الكحول والحضانة بمحلول استرجاع مستهدف. بعد ذلك ، قم بحظر الشرائح بمحلول مانع (2٪ مصل ماعز عادي / PBS) لتقليل التفاعلات غير المحددة واحتضان الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    3. الكشف عن المستضدات عن طريق الأجسام المضادة الثانوية المصنفة بالفلورسنت. نوى مضادة للبقع باستخدام DAPI. قم بإجراء تلطيخ إضافي (على سبيل المثال ، مجموعة تلطيخ PAS) وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة للتقييم النسيجي.
  7. بالنسبة للتعليق أحادي الخلية، اتبع الخطوتين 5.7.1 و 5.7.2.
    1. أعد تعليق الكرات الكروية المحصودة في 1-2 مل من TrypLE التي تحتوي على 100 وحدة / مل DNase I متبوعة بحضانة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أوقف الهضم عن طريق إضافة PBS الذي يحتوي على 2-5٪ FCS و 2 ملي مولار EDTA و DNAse I.
    2. قم بتمرير المحلول الخلوي عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي جديد قبل التحليل النهائي (على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي أو تحليل الخلية الواحدة).
  8. لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، اتبع الخطوات 5.8.1-5.8.3.
    1. قم بتسمية المعلقات المختلفة أحادية الخلية ذات الأهمية التي تمثل نقاطا زمنية أو علاجات مختلفة باستخدام مجموعة تعدد الإرسال أحادية الخلية (البشرية) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. اجمع العينات بعد ذلك وقم بتحميلها على ممر على خرطوشة أحادية الخلية تهدف إلى 10,000-40,000 خلية.
    3. استرجع الخلايا المفردة ، وقم بإجراء النسخ العكسي وإعداد المكتبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وتسلسل الحمض النووي الريبي المعزول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتيح هذا البروتوكول البسيط الزراعة الكروية المشتركة الخالية من المصفوفة للخلايا الظهارية القصبية البشرية والخلايا الليفية بالاشتراك مع ألواح التعلق المنخفضة للغاية (الشكل 1 أ). أثناء عملية الزراعة ، تتشكل كرويات الرئة الأكثر تعقيدا تدريجيا من الكرات الكروية التي تم إنشاؤها في البداية ، مع التوليد الفعال للهياكل الظهارية والخلايا الليفية المختلفة التي تمثل التفاعلات الخلوية المباشرة كما هو موضح من خلال التحليلات المورفولوجية باستخدام تصوير الخلايا الحية (الشكل 1 ب

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم اقتراح نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لسد الفجوة بين الثقافات ثنائية الأبعاد والدراسات في الجسم الحي ، حيث أن هذا النوع من الثقافة (المشتركة) يحاكي بشكل أفضل الخصائص الفسيولوجية والمورفولوجية والمرضية الموجودة في الجسم الحي لأن المزيد من التفاعلات بين الخلايا والخلية الشبيهة بالجسم الحي ، وتفاعلات الخلية ECM ، والاستجابات للمنبهات ، والتعبير الجيني ، والتعبير عن البروتين ، والتمايزموجودة 17 ، 18....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يذكر المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح الشخصية أو المؤسسية.

شكر وتقدير

نشكر محمد بن شلال وإيفا غاو وسابين سينكل وأولغا كروس على مساعدتهم الفنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من قبل الوزارة الفيدرالية للتعليم والبحث (BMBF) (LuOrgNTT: 16LW0293 to D.K. ، SeniRad: 02NUK086C to V.J. ، D.K.) ومن قبل DFG Research Training Group 2762.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 مل ماصات مصلية معقمة ThermoFischer170356Nماصات مصلية معقمة ، أو ما يعادل
15 مل أنبوب مخروطيCorning430052 أو ما يعادله
37 درجة ؛ C / 5٪ CO2< / sub> رطب   ؛ حاضنة
5 مل ماصات مصلية معقمة ThermoFischer170355NNunc ، أو ما يعادل
50 مل أنبوب مخروطيCorningCLS430829أو ما يعادله
ATRA (حمض الريتينويك المتحولStemCell TechnologiesCat # 7226250 nM
B-27 Supplement (50x) ،   ؛ThermoFischer / GibcoCat # 175040441x
BD Rhapsody WTA Amplification KitBD BioscienceCat # 633801استخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة خزانة
السلامة الحيوية
مصل الأبقار الألبومينRocheCat # BSAVHS-RO0.4٪ (حجم / حجم)
مصفاة الخليةCorning352350فالكون 70 & مايكرو; مصفاة خلية m ، بيضاء ، معقمة ، معبأة بشكل فردي
جهاز طردEppendorfhttps://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001على سبيل المثال ، جهاز طرد مركزي Eppendorf 5804 - جهاز طرد مركزي على الطاولة
DMEM / F12InvitrogenCat # 11330-032500 مل
DNase I ، خالي من RNase (1   ؛ U/μ L)ThermoFischerCat # EN0521100 U / mL   ؛
EDTA (0,5 م) ، درجة الحموضة 8,0 ،ThermoFischerخالية من RNase AM9260G2 ملي
مولار Eppendorf Research بالإضافة إلى 12 قناة ماصة متعددة القنوات   ؛Eppendorfعلى سبيل المثال ، # 3125000044 (10 – 100 وميكرو ؛ L) أو #3125000060 (30 – 300 وميكرو ؛ L)
مصل ربلة الساق الجنينيةThermoFischer / GibcoCat # A525670110٪ (v / v)
HBEC3-KT & nbsp ؛ATCCCRL-4051خط الخلايا الظهارية الرئوية الطبيعية للإنسان  
محلول الهيبارين (0.2٪)StemCell TechnologiesCat#79800.8 mL
Hoechst 33342 ThermoFischerCat # H13991 & micro ؛ جم / مل
HS-5   ؛ATCCCRL-3611الخلايا الليفية اللحمية البشرية
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACFStemCell TechnologiesCat # 78173.110 نانوغرام / مل
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF   ؛StemCell TechnologiesCat # 78186.110 نانوغرام / مل
طقم تعدد الإرسال البشري أحادي الخليةBD BioscienceCat # 633781استخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
Hydrocortisin Stock Solution تقنيات الخلاياالجذعية Cat # 79260.5 مل لكل 500 مل
Laduviglusib (CHIR-99021)Biozol / SelleckchemCat # S12633 & micro ؛ M
L-Ascorbic حمضSigma-AldrichCat # A9290250 & micro ؛ جم / مل
مجهرZEISS
MonothioglycerolSigma-AldrichCat # M61450.4 & micro ؛
ملحق M N-2 (100x)ThermoFischer / GibcoCat # 175020481x
غرفة عد NeubauerMerckBR718605على سبيل المثال ، BRAND & nbsp ؛ غرفة العد BLAUBRAND  نمط Neubauer
مصل الماعز العاديThermoFischerCat # 318732٪ (حجم حجم / حجم) في PBS
NP-40Merck / MilliporeCat # 492016NP-40-Alternative ، 1
طقم تلطيخ PASSigma AldrichCat # 1016460001استخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
PBSThermoFischerCat # 100100231x
البنسلين - الستربتومايسين (10.000  U / mL) ، 100xThermoFischer / GibcoCat # 151401221x
PFAThermoFischerCat # J61899. AKParaformaldehyd ، 4٪ في PBS
PneumaCult Airway Organoid Medium: Media، (ODM)، تقنيات الخلايا الجذعيةCat # 05060PneumaCult مجرى الهواء العضوي الوسطي القاعدي (# 05061 ، 360 مل) و PneumaCult مجرى الهواء العضوي التمايز الملحق * (# 05063 ، 40 مل)
PneumaCult Ex Plus MediumStemCell TechnologiesCat # 5040طقم يتكون من PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (# 05041 ، 490 مل) و PneumaCult-Ex Plus 50X * (# 05042 ، 10 مل)
كوكتيل مثبط البروتيازMerck / RocheCat # 46931320011 علامة تبويب / 10 مل
Rhapsody cDNA KitBD BioscienceCat # 633773استخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
RPMI 1640 MediumThermoFisher / GibcoCat #11875093 500 مل
كلوريد الصوديومMerck / Sigma-AldrichS9625150 مليمول / لتر
سترات الصوديومMerck / Sigma-AldrichCat # 1613859-1G0.10٪
Deoxycholateالصوديوم Merck / Sigma-AldrichCat # 309700.50٪
كبريتات دوديسيل الصوديوم   ؛Merck / Sigma-AldrichCat # 116672890010.10٪
خزان كاشف معقم للماصة الدقيقة متعددة القنوات (على سبيل المثال ، 60 مل)ThermoFischer9510037أو ما يعادلها
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ؛ ckSarstedt (أو facellitate)83.3925.400 (أو F202003)لوحة مرفق منخفضة للغاية
تريس / حمض الهيدروكلوريكThermoFischerCat # AM9855G50 مليمول / لتر ، درجة الحموضة 8
تريتون   ؛ X-100سيجما ألدريتشالقط # X100-5ML0.05٪   ؛
Trypan Blue Stain (0.4٪)ThermoFischerCat # 152500611/5 (حجم / حجم) مع NGM
TrypLEThermoFischerCat # 126040131x
Trypsin-EDTA (0.5   ;٪)ThermoFischerCat # 154000540.05٪ محلول Trypsin-EDTA (TE) مخفف بشكل معقم إلى 1X باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) كاشف
WST-1CELLPRO-RO ، RocheCat#5015944001كاشف تكاثر الخلايا 
ماصات مصلية معقمة ) مركزي ٪

المراجع

  1. Rasouli, M., Safari, F. Principles of indirect co-culture method using Transwell. Methods Mol Biol. , (2024).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng C. 107, 110264(2020).
  3. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84 (6), 736-752 (2004).
  4. Huang, X., et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 8 (12), 829(2022).
  5. Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: progress so far and future prospects. Pharmaceutics. 15 (8), 926(2022).
  6. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  7. Baarsma, H. A., et al. Epithelial 3D-spheroids as a tool to study air pollutant-induced lung pathology. SLAS Discov. 27 (3), 185-190 (2022).
  8. Shah, D. D., Raghani, N. R., Chorawala, M. R., Singh, S., Prajapati, B. G. Harnessing three-dimensional (3D) cell culture models for pulmonary infections: state of the art and future directions. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 396 (11), 2861-2880 (2023).
  9. Ketteler, J., et al. Caveolin-1 regulates the ASMase/ceramide-mediated radiation response of endothelial cells in the context of tumor-stroma interactions. Cell Death Dis. 11 (4), 228(2020).
  10. Wittka, A., et al. Stromal fibroblasts counteract the caveolin-1-dependent radiation response of LNCaP prostate carcinoma cells. Front Oncol. 12, 802482(2022).
  11. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Matrix-free human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells to model lung injury. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 468(2024).
  12. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  13. Hansel, C., et al. Metformin protects against radiation-induced acute effects by limiting senescence of bronchial-epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (13), 7064(2021).
  14. Panic, A., et al. Progression-related loss of stromal caveolin 1 levels fosters the growth of human PC3 xenografts and mediates radiation resistance. Sci Rep. 7, 41138(2017).
  15. Sentek, H., Braun, A., Budeus, B., Klein, D. Non-small cell lung cancer cells and concomitant cancer therapy induce a resistance-promoting phenotype of tumor-associated mesenchymal stem cells. Front Oncol. 14, 1406268(2024).
  16. Steens, J., et al. Direct conversion of human fibroblasts into therapeutically active vascular wall-typical mesenchymal stem cells. Cell Mol Life Sci. 77 (17), 3401-3422 (2020).
  17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  18. Arora, S., et al. Spheroids in cancer research: recent advances and opportunities. J Drug Deliv Sci Technol. 100, 106033(2024).
  19. Chen, S., et al. 3D co-culture of lung cancer cells with CAFs: An in vitro model system to study tumor progression. J Vis Exp. , e20235(2025).
  20. Hey, S., Linder, S. A macrophage-tumor spheroid co-invasion assay. JoVE. (215), (2025).
  21. Miranda, G., et al. Cost-effective 3D lung tissue spheroid as a model for SARS-CoV-2 infection and drug screening. Artif Organs. 48 (7), 723-733 (2024).
  22. Celis, T., Bullens, D. M. A., Hoet, P. H. M., Ghosh, M. Development and validation of a human bronchial epithelial spheroid model to study respiratory toxicity in vitro. Arch Toxicol. 98 (2), 493-505 (2024).
  23. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of normal human bronchial epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  24. Basil, M. C., et al. The cellular and physiological basis for lung repair and regeneration: past, present, and future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  25. Klein, D. Lung multipotent stem cells of mesenchymal nature: cellular basis, clinical relevance, and implications for stem cell therapy. Antioxid Redox Signal. 35 (3), 204-216 (2021).
  26. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. J Clin Invest. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  27. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaço-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: an overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  28. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Free-floating human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. , (2025).
  29. Li, C., et al. Establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids. JoVE. (181), e63684(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.