يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنشاء نماذج في المختبر لثقافة العقد الجذرية الظهرية: مناهج تكميلية للتحقيق في الحديث المتبادل بين السرطان والأعصاب

2.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68552

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طرق إنشاء ثقافات كاملة ومنفصلة للعقد الجذرية الظهرية للفأر (DRG) واستخدامها لتقييم تفاعلات الورم والعصب.

الملخص

يتم الاعتراف بشكل متزايد بمساهمة الجهاز العصبي في البيئة المكروية للورم وأهمية الغزو العصبي كطريق لانتشار السرطان. يمكن أن تعزز تفاعلات الخلايا السرطانية مع الخلايا العصبية غزوها حول الأعصاب وداخلها ، وهي سمة من سمات العديد من أنواع السرطان ذات النتائج السريرية السيئة. توفر النماذج المختبرية لدراسة التفاعلات المتبادلة بين الخلايا العصبية والخلايا السرطانية أدوات قيمة لفهم انتشار السرطان وتحديد الأساليب للتخفيف منه.

هنا ، نصف بروتوكولا لعزل العقد الجذرية الظهرية للفئران (DRG) وإنشاء كل من الثقافات أحادية الطبقة الكاملة والمنفصلة التي يمكن استخدامها لتصور مورفولوجيا الخلايا العصبية ونمو الخلايا العصبية بمرور الوقت. تحافظ DRGs الكاملة المثبتة في Matrigel على بنية الأعصاب والاستجابات للمنبهات في بيئة غير متجانسة أكثر تشابها مع العصب في الجسم الحي ، بينما تسمح الثقافات العصبية المنفصلة بتقييم التفاعلات المباشرة بين الخلايا والخلايا عن كثب. بمجرد إنشاء مزارع DRG ، يمكن إضافة الخلايا السرطانية لتوليد الثقافات المشتركة التي يمكن استخدامها لتصور التغيرات في نمو الخلايا العصبية ومورفولوجيا الأعصاب استجابة للخلايا السرطانية. يمكن تقييم نمو أو حركة الخلايا السرطانية استجابة للإشارات المشتقة من الأعصاب بمرور الوقت أو في ظل ظروف تحفيز النمو أو التثبيط ، بالإضافة إلى تصور آثار الاتصال المباشر بين الخلايا السرطانية وامتدادات الأعصاب.

نظرا لأنه يمكن إنشاء كلا نموذجي الزراعة المشتركة في وقت واحد ، فإن هذا البروتوكول يوفر رؤية أكثر شمولا لتأثير تفاعلات الخلايا السرطانية ويسهل مقارنات ظروف العلاج وتكامل المعلومات من المستوى الخلوي والعقد الكاملة. سيسهل هذا البروتوكول دراسة التفاعلات بين الأعصاب والورم ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك دراسات إشارات الخلايا ، أو فحص الأدوية ، أو دراسة عدم تجانس بيئة الورم والأعصاب وآليات انتشار الورم على طول الأعصاب.

المقدمة

انتشار الورم ، من خلال الغزو المحلي والورم الخبيث الإقليمي أو البعيد ، هو السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان. على الرغم من أن الأبحاث ركزت على طرق انتشار الأوعية الدموية أو اللمفاوية ، إلا أن الغزو العصبي للخلايا السرطانية يلاحظ بشكل متكرر في العديد من الأورام الصلبة ، بما في ذلك سرطان البنكرياس1،2 والبروستاتا3 والرأس والرقبة4 والثدي5 والقولون والمستقيم6 . في السنوات الأخيرة ، سلطت العديد من الدراسات الضوء على الدور الناشئ للأعصاب في تعزيز نمو الورم وتطوره ، وكطرق للانتشار ، مما يؤدي إلى تطور ورم خبيث7،8. في هذا السياق ، برز علم الأعصاب السرطاني كمجال بحثي بارز ، حيث يقدم وجهات نظر جديدة في علم الأورام من خلال توضيح التفاعلات بين الخلايا السرطانية والمكونات الأساسية للجهاز العصبي المحيطي (PNS) التي قد تساهم في هذهالعمليات 8،9.

يتكون الجهاز العصبي المحيطي من كل من الأعصاب الطرفية والعقد ، وهي هياكل غير متجانسة تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية ذات الأحجام والوظائف المختلفة ، وشوان والخلايا الدبقية الأخرى ، والخلايا الليفية ، والضامة ، والخلايا البدينة ، والخلايا الصباغية ، والخلايا البطانية الوعائية التي تشكل الأوعية الدموية المحلية10. يعد PNS مكونا مهما في البيئة المكروية للورم (TME) ، والتواصل المتبادل بين الخلايا السرطانية والأعصاب ، إما بشكل مباشر من خلال الاتصال الجسدي أو بشكل غير مباشر من خلال إطلاق عوامل التغذية العصبية ، والناقلات العصبية ، وعوامل النمو ، والإشارات الأخرى ، يمكن أن يسهل الغزو العصبي ويعزز الأنماط الظاهرية الأكثر عدوانية8.

يمكن استخدام النماذج المختبرية لتوصيف العمليات التي تساهم في صيانة الأعصاب وإصلاحها ويتم استخدامها بشكل متزايد لفحص التفاعلات الخلوية بين الأعصاب والخلايا السرطانية11،12. يتضمن النموذج المستخدم بشكل متكرر في المختبر العقد الجذرية الظهرية للفأر المستخرجة (DRG) المستخرجة مع الخلايا السرطانية11. غالبا ما تستخدم هذه النماذج ثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D) لخلايا DRG المنفصلة لدراسة بيولوجيا الخلايا العصبية في المختبر وقد تم استخدامها لنمذجة التفاعلات الخلوية في PNS13،14. ومع ذلك ، تفتقر الثقافات ثنائية الأبعاد إلى تعقيد البيئة المكروية العصبية وتمثل بشكل سيئ بنيتها في الجسم الحي. توفر الحوامل الكاملة ثلاثية الأبعاد (3D) من الخلايا العصبية الطرفية أو العقد بديلا يلخص بشكل أكثر فعالية فسيولوجيا الأعصاب المحيطية لتمثيل التفاعلات العصبية والبيئة بشكل أكثر شمولية15،16،17،18. ومع ذلك ، فإن عدم تجانس هذا النموذج يحد من القدرة على تصور أو تحديد تفاعلات الخلية بين الخلايا ، وهذه النماذج أكثر فاعلية في مراقبة الاستجابات العصبية الطرفية الشاملة من استكشاف التفاعلات الخلوية المحددة والاستجابات الميكانيكية للمنبهات. وبالتالي ، من الواضح أن الثقافات العصبية المنفصلة والكاملة مكملة وأن تقييم النماذج ثنائية الأبعاد و 3D بالتوازي هو الأمثل لتقييم كل من التأثيرات الإجمالية واستجابات الخلايا الفردية للمنبهات.

يصف هذا البروتوكول طرقا لتوليد ثقافات الأعصاب التكميلية المنفصلة (2D) والكاملة (3D) التي يمكن استخدامها لتقييم تفاعلات الخلايا العصبية والسرطانية على المستويين الخلوي والأنسجة ، مما يوفر رؤية أكثر شمولا لهذه التفاعلات من الطرق التي تستخدم نوعا واحدا فقط من الثقافة1،13. يمكن استخدام هذه النماذج لتصور وتقييم العمليات الخلوية ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا العصبية ونمو الخلايا العصبية ، بالإضافة إلى استجابات الخلايا السرطانية للعوامل الكيميائية التي تفرز الأعصاب ، مثل العوامل العصبية ، والحديث المتبادل بين الخلايا العصبية الحسية والخلايا السرطانية. كما يسمح باستكشاف التفاعلات المحتملة بين الخلايا السرطانية والمكونات الأخرى للبيئة المكروية العصبية ، مثل الخلايا المناعية والخلايا الليفية والخلايا الدبقية. نسلط الضوء على تطبيق هذه النماذج لدراسة تفاعلات الخلايا السرطانية العصبية بمرور الوقت ، والتي يتم تصورها عن طريق تلطيخ الخلايا الحية أو التألق المناعي ، كأمثلة على طرق لتقييم أو تحديد تفاعلات الخلايا واستجاباتها. معا ، يمكن للنتائج الناتجة عن استخدام هذه الأساليب أن تعزز فهمنا لكيفية تعزيز الجهاز العصبي لنمو وانتشار السرطان ، مما يساعدنا على تطوير استراتيجيات لاستهداف هذه الآليات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع أعمال الفئران والموافقة عليها من قبل مكتب لجنة رعاية الجامعية في جامعة كوينز (البروتوكول رقم 2524). تم الحفاظ على والقتل الرحيم لجمع الأنسجة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للمجلس الكندي لرعاية والمركز الوطني لاستبدال في البحث (المملكة المتحدة). في هذا البروتوكول ، استخدمنا الأنسجة المعزولة من C57BL / 6 ولكننا استخدمنا أيضا أنماطا وراثية أخرى بنجاح ، بما في ذلك Rag2IL2Rγc KO. يمكن تنفيذ الأقسام من 1 إلى 6 في بيئة نظيفة على مقعد مختبر معقم بالسطح (انظر الشكل 1) ، بينما يجب تنفيذ الأقسام 7-9 في خزانة السلامة البيولوجية. لفهم أفضل ، تم إنشاء تمثيلات تخطيطية للخطوات المذكورة (الشكل 1).

1. تحضير حلول المخزون

  1. تحضير محلول غراء ومحلول Collagenase IV / Dispase II. يذوب غراء في PBS معقم (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) بتركيز 30 U / mL ؛ يحفظ في 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية. قم بإذابة الكولاجيناز من النوع الرابع عند 1.25 مجم / مل و Dispase II عند 2.5 مجم / مل في PBS. يحفظ في 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية.
  2. تحضير وسائط الثقافة العصبية القاعدية (F12) مكملة بمكمل B27 2٪ (محلول مخزون 50x) ، ومصل بقري للجنين بنسبة 10٪ (FBS) ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (Pen-Streprep) (محلول مخزون 100x).
  3. تحضير محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين (محلول مخزون 100 ضعف).
    ملاحظة: لدعم بقاء الخلية الأولية وتعلقها ، يتم استخدام وسائط F12 المكملة بنسبة 10٪ FBS لتحسين تكوين الثقابات. ومع ذلك ، فإن FBS يعزز أيضا تكاثر الخلايا غير العصبية ، بما في ذلك الخلايا الليفية. يمكن استخدام ظروف الوسائط المخفضة أو الخالية من المصل (على سبيل المثال ، F12 المكمل ب B27 فقط) لتقليل نمو الخلايا غير العصبية في مزرعة DRG والثقافة المشتركة للسرطان ولكنها قد تؤثر على البقاء على قيد الحياة ، خاصة مزارع الخلايا العصبية المنفصلة. يجب أيضا مراعاة الوسائط الخالية من المصل عند جمع الوسائط المكيفة DRG لتقييم آثارها على سلوك الخلايا السرطانية.

2. تحضير الكواشف والمواد لتشريح DRGs (الشكل 1 أ)

  1. أدوات الأوتوكلاف الجراحية. قم بتعقيم مجهر التشريح السطحي باستخدام 70٪ من الإيثانول ووضعه على مقعد نظيف.
  2. أضف 6-8 مل من HBSS-Pen-Strep (الخطوة 1.3) إلى لوحين للزراعة مقاس 10 سم وضعه على الثلج.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذه الألواح لجمع الأعمدة الشوكية بعد التشريح. اعتمادا على عدد الحبال الشوكية التي يتم تشريحها، قد تكون هناك حاجة إلى لوحات إضافية.
  3. أضف 8-10 مل من HBSS-Pen-Strep إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وضعه على الثلج.
  4. أضف 3 مل من HBSS-Pen-Strep إلى طبق ثقافة 3 سم ، وضعه على الثلج.
    ملاحظة: سيتم استخدام الأنبوب سعة 15 مل المحضر في الخطوة 2.3 لتجميع DRGs للتفكك ، بينما سيتم استخدام لوحة الاستزراع مقاس 3 سم (الخطوة 2.4) لتجميع DRGs لنموذج التثبيت الكامل.

3. تحضير الكواشف والمواد لثقافة DRG كاملة التركيب

ملاحظة: قد تتطلب بعض الخطوات في هذا القسم التحضير طوال الليل. على الرغم من أنه يمكن استخدام أي نوع من ألواح زراعة الأنسجة لمزارع DRG ، فقد تم تحسين الأحجام والتعليمات الواردة في هذا البروتوكول للشرائح السفلية الزجاجية المكونة من 8 آبار ، والتي وفرت جودة تصوير مثالية لتحليلاتنا. احتفظ بالشريحة السفلية الزجاجية ذات 8 آبار وأطراف الماصة وماتريجل على الجليد في جميع الأوقات.

  1. قم بإذابة محلول Matrigel عند 4 درجات مئوية طوال الليل (أو 3 ساعات على الأقل) قبل الاستخدام. تأكد من إبقاء Matrigel مغطى بالثلج في جميع الأوقات.
  2. قم بتبريد أطراف الماصة والشريحة السفلية الزجاجية ذات 8 آبار عند -20 درجة مئوية طوال الليل لتقليل التصاق Matrigel بالأطراف ومنع بلمرة Matrigel المبكرة في اللوحة.
  3. وسائط مكملة دافئة (الخطوة 1.2) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

4. تحضير الكواشف والمواد لثقافة DRG المنفصلة

  1. قم بإذابة محلول غراء ومحلول الكولاجيناز IV / Dispase II (الخطوة 1.1) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
    ملاحظة: لكل فأر تم تشريحه ، استخدم 1 aliquot (1 مل) لكل من محلول Papain و Collagenase IV / Dispase II.
  2. وسائط الثقافة الدافئة المكملة (الخطوة 1.2).

5. حصاد العمود الفقري (الشكل 1 ب) وتشريح DRGs (الشكل 1 ج)

  1. القتل الرحيم للفئران البالغة من العمر 4-8 أسابيع عن طريق جرعة زائدة من الأيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم. ضع القتل رحيم على بطنه واحلق فراءه ، مع التركيز على المنطقة الموجودة فوق العمود الفقري (الشكل 1 ب ، الخطوات 1،2).
  2. رش ظهر بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإزالة أي فرو فضفاض ، وامسحه بمناشف ورقية من الذيل إلى الجمجمة لمنع الفراء من تلويث التشريح.
  3. باستخدام مقص معقم ، قم بعمل شق مستقيم على طول السطح الظهري المحلوق ، من الذيل إلى الجمجمة. اسحب الجلد على جانبي الشق باستخدام ملقط غير حاد لكشف العمود الفقري (الشكل 1 ب ، الخطوة 3).
  4. باستخدام زوج جديد من الملقط والمقص لمنع التلوث بالفراء ، قم بعمل شق أفقي في قاعدة (نهاية الذيل) للعمود الفقري (الشكل 1 ب ، الخطوة 4).
  5. قم بعمل شقين طوليين متوازيين على كل جانب من العمود الفقري لتحريره. استخدم الملقط لرفع العمود الفقري برفق لإزالة النسيج الضام المحيط (الشكل 1 ب ، الخطوة 5).
  6. لتحرير العمود الفقري بالكامل ، قم بعمل شق في الجزء العلوي من العمود الفقري (القريب من الجمجمة). انقل العمود الفقري إلى صفائح 10 سم مبردة مسبقا تحتوي على HBSS-Pen-Strep على الجليد (الخطوة 2.2) (الشكل 1 ج ، الخطوة 6).
    ملاحظة: من الملائم جمع كل الأعمدة الشوكية في نفس اللوحة مقاس 10 سم ونقل الأعمدة الفردية واحدة تلو الأخرى إلى لوحة منفصلة لمزيد من خطوات التشريح.

6. تشريح العقد الجذرية الظهرية (DRGs)

  1. باستخدام مقص زنبركي ، قم بإزالة أي نسيج ضام متبقي حول العمود الفقري ، مما أدى إلى تعريض الفقرات (الشكل 1C ، الخطوة 7). هذا يسمح برؤية أوضح للفقرة ويسهل القطع على طول خط الوسط. اجمع الأعمدة المشذبة في طبق طازج مبرد مسبقا مقاس 10 سم (الخطوة 2.2).
  2. انقل الحبل الشوكي المشذب واحدا تلو الآخر إلى مرحلة المجهر للتشريح. قم بتقسيم العمود الفقري بعناية في المستوى السهمي باستخدام مقص زنبركي (الشكل 1D ، الخطوة 8).
  3. باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، قم بإزالة الحبل الشوكي من العمود الفقري ، وتعريض DRGs بشكل ثنائي على طول جذور الأعصاب الشوكية (الشكل 1D ، الخطوة 9).
    ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد في هذه الخطوة حيث يمكن إزالة DRGs بالحبل الشوكي إذا تم التعامل معها بقسوة شديدة.
  4. اقطع الأعصاب الشوكية بمقص زنبركي وقم بإزالة أي نسيج ضام حول DRGs (الشكل 1D ، الخطوة 10).
    ملاحظة: تؤدي إزالة النسيج الضام في هذه الخطوة إلى تقليل الحطام في مزارع DRG.
  5. باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، اسحب DRG برفق لاستخراجه من الجذر الظهري. لثقافة التثبيت الكاملة ، ضع DRGs في لوحة 3 سم (محضرة في الخطوة 2.4) (الشكل 1D ، الخطوة 11). قم بتجميع DRGs المتبقية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل (معد في الخطوة 2.3) لاستخدامه في التفكك.
    ملاحظة: احتفظ بالأطباق والأنابيب على الجليد طوال عملية التشريح.
  6. كرر الخطوات من 6.4 إلى 6.5 حتى يتم استخراج جميع DRGs. كرر جميع الخطوات المذكورة أعلاه لأي أعمدة فقرية إضافية.
    ملاحظة: تحتوي الفئران على 30-31 زوجا من DRG اعتمادا على السلالة ، مما سيسمح بجمع ما يصل إلى 60 DRGs من كل. في حالة جمع DRGs فقط من الجزء القطني من الحبل الشوكي ، يمكن استخراج 10 DRGs. إن استخدام DRGs من نفس لإنشاء كلا نموذجي الاستزراع يقلل من التباين داخل التجربة ويضمن نتائج متسقة وقابلة للمقارنة بين التجارب التكميلية.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تلي استخراج DRGs في خزانة السلامة البيولوجية.

7. ثقافة DRG كاملة التركيب (الشكل 2)

  1. باستخدام أطراف مبردة مسبقا (الخطوة 3.2) ، قم بعمل 2 ميكرولتر من Matrigel المبرد لتشكيل قطرة في كل بئر من شريحة سفلية زجاجية مكونة من 8 آبار موضوعة على الجليد (الشكل 2 أ ، الخطوة 1). لمنع Matrigel من البلمرة قبل الأوان قبل إضافة DRG، قم بعمل ماصة قطرة واحدة فقط في كل مرة. لمنع خدش سطح الشريحة ، ضع الشريحة في طبق 10 سم قبل وضعها على الثلج.
  2. باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة ، انقل DRG إلى صفيحة جافة وحركها برفق لإزالة أي HBSS زائدة ، مما يمنع المزيد من تخفيف Matrigel عند إضافة DRG إلى قطرة Matrigel. انقل DRG إلى قطرة Matrigel (الشكل 2 أ ، الخطوة 2).
    ملاحظة: استخدم ملقطا رفيع الرؤوس لدفع DRG برفق إلى قطرة Matrigel ، مما يضمن غمر DRG بالكامل ووضعه المركزي داخل القطرة.
  3. كرر الخطوات من 7.1 إلى 7.2 لكل DRG مضاف إلى قطرة Matrigel.
  4. احتضن الشريحة السفلية الزجاجية المكونة من 8 آبار عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حاضنة مرطبة للسماح ل Matrigel بالبلمرة (الشكل 2 أ ، الخطوة 3).
  5. أضف بعناية 200 ميكرولتر من وسائط الاستزراع الدافئة المكملة إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (الشكل 2 ب ، الخطوة 4). استبدل الوسائط بوسائط استزراع جديدة مكملة كل 72 ساعة.
  6. راقب DRG باستخدام الفحص المجهري الساطع لتقييم قابليته للحياة ونمو الخلايا العصبية كل 24 ساعة (الشكل 2 ج والشكل 3).
    ملاحظة: يمكن الإشارة إلى الجدوى من خلال زيادة طول وكثافة الأعصاب. يمكن التقاط الصور بمرور الوقت لتوضيح تطور امتدادات خلايا DRG (الشكل 3).

8. ثقافة DRG المنفصلة (الشكل 4)

ملاحظة: يمكن استخدام أي لوحة متعددة الآبار لزرع الخلايا العصبية DRG المنفصلة. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام شرائح ذات قاع زجاجي مكون من 8 آبار لأنها وفرت جودة أفضل للخلايا وجودة تصوير أفضل لتحليلات التألق المناعي.

  1. طلاء لوحات الثقافة بالكولاجين
    1. قم بإعداد محلول عمل 50 ميكروغرام / مل من الكولاجين المحمض I في 0.01 M HCl معقم في خزانة السلامة البيولوجية.
    2. ماصة 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين I في كل بئر من الشريحة السفلية الزجاجية المكونة من 8 آبار. قم بإمالة الشريحة وتدويرها برفق للتأكد من أن محلول الكولاجين يغطي السطح السفلي بالكامل لكل بئر بالتساوي. احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة لمدة 1 ساعة لضمان بلمرة الكولاجين الأول.
      ملاحظة: أثناء وقت الحضانة ، تابع الخطوتين 8.2 و 8.3.
    3. بعد الحضانة، قم بإزالة أي محلول كولاجين I متبقي غير مبلمر من كل بئر برفق. اشطف كل بئر ب 100 ميكرولتر من PBS. ماصة من PBS الزائدة ، تاركة طبقة رقيقة متبقية لمنع الكولاجين من الجفاف.
      ملاحظة: يمكن أن تظل الشريحة السفلية الزجاجية المكونة من 8 آبار في خزانة السلامة البيولوجية حتى تصبح DRGs المنفصلة جاهزة لخطوة البذر.
  2. الهضم الأنزيمي
    1. قم بالطرد المركزي برفق الأنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على DRGs المستخرجة (الخطوة 6.5) لمدة 5 دقائق عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة لحبيبات DRGs. قم بإزالة HBSS برفق باستخدام ماصة.
    2. اشطف DRGs في وسائط مكملة مسخنة مسبقا ، واضغط برفق على الأنبوب لضمان غسل جميع المحتويات وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم لحبيبات DRGs.
    3. قم بإخراج الوسائط وأضف 1 مل من محلول غراء (الشكل 4 أ ، الخطوة 1). تخلط برفق وتحتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. رج الأنبوب برفق لتحريكه كل 5 دقائق.
    4. بعد 20 دقيقة ، أضف 4.5 مل من الوسائط المكملة واخلطها برفق لتحييد غراء. أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم إلى حبيبات DRGs. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
    5. أضف 1 مل من محلول Collagenase IV / Dispase II واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. رج الأنبوب برفق كل 5 دقائق (الشكل 4 أ ، الخطوة 1).
    6. بعد 20 دقيقة ، أضف 4.5 مل من الوسائط المكملة واخلطها برفق لتحييد محلول Collagenase IV / Dispase II. أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم إلى حبيبات DRGs. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
    7. أضف 2 مل من الوسائط المكملة وأضف DNase I إلى التركيز النهائي البالغ 0.2 مجم / مل. في هذه المرحلة ، يتم هضم DRGs تماما وقد تظهر على شكل كتلة فضفاضة (الشكل 4 أ ، الخطوة 2).
  3. التفكك الميكانيكي
    1. قم بتدوير DRG برفق، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل 4-5 أضعاف باستخدام طرف ماصة مرشح سعة 1000 ميكرولتر (الشكل 4A، الخطوة 2).
    2. قم بتنفيذ خطوة التجربة الثانية باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر 4-5x. بعد هذه الخطوة ، تبدو العينة غائمة مع بقاء بعض كتل الأنسجة المرئية (الشكل 4 أ ، الخطوة 2).
    3. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اشطف المصفاة تدريجيا ب 10 مل من الوسائط لضمان الترشيح الكامل للخلايا من خلال المصفاة (الشكل 4 أ ، الخطوة 3).
    4. أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1,000 × جم لخلايا الحبيبات. قم بإزالة الوسائط من الحبيبات وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من الوسائط المكملة (الشكل 4 أ ، الخطوة 4).
    5. قم بإزالة أي PBS متبقي من آبار الشريحة السفلية الزجاجية المكونة من 8 آبار. توزيع تعليق DRG المنفصل بين الآبار المطلية بالكولاجين. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. أضف المزيد من الوسائط حسب الحاجة واستبدل الوسائط بوسائط استزراع مكملة جديدة كل 48 ساعة (الشكل 4 ب ، الخطوة 5).
      ملاحظة: يمكن عد الخلايا المنفصلة DRG باستخدام مقياس كثافة الدم أو غرفة عد الخلايا وتلوين المثقب الأزرق لضمان عدد ثابت من الخلايا في البئر. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم زرع ما يقرب من 1 × 105 خلايا في كل بئر.
    6. راقب الخلايا المشتقة من DRG باستخدام الفحص المجهري الساطع لتقييم الجدوى ونمو الخلايا العصبية (الشكل 4C والشكل 5).
      ملاحظة: تظهر الخلايا العصبية كأجسام خلوية مستديرة ذات حدود محددة وقد تستغرق 24 ساعة أو أكثر للالتصاق ، بينما تستقر الخلايا غير العصبية عادة قبل الخلايا العصبية. يمكن ملاحظة بعض نمو العصبيات بعد 24 ساعة ويزيد بمرور الوقت حتى 7 أيام في الثقافة. يتم تحضين الخلايا المشتقة من DRG المنفصلة و DRG المثبت بالكامل لمدة 72 ساعة قبل إضافة الخلايا السرطانية وإنشاء الثقافات المشتركة.

9. تحضير معلقات الخلايا السرطانية وإنشاء الثقافات المشتركة

ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا السرطانية الملتصقة بأنواع عديدة. ستعتمد وسائط النمو وأرقام الخلايا للثقافات المشتركة على خط الخلية. نوصي بإجراء اختبار أولي قبل التجربة لتحديد توقيت جمع الخلايا والأرقام المثلى لتلقيح الخلايا. استند البروتوكول الموصوف هنا إلى استخدام خطوط خلايا سرطان البنكرياس البشري PanC1 و MiaPaCa2 وخط خلايا سرطان البروستاتا DU-145.

  1. اغسل الخلايا بوسائط خالية من المصل وقم بتربسينها لمدة 3 دقائق تقريبا باستخدام 2 مل من التربسين / طبق 10 سم.
  2. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 6 مل من الوسائط المكملة والماصة برفق لأعلى ولأسفل لضمان تعليق أحادي الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وصبغة التريبان الزرقاء.
  3. الخلايا السرطانية بتركيز 2 × 105 خلايا / مل في وسائط مكملة (الخطوة 1.2).
    ملاحظة: قد تختلف كثافة الخلايا المثلى اعتمادا على حجم الخلية ووقت المضاعفة ومدة الزراعة المشتركة ويمكن تعديلها حسب الحاجة.
  4. DRG كامل التركيب والزراعة المشتركة للخلايا السرطانية (الشكل 6 ب)
    1. استنشق الوسائط من ثقافات DRG المثبتة بالكامل في الشريحة السفلية الزجاجية المكونة من 8 آبار.
    2. قم ببرفق 200 ميكرولتر من تعليق الخلية السرطانية (الخطوة 9.3) فوق قطرة Matrigel التي تحتوي على حامل DRG بالكامل.
      ملاحظة: هذا يضمن توزيعا موحدا للخلايا السرطانية حول القطرة. احرص على عدم إزعاج قطرة Matrigel بطرف الماصة.
    3. احتضان شريحة الاستزراع المشترك في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بتحديث الوسائط يوميا عن طريق غسلها ب 200 ميكرولتر من الوسائط الدافئة مرة واحدة ، ثم إضافة 300 ميكرولتر من الوسائط المكملة إلى كل بئر.
      ملاحظة: قم بشفط الوسائط برفق باستخدام ماصة لتجنب إزعاج الزراعة المشتركة للخلايا السرطانية DRG. بمرور الوقت ، عندما تصبح الثقافات المشتركة أكثر تعقيدا وتنظيما ، فإنها تصبح أيضا أكثر عرضة للاضطرابات التي قد تؤثر على التفاعلات الخلوية وسلامة الثقافة المشتركة.
    4. راقب الثقافة المشتركة باستخدام مجهر المجال الساطع أو المجهر الفلوري على فترات 24 ساعة لتقييم سلوك الخلايا السرطانية والتفاعلات العصبية (الشكل 6 ب).
      ملاحظة: يمكن تعديل تردد المراقبة بناء على الجدول الزمني التجريبي وتفاعلات الخلية ذات الأهمية.
  5. DRG المنفصلة والزراعة المشتركة للخلايا السرطانية (الشكل 6 ج)
    1. استنشق الوسائط من الثقافات المنفصلة في الشريحة ذات القاع الزجاجي المكون من 8 آبار.
    2. وزعي برفق 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية (الخطوة 9.3) في كل بئر. اتبع نفس خطوات الحضانة وتحديث الوسائط والمراقبة كما هو موضح للثقافات المشتركة الكاملة (الخطوتان 9.4.3 و 9.4.4).
      ملاحظة: للحصول على تصور أفضل للعمليات الخلوية وتفاعلات الخلايا العصبية السرطانية ، يمكن إضافة أجهزة تتبع الخلايا الفلورية إلى المزرعة ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يصف بروتوكولنا عزل الخلايا الأولية المشتقة من DRG للفأر وإنشاء نموذجين للثقافة التكميلية: DRG المنفصلة ومزارع DRG المثبتة بالكامل ، والتي تسمح لنا بالتحقيق في تفاعلات الخلايا العصبية السرطانية على مستويات مختلفة من التعقيد. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه يمكن إنشاء كلا النوعين من الثقافة باستخدام DRGs المعزولة عن نفس ، مما يقلل من التباين بين والتجارب ويسمح بدمج المعلومات التي تم إنشاؤها من كل نموذج بسهولة أكبر ، مما يوفر رؤية أكثر شمولا لديناميكيات الخلية وتفاعلات الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف البروتوكول المقدم هنا طرقا محسنة لإنشاء مزارع الأعصاب الأولية 2D و 3D DRG وتطبيقها في الزراعة المشتركة مع الخلايا السرطانية. يتقدم هذا البروتوكول في الأساليب السابقة من خلال إنشاء النموذجين بالتوازي. نظرا لأنه يتم إنشاء نماذج ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد في نفس الوقت ، باستخدام الأعصاب الأولية المعزولة من نفس ، يتم تقليل التباين بين والتجارب إلى الحد الأدنى ، ويمكن مقارنة البيانات من كلا النموذجين بسهولة أكبر أو دمجها مما يسهل الملاحظات التكميلية للسلوك الخلوي واستجابات الأنسجة الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح تشغيلية من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-178274) (LMM) ، ومنحة أونتاريو للدراسات العليا (LCBO) ، ومنحة دراسية من تنسيق تحسين موظفي التعليم العالي - البرازيل (CAPES) - رمز التمويل 001 (ERP). LMM هو كرسي Bracken في علم الوراثة والطب الجزيئي في جامعة كوينز. تم إنشاء بعض الصور جزئيا باستخدام Biorender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>أدوات
70 µ م مصفاة الخليةبروجين71-229483-ULTتستخدم لتصفية تعليق الخلية
8 آبار الشرائح السفلية الزجاجيةإبيدي ، ميونيخ ، ألمانيا80807
دومون # 5 - ملقط ناعمأدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية11254-20
دومون # 5 ملقطأدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية11252-20
مقص ناعمأدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية91460-11
ملقط نمطأدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية91121-12
مقص الربيعأدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية91500-09
<قوية>كواشف
1x الفوسفات محلول ملحيسيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةD8662-500 ملتستخدم لإذابة الإنزيمات
مكمل B-27 (50x)ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية17504044تستخدم بتركيز 2٪ في وسائط F12
الكولاجين البقري من النوع الأولكورنينج إنكوربوريتد ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية354231تستخدم لطلاء الألواح ، حل العمل 50 & جم / مل في 0.01 م حمض الهيدروكلوريك
الكولاجيناز من النوع الرابعسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةC4-BIOCيذوب في PBS عند 1.25 مجم / مل ، aliquot ، يخزن عند -20 درجة ؛ C
Dispase IIروش ، بازل ، سويسرا4942078001يذوب في PBS عند 2.5 مجم / مل ، aliquot ، يخزن في -20 & درجة ؛ C
DNase Iروش ، بازل ، سويسرا.11284932001أضيف عند التركيز النهائي ل   0.2 مجم / مل أثناء التفكك
مصل الأبقار الجنينية (FBS)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةإف 1051يستخدم بتركيز 10٪ في وسائط F12
HBSS (محلول الملح المتوازن من هانك)سيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةH6648-500 ملمحضر ب 1٪ بنسلين - ستربتومايسين
انخفاض عامل نمو Matrigelكورنينج إنكوربوريتد ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية356231ذوبان الجليد عند 4 ° C بين عشية وضحاها ، استمر على الجليد
خليط المغذيات F-12 لحم الخنزيرسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةN6658-500 ملالوسيط القاعدي لإعداد وسائط الثقافة التكميلية
غراءروش ، بازل ، سويسرا.10108014001تذوب في PBS عند 30 وحدة / مل ، aliquot ، تخزن في -20 درجة ؛ C
البنسلين - الستربتومايسين (100x)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةP4333-100MLيستخدم بتركيز 1٪ في الوسائط
محلول تريبان الأزرقسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةT8154-100 مللتقييم صلاحية الخلية
TrypLE Expressثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية12605-028لحصاد الخلايا السرطانية
<قوي>الأجسام المضادة
β-Tubulin III الأجسام المضادةأبكام (كامبريدج ، المملكة المتحدة)AB15568التخفيف 1:200
أليكسا فلور 488ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةأ 11008التخفيف 1: 2000
أليكسا فلور 594ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةأ -21442التخفيف 1: 2000
أليكسا فلور 647ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةأ - 21245التخفيف 1: 2000
الجسم المضاد NeuNسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةماب 377التخفيف 1:100
<قوي> أصباغ وأصباغ الفلورسنت مجسات < / قوية>
كاشف ActinGreen 488 ReadyProbes (Phalloidin)ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية37110 راندالتخفيف 1:40
CellTrace كالسنين أحمر-برتقاليثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةج 34851يستخدم جهاز تعقب الخلايا لتصور الخلايا العصبية تحت المجهر الفلوري
هوشست 33342ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةهاتف H3570التخفيف 1: 5000

المراجع

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إنشاء نماذج في المختبر لثقافة العقد الجذرية الظهرية: مناهج تكميلية للتحقيق في الحديث المتبادل بين السرطان والأعصاب
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.