مقالة منهجية

التصوير عالي الضفجة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر الطيفي لتقليل مضان الأنسجة غير المحدد

DOI:

10.3791/68644

⸱

أكتوبر 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد التبييض التكراري الطيفي يمتد على تقنية IBEX الأساسية عن طريق إضافة حجب الهيبارين لتقليل الارتباط غير المحدد والاستفادة من الكشف الطيفي مع فك الخلط الحسابي لقمع التألق الذاتي. يعمل هذا النهج على تسريع الحصول على الصور مع تقليل مصادر الخلفية ، مما يتيح تحليلات بروتينية مكانية قوية متعددة الجولات وعالية المعلمات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التصوير متعدد الإرسال دراسة الخلايا المتنوعة وظيفيا ومنافذ عملها داخل بيئات الأنسجة الأصلية. التبييض التكراري يمتد التعدد (IBEX) هو تقنية تعطيل مناعية دورية وتفعيل الفلوروفور تسمح بتصور علامات متعددة في نفس قسم الأنسجة. يمكن تحليل الصور الملتقطة لاحقا للحصول على بيانات الخلية المفردة لتحديد مجموعات الخلايا وتوطينها وأنواع الخلايا المجاورة. يعتمد تفسير هذه البيانات على القدرة على التمييز بين تعبيرات العلامات الحقيقية ومصادر الخلفية المتأصلة في الفحص المجهري الفلوري. يدمج Spectral IBEX ، وهو تعديل لبروتوكول IBEX ، الكشف الطيفي متحد البؤر مع فك الخلط الحسابي ويتضمن حجب الهيبارين لتقليل الارتباط غير المستهدف القائم على الشحن. يعمل هذا المزيج على تحسين نسبة الإشارة إلى الخلفية ، ويمنع التألق الذاتي للأنسجة ، ويقلل من النزيف مع تقليل وقت الاستحواذ أيضا مقارنة بالتصوير متحد البؤر التقليدي متعدد المسارات. أظهر التطبيق على أنسجة الاورام الحميدة الأنفية البشرية ، وهو نموذج يتميز بمحتوى عال من الحمضات وتألق ذاتي قوي ، تصويرا موثوقا به ل 26 علامة عبر مقصورات هيكلية ومنعية وحالة خلية على مدار ست جولات تصوير. يولد سير العمل الناتج معلومات بروتينية عالية الأبعاد ومحلولة مكانيا تلتقط بنية الأنسجة المعقدة والمنافذ الخلوية. يوفر هذا النهج المحسن معا استراتيجية قوية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع للتصوير متعدد الإرسال ، وهي مناسبة بشكل خاص للأنسجة حيث يحد التألق الذاتي والتلوين غير المحدد من الأساليب التقليدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون الأنسجة من مجموعة متنوعة من الخلايا ذات الوظائف المتخصصة التي تنظم في هياكل ثلاثية الأبعاد ، ومن خلال التفاعل ، تنسق العمليات البيولوجية الضرورية للحياة. ينشأ علم الأمراض عندما تتداخل الاضطرابات في التركيب الخلوي أو بنية الأنسجة مع هذه التفاعلات وتعرض توازن الأنسجة للخطر1. مطلوب معرفة كيفية توطين أنواع الخلايا المتخصصة العديدة وتفاعلها داخل أنسجتنا من أجل فهم البيولوجيا التي تكمن وراء صحة الإنسان والأمراض.

كشف التقدم في تقنيات التنميط أحادي الخلية على مستويات النسخ والجينات والبروتينية عن تنوع استثنائي لأنواع الخلايا المتخصصة. 2،3 يمكن لتقنيات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وقياس التدفق الخلوي الطيفي قياس عدد المعلمات المطلوبة لتوصيف هذه المجموعات غير المتجانسة. ومع ذلك ، تفتقر هذه الأساليب إلى المعلومات المكانية ، حيث يجب فصل الخلايا عن بيئة الأنسجة الأصلية إلى معلقات أحادية الخلية4،5. على هذا النحو ، تم تحديد أنواع الخلايا المرتبطة بسياقات الأمراض المختلفة ، لكن تفاعلاتها داخل الأنسجة ومساهمتها في إدامة المرض لا تزال غير واضحة.

لمعالجة بعض هذه القيود ، تم تطوير العديد من تقنيات omics المكانية لالتقاط عدم التجانس الخلوي داخل الأنسجة مع الحفاظ أيضا على موضع كل خلية6. على سبيل المثال ، يمكن قياس نسخ الجينات إما عن طريق تضخيم الحمض النووي الريبي في البقع النقطية عبر قسم الأنسجة (على سبيل المثال ، Visium) أو باستخدام مجسات تهجين الحمض النووي الريبي التي تستهدف لوحة من الجينات المحددة التي يتم تصويرها بدقة خلية واحدة (على سبيل المثال ، Xenium) 7،8. هذه الطرق فعالة في تتبع أنماط النسخ والآليات التنظيمية داخل الأنسجة. ومع ذلك ، غالبا ما ترتبط ملفات تعريف النسخ ارتباطا سيئا بتعبير البروتين ، والذي يعكس بشكل مباشر القدرات الوظيفية للخلية9. يمكن التعرف على تعبير البروتين باستخدام أجسام مضادة محددة مقترنة بالفلوروفورات ، والتي يمكن اكتشافها عن طريق الفحص المجهري الفلوري10،11. يمكن أن يسمح استخدام الفحص المجهري الفلوري التقليدي بالتصوير المنفصل لما يزيد عن ستة من هذه الفلوروفورات المترافقة بالأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن ملامح الإثارة والانبعاث المتداخلة لهذه الفلوروفورات تؤدي إلى عدم اليقين فيما يتعلق بأصل إشارة التألق في أي قناة12 معينة.

التبييض التكراري يمتد تعدد الإرسال (IBEX) هو طريقة تصوير عالية المحتوى تم تطويرها للتغلب على هذا القيد في الفحص المجهري الفلوري13،14،15. يستخدم IBEX بوروهيدريد الليثيوم (LiBH4) لتعطيل الفلوروفورات كيميائيا بعد التصوير ، مما يسمح بإعادة تلطيخ عينة الأنسجة نفسها بجولة لاحقة من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور قبل إعادة التصوير. يحافظ IBEX على سلامة الأنسجة ، مما يتيح العديد من جولات التصوير لتصور عدد غير محدود من العلامات نظريا في نفس قسم الأنسجة. توفر المحاذاة الحسابية للصور المكتسبة توصيفا على مستوى omics بدقة خلية واحدة مع الحفاظ على البيانات المكانية للكشف عن المنافذ الخلوية. يمكن أن تكشف هذه البيانات أيضا عن تفاعلات خلوية مفترضة ، على الرغم من أنه يجب التحقق من صحتها باستخدام تقنيات أخرى16. IBEX هي طريقة مفتوحة المصدر متوافقة مع الفلوروفورات المتاحة تجاريا ويدعمها مجتمع دولي من الباحثين الذين قاموا بالتحقق من صحة الكواشف ومشاركة البيانات علنا لتعزيز إمكانية الوصول والتبني السريع وتوليد البيانات عالية الجودة17،18.

في هذا العمل ، تم تصميم بروتوكول معدل ل IBEX للتغلب على تحديين رئيسيين لهذه التقنية: التألق الذاتي للأنسجة والارتباط غير المحدد لمجسات الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروفور (يشار إليها مجتمعة باسم الخلفية). ينشأ التألق الذاتي عندما تنبعث من إثارة جزيئات الفلورسنت الداخلية للأنسجة ضوءا يتداخل مع الإشارة المطلوبة التي تم الحصول عليها من الفلوروفورات المقترنة بالأجسام المضادة19،20. ينتج عن الارتباط غير المستهدف أو غير المحدد للأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور التألق من الخلايا أو الهياكل التي لا تعبر عن البروتين المستهدف21،22. يمكن أن تؤدي هذه القطع الأثرية إلى استنتاج غير دقيق مفاده أن الخلية تعبر عن علامة لا تعبر عنها حقا ، مما يعقد التحليلات الحسابية والتعيين الدقيق لنوع الخلية. من خلال الجمع بين تحييد الشحنة القائمة على الهيبارين للإشارة خارج الهدف مع الاستحواذ الطيفي الكامل وعدم الخلط الحسابي ، يقلل IBEX الطيفي بشكل ملحوظ من النزيف ، ويحسن نسبة الإشارة إلى الخلفية (SBR) ، ويخفض وقت الاستحواذ إلى النصف لكل جولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع أنسجة الاورام الحميدة الأنفية المستخدمة في هذه الدراسة أثناء جراحة الجيوب الأنفية في هاميلتون للعلوم الصحية بموافقة أخلاقية من مجلس أخلاقيات البحث المتكامل في هاميلتون. تم الحصول على الموافقة المستنيرة من جميع المشاركين.

1. جمع العينات

  1. الحصول على عينات أثناء إجراءات استئصال السلائل الروتينية التي يتم إجراؤها على المرضى الذين يعانون من التهاب الجيوب الأنفية المزمن. عند الاستئصال الجراحي ، ضع العينات في قارورة تحتوي على محلول ملحي طبي على الثلج لنقلها وقم بمعالجتها على الفور للتصوير للحفاظ على سلامة الأنسجة.

2. إعداد الكاشف

  1. قم بإعداد محلول التثبيت والنفاذية عن طريق تخفيف محلول التثبيت والنفاذية الذي تم الحصول عليه عند 1: 4 في PBS. تحضير محلول الحفظ بالتبريد على شكل 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني. قم بإعداد مخزن مؤقت للتخفيف بنسبة 0.1٪ v / v Triton X-100 في PBS.
  2. قم بإعداد كاشف كتلة BSA على شكل 1٪ مع ألبومين مصل البقر في مخزن مؤقت للتخفيف. تحضير كاشف كتلة الهيبارين على شكل ملح الصوديوم 10KU Heparin في 1 مل من PBS. قم بإعداد المخزن المؤقت للحظر عن طريق خلط كاشف كتلة الهيبارين (1:50) مع كاشف كتلة Fc (1:100) في كاشف كتلة BSA.
  3. تحضير مزيج التلوين كجسم مضاد معاير عند التخفيفات المناسبة في المخزن المؤقت للسدود. قم بإعداد محلول التبييض بإضافة 10 مجم من LiBH4 في 10 مل من الماء فائق النقاء.

3. معالجة الأنسجة وزيادة

  1. افحص الأنسجة تحت مجهر التشريح (عادة عند التكبير ~ 15x ، على الرغم من أن هذا قد يختلف اعتمادا على العينة والمجهر) وإزالة الدهون والعظام باستخدام الملقط والمشرط. للحفاظ على الأنسجة بشكل أفضل ، استخدم أدوات نظيفة ، واعمل على سطح بارد ورطب ، وقلل من مدة المعالجة.
  2. > سمك الأنسجة الإجمالية 0.5 سم إلى شرائح 4-5 مم مع مشرط23. اغمر الشرائح في محلول التثبيت والنفاذية وقم بتدويرها عند درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم هذا المحلول والمحلول الآخر في الخطوة 3.3 حوالي 20 ضعف حجم العينة، في أنبوب بحجم مناسب.
  3. انقل المنديل إلى PBS واشطفه لمدة 5 دقائق. اغمر الأنسجة في محلول الحفظ بالتبريد واحتضان درجة مئوية لمدة 16 ساعة. لا تغسل بعد هذه الخطوة ، لأن ذلك سيعيد إدخال الماء إلى الأنسجة.

4. تجميد الأنسجة

  1. قم بتسمية طبق مكون من 6 آبار مع تفاصيل التجربة والعينة فوق كل بئر وضعه في فريزر -20 درجة مئوية ليبرد لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  2. املأ آلة تجميد بحجم مناسب بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT). تجنب تكوين فقاعات في OCT. اسحب أي فقاعات كبيرة إلى حواف آلة التبريد باستخدام إبرة أو طرف ماصة.
    ملاحظة: يمكن صنع آلة التبريد باستخدام ورق الألمنيوم الملفوف حول قارورة أو أنبوب صغير مسطح القاع.
  3. قم بإزالة الأنسجة من محلول الحفظ بالتبريد. ربت المنديل برفق على منديل خال من النسالة لإزالة السوائل الزائدة ، لأن ذلك قد يضر بالتجمد.
  4. املأ كوبا سعة 250 مل بحوالي 100-150 مل من الأيزوبنتان في غطاء دخان وضعه في صندوق رغوي أو مبرد مملوء جزئيا بالنيتروجين السائل.
    ملاحظة: يتبخر الأيزوبنتان إذا ترك مفتوحا لأكثر من 2 ساعة; يستخدم مباشرة بعد الفتح. يسهل الأيزوبنتان التجميد المتساوي والسريع للأنسجة. قد يتجمد الأيزوبنتان ببطء بمرور الوقت. إذا تجمد صلب ، أخرج الدورق من النيتروجين السائل واتركه يذوب. يمكن سكب الأيزوبنتان في زجاجة زجاجية بغطاء لإعادة استخدامه حتى 5 أضعاف. يجب أن يكون مستوى الأيزوبنتان أعلى من النيتروجين السائل لمنع الدورق من الطفو أو الانقلاب.
  5. اضبط اتجاه الأنسجة حسب الرغبة داخل OCT تحت مجهر التشريح.
    ملاحظة: بالنسبة لأنسجة الاورام الحميدة الأنفية ، عادة ما نوجه العينة على طول محورها الطويل للحصول على أقسام متناظرة تلتقط أكبر مساحة مقطعية ممكنة. استشر كتيبات الأنسجة للأنسجة ذات الأهمية للحصول على اتجاه التضمين الأمثل.
  6. اغمس الجزء السفلي من المبرد في الأيزوبنتان. قم بإزالة المبرد من الأيزوبنتان عندما يكون مركز الأنسجة أبيض بالكامل ومعتم. تجنب غمر العفن بالتبريد تماما ؛ قد تتصدع الكتلة ، مما يضر بالتقسيم.
  7. أخرج الكتلة برفق من آلة التبريد عن طريق الضغط على الظهر وضعها في صفيحة 6 آبار مبردة مسبقا عند -20 درجة مئوية. بعد تجميد جميع العينات ، انقل اللوحة إلى ثلاجة -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
    ملاحظة: هذه نقطة توقف. يمكن تخزين الأنسجة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لسنوات.

5. تحضير الشرائح والتقسيم بالتبريد

  1. ماصة 10-1 ميكرولتر من لاصق جيلاتين الشب الكروم على الشرائح ؛ يوزع بالتساوي ويجف في الهواء لمدة 15 دقيقة. للحصول على الالتصاق الأمثل ، ضع لاصق جيلاتين الشب الكروم على أكواب الغطاء ذات الغرف 2x-3x ، مع إضافة 5 ميكرولتر لكل تطبيق (إجمالي 15 ميكرولتر).
  2. بعد التجفيف ، ضع الشرائح في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لضمان التجفيف الكامل. في حالة استخدام غطاء زجاجي بغرفة ، اتركه ليجف عند 37 درجة مئوية طوال الليل ، حيث قد يذوب البلاستيك عند 80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بمجرد طلاء الشرائح وتجفيفها ، يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام حتى يتم استخدامها. يجب تغطيتها لتجنب الغبار.
  3. نقل الأنسجة من -80 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية (أو إلى التبريد عند درجة حرارة القطع) لتكون متوازنة ، وتبريد مسبق لمدة ساعة واحدة قبل التقسيم. قطع أقسام 10-2 ميكرومتر على cryostat24.
    1. في حالة التقسيم إلى غطاء زجاجي بغرفة ، التقط القسم برفق باستخدام الملقط بعد رفع اللوحة المضادة لللف. استخدم فرشاة رسم لوضعها بشكل مسطح على الزجاج داخل الغرفة. اضغط على الإبهام أسفل العينة الموجودة أسفل زجاج الغطاء لإذابة القسم على الزجاج.
  4. الشرائح الجافة عند 3 درجات مئوية لمدة 1 ساعة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام الشرائح على الفور ، فيمكن تخزينها مؤقتا في درجة حرارة الغرفة في صندوق شرائح لحمايتها من الغبار أثناء التحضير للتلطيخ. ومع ذلك ، إذا لم يتم استخدامها على الفور ، فقم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية للحفاظ على سلامة الأنسجة. هذه نقطة توقف. إذا تم تخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية ، فيمكن إيقاف العملية مؤقتا هنا.

6. حجب ووضع العلامات المناعية للأجسام المضادة

  1. ارسم دائرة على الزجاج حول الأنسجة باستخدام قلم PAP لإنشاء حاجز كاره للماء يحتوي على السائل أثناء التلوين أو خطوات أخرى. لا ترسم فوق OCT ، لأن الحبر الكارهة للماء سوف يغسل عندما يذوب OCT.
    ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية لزجاج الغطاء الموجود في الحجارة ، حيث تحتوي الجدران على السائل في البئر.
  2. أضف ~ 100 ميكرولتر من PBS إلى كل نسيج واحتضنه لمدة ~ 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإعادة ترطيب الأنسجة وغسلها في OCT. استخدم ~ 1 مل من PBS لزجاج الغطاء الغرفي.
    ملاحظة: لتجنب رفع الأنسجة من الزجاج، لا تضع سائل الماصة مباشرة على العينة.
  3. استنشق PBS وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. احتضان في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة مغطاة لمدة 1 ساعة. استخدم ~ 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لزجاج الغطاء الدائري.
  4. استنشق المخزن المؤقت الحجب وأضف 100 ميكرولتر من مزيج التلوين. احتضن في حجرة رطوبة مغطاة ، توضع داخل الثلاجة (4 درجات مئوية) طوال الليل. استخدم ~ 400 ميكرولتر من مزيج التلوين لزجاج الغطاء الغرفي. قم بإعداد أقسام ملطخة بواحد فقط من الفلوروفورات في اللوحة ، وتحكم سلبي بدون أي بقع ، لتحديد طيف الفلوروفورات والتألق الذاتي للأنسجة.
    ملاحظة: يجب تحسين تخفيفات الأجسام المضادة تجريبيا عن طريق المعايرة إلى 1:50 و1:100 و1:200 أو تخفيف آخر حسب الحاجة. اختر الحد الأدنى من الجسم المضاد الذي ينتج عنه الإشارة المثلى. اهدف إلى أن تكون شدة جميع الأجسام المضادة في اللوحة مكافئة تقريبا لزيادة فعالية فك الخلط الطيفي إلى أقصى حد. حماية العينات من الضوء بعد هذه الخطوة لتقليل التبييض الضوئي للفلوروفورات.
  5. اسحب مزيج التلوين واغسل 3 مرات باستخدام PBS (10 ميكرولتر ، دقيقتان لكل منهما) ، سائل شفط بين كل غسلة. استخدم ~ 1 مل من PBS لزجاج الغطاء الغرفي.
  6. أضف ~ 10 ميكرولتر من وسائط التركيب إلى كل قسم. ماصة ببطء لتجنب فقاعات الهواء التي ستخلق انحرافات بصرية أثناء التصوير. استنشق أي فقاعات تتشكل باستخدام ماصة. بالنسبة لزجاج الغطاء الموجود بالحجرات ، أضف 1 مل من وسائط التثبيت إلى كل بئر.
    ملاحظة: الخطوات التالية ، 6.7 و 6.8 ، ليست مطلوبة لزجاج الغطاء الداخلي.
  7. ضع برفق غطاء زجاجي رقم 1 22 مم × 50 مم على العينة.
    ملاحظة: يمكن تقليل الفقاعات عن طريق الضغط بإحكام على أحد طرفي زجاج الغطاء على وسائط التثبيت والسماح للزجاج بالسقوط على العينة، ونشر الوسيط بالتساوي. يجب أن يتطابق سمك زجاج الغطاء مع مواصفات العدسة الشيئية (على سبيل المثال ، # 1.5 غطاء لمعظم أهداف الفتحة العددية العالية). إذا كانت العدسة الشيئية تحتوي على طوق تصحيح، فتأكد من ضبطها وفقا لحجم الانزلاق الصحيح للغطاء. يمكن أن يتسبب استخدام إعداد السماكة أو الياقة الخاطئ في حدوث انحراف كروي ويؤدي إلى عدم وضوح الصور أو تشويهها.
  8. اقلب الشريحة واضغط برفق على منديل خال من النسالة لدفع وسيط التثبيت الزائد.
    ملاحظة: تجنب الضغط لأسفل بقوة كبيرة على الشريحة. قد تؤدي القوة المفرطة إلى إتلاف الأنسجة أو تشويهها ، مما قد يؤثر على المحاذاة بين جولات التصوير.

7. إعداد المجهر والتصوير

ملاحظة: يشير هذا البروتوكول على وجه التحديد إلى ZEISS LSM980 وأنظمة ZEISS الأخرى. قد تختلف هذه الخطوات في الأنظمة الأخرى. يتم تفصيل اثنين من تدفقات العمل: التقليدية متحد البؤر + فك الخلط (اكتساب متعدد المسارات مع فك الخلط الطيفي الحسابي اللاحق) ، والذي يمكن استخدامه عندما لا يكون الكاشف الطيفي متاحا ، ولكن له أوقات اكتساب أطول وبعض النزيف المتبقي ؛ والكشف الطيفي الكامل (اكتساب طيفي أحادي التمرير ، 34 قناة) ، طريقتنا المفضلة ، لأنها توفر أفضل SBR ، والحديث المتبادل القريب من الصفر ، وأسرع أوقات التصوير.

  1. الفحص المجهري متحد البؤر التقليدي
    1. قم بتشغيل نظام المجهر (بما في ذلك الليزر والكاشفات والكمبيوتر) قبل التصوير بحوالي 30 دقيقة.
    2. في شاشة التحكم في المجهر التي تم الوصول إليها بالنقر فوق Microscope > Goals ، حدد العدسة الشيئية المناسبة (على سبيل المثال ، 20 × 0.8 NA) وقم بتنظيفها بمسح آمن للعدسة إذا لزم الأمر.
    3. قم بتركيب العينة بإحكام على المسرح. حاول محاذاة الزجاج أو تغطية الغرفة الزجاجية مقابل نفس الزاوية / نهاية حامل الشريحة لتسهيل محاذاة XY للجولات المتتالية. سيعتمد هذا على الحامل المثبت.
    4. ركز على العينة باستخدام العدسات على إضاءة GFP أو YFP أو RFP، ثم قم بالتبديل إلى علامة التبويب Acquisition (اكتساب) على شاشة الكمبيوتر.
      ملاحظة: لا تستخدم مرشح DAPI عند تركيز العينة باستخدام العدسات لأن تعريض صبغة DAPI للأشعة فوق البنفسجية (باستخدام مكعب مرشح DAPI) سيؤدي إلى تحويلها ضوئيا إلى جزيء فلورسنت أخضر (الشكل التكميلي 1 أ).
    5. قم بتكوين مسارات التصوير التي تقلل من التداخل والإثارة بالليزر المتقاطع (الجدول التكميلي 1 ، الجدول التكميلي 2 يشير إلى إعدادات الاستحواذ لتجارب الفحص المجهري متحد البؤر التقليدية الموضحة هنا).
      ملاحظة: تتضمن التركيبات المثالية قمم مثيرة وانبعاث مميزة ، مثل DAPI أو AF488 مع AF594 أو AF647 أو AF700.
      1. قم بتعيين ليزر (ليزر) الإثارة الأمثل لكل مسار. اضبط حجم الثقب على 1 AU أو وحدة التهوية لكل مسار للحصول على التقسيم البصري الأمثل.
      2. اضبط نطاق الطول الموجي للاكتساب لكل كاشف قابل للضبط في المسار على حدة ، وفقا للفلوروفورات للمسار.
      3. اضبط إعدادات طاقة الليزر وكسب الكاشف لزيادة SBR إلى أقصى حد. تأكد من أن عددا قليلا جدا من وحدات البكسل ، إن وجدت ، تصل إلى أقصى شدة.
        ملاحظة: لتجنب التبييض الضوئي و / أو الإفراط في تعريض أجهزة الكشف ، حافظ على طاقة الليزر منخفضة قدر الإمكان. تحسين تخفيفات الأجسام المضادة بحيث يتم اكتشاف إشارة قوية فوق الخلفية.
    6. اضغط على زر وضع المسح المستمر لمعاينة العينة وتعيين معلمات المسح الضوئي (سرعة المسح والدقة والمتوسط إذا لزم الأمر).
      ملاحظة: بالنسبة للبلاط الصغير ولتقليل الخلفية ، يوصى بوقت مكوث بين 0.2-0.3 ميكرو ثانية ، مع 1-2 جولة متوسطة. لزيادة السرعة إلى أقصى حد مع الحفاظ على التجزئة ودقة الخلية الواحدة، استخدم أسرع سرعة مسح ضوئي دون متوسط وحجم بكسل يبلغ 0.2-0. ميكرومتر/بكسل. على سبيل المثال ، ينتج عن التصوير بدقة 2048 × 2048 بكسل لكل بلاطة بهدف 20x / 0.80 NA 0.20 ميكرومتر / بكسل على حقل 424.26 × 424.2 ميكرومتر2.
    7. قم بإجراء عمليات فحص تجريبية لكل مسار للتحقق من الحديث المتبادل أو النزيف.
      1. على الشريحة الملطخة بجميع العلامات ، في وضع المسح المستمر ، ابدأ تشغيل كل ليزر بطاقة منخفضة وارفعه فقط حتى تصبح العلامة مرئية بوضوح دون تشبع (استخدم مؤشر LUT / التشبع).
        ملاحظة: إذا أمكن ، يوصى باستخدام عينة مكررة أو منطقة غير مرغوب فيها لتحسين إعدادات المجهر قبل تصوير العينة التجريبية. هذا مهم بشكل خاص عند التلوين ب DAPI (لتجنب خطر التحويل الضوئي) أو الفلوروفورات التي يتم تبييضها ضوئيا بسرعة (على سبيل المثال ، PE).
      2. انتقل إلى عنصر التحكم أحادي اللون لهذا الفلوروفور. اضبط طاقة الليزر وكسب الكاشف بحيث تكون الإشارة ساطعة وغير مشبعة.
      3. على نفس الشريحة الملوثة ، امسح جميع قنوات الكشف الأخرى. إذا تجاوزت شدة خارج القناة الخلفية ، فقم بتضييق نافذة الاكتشاف و / أو تقليل الإثارة / الكسب.
      4. كرر 7.1.7.1-7.1.7.2 لكل فلوروفور. بعد أي تعديل ، تحقق لفترة وجيزة من البقع المحسنة مسبقا للحفاظ على الشدة قابلة للمقارنة ، خاصة بالنسبة للعلامات التي يتم توطينها.
    8. قم بتمكين ميزة اللوحات وتحديد منطقة اكتساب اللوحات
      1. تحسين التركيز لمنطقة اكتساب البلاط في مركز الأنسجة. ابحث عن ميزة فريدة (مجموعة من الخلايا بترتيب معين) كمرجع للمحاذاة في الجولات اللاحقة.
    9. قم بتمكين ميزة Z-stack وانتقل إلى علامة التبويب Z-stack. انتقل إلى علامة التبويب "المركز". اضبط عدد الشرائح في المكدس Z على 6 على الأقل، بفاصل زمني لا يقل عن 1 ميكرومتر بين الشرائح. ثم انقر فوق الزر Center لوضع نقطة التركيز البؤري الحالية (المحددة في الخطوة 6.1.8.1) كشريحة وسط من المكدس.
    10. انقر فوق الزر بدء التجربة لبدء الحصول على الصور. احفظ إعدادات الاكتساب وقم بعمل نسخة احتياطية من بيانات الصورة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة المصغرة للصورة وتحديد حفظ باسم. ثم اختر موقع الملف وقم بتسمية الصورة.
    11. قم بفك مزج الصورة باستخدام نفس الإعدادات المحسنة من اكتساب المنطقة المتجانبة، والتقط لقطة من كل عنصر تحكم ملطخ أحادي للحصول على طيف الإشارة الحقيقي ومن عنصر التحكم غير الملون لالتقاط التألق الذاتي/التألق الذاتي، المحضر في الخطوة 6.4.
      1. تستخدم هذه الصور لفك الخلط الطيفي. لا تحدد True Signal من العينات متعددة الإرسال. تأكد من أن المنطقة المحددة تمثل الإشارة حقا من خلال التأكد أولا من غياب الشدة / التشكل أو ما يعادل الخلفية في عنصر التحكم غير الملوث ثم مطابقة التوطين المتوقع للعلامة (على سبيل المثال ، الغشاء مقابل الأنماط النووية مقابل السيتوبلازم مقابل الأنماط المفرزة).
      2. افتح الصورة السريعة. انقر فوق علامة التبويب Unmix . استخدم إحدى أدوات تحديد المنطقة ضمن علامة التبويب أدوات Unmix لرسم عائد استثمار حول الإشارة الموجبة (سيظهر طيف من تلك المنطقة). كرر هذا لكل صورة مفاجئة لكل فلوروفور لإنشاء أطياف مرجعية لفك الخلط.
        1. قارن هذا الطيف بالطيف النظري للفلوروفور للتأكد من أن المنطقة المختارة تمثل الإشارة الحقيقية. قم بتسمية الطيف وفقا لكل فلوروفور واحفظه في قاعدة البيانات الطيفية.
          ملاحظة: يمكن تحديد طيف التألق الذاتي ومعالجته على أنه فلوروفور منفصل لفك مزجه عن الإشارات الأخرى. عند التحسين الكامل للوحة ، لا يلزم الحصول على مراجع جديدة ، حيث يمكن للمرء إعادة استخدام نفس الإعدادات طالما يتم استخدام نفس البروتوكول ونوع الأنسجة.
      3. قم بتحميل الصورة المتجانبة وانتقل إلى أداة فك المزج. استخدم الزر + لإضافة الأطياف المرجعية لكل فلوروفور إلى قائمة فك المزج ، ثم انقر فوق الزر فك الخلط الخطي .
    12. احفظ الصورة غير المختلطة لتحليلها لاحقا.
      ملاحظة: الإخراج عبارة عن صورة متعددة المربعات مع قناة لكل علامة. يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا قبل المتابعة.
    13. الحصول على صورة مرجعية للتظليل
      1. باستخدام نفس الإعداد الدقيق المستخدم لتصوير العينة، احصل على صورة لشريحة معايرة DAPI. احفظ الصورة، ثم استخرج قناة DAPI فقط لتكون بمثابة مرجع التظليل. الإخراج عبارة عن صورة حقل مسطح (الشكل التكميلي 1 ب).
        ملاحظة: لا يلزم الحصول على صورة مرجعية لكل عينة. طالما تم استخدام نفس الأداة بنفس الإعدادات ، يجب أن يكون المرجع هو نفسه. ليست هناك حاجة لهذا المرجع إذا لم تحتوي الصور المكتسبة على قطع أثرية تظليل ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1C.
  2. المجهر متحد البؤر الطيفي
    1. قم بتشغيل نظام المجهر (بما في ذلك الليزر وأجهزة الكشف والكمبيوتر). حدد العدسة الموضوعية المناسبة (على سبيل المثال ، 20 × 0.8 NA ، أو أي هدف آخر) وقم بتنظيفها إذا لزم الأمر.
    2. قم بتركيب العينة بإحكام على المسرح. تأكد من أن غطاء الغطاء يواجه الهدف.
    3. ركز على العينة باستخدام الحقل الساطع أو DIC ، ثم قم بالتبديل إلى وضع التألق. تكوين الاستحواذ الطيفي. يشير الجدول التكميلي 3 إلى إعدادات الاستحواذ لتجارب الفحص المجهري طيفي متحد البؤر الموضحة هنا.
      1. قم بتعيين أشعة الليزر الصحيحة.
        ملاحظة: يمكن لبعض أشعة الليزر أن تثير العديد من الفلوروفورات. لذلك ، قد لا يكون من الضروري أن يكون لديك ليزر فريد لكل فلوروفور.
      2. حدد مقسم شعاع مناسب لخطوط الليزر المستخدمة. تمكين جميع أجهزة الكشف من التقاط أكبر قدر ممكن من الطيف. اضبط حجم الثقب على 1 AU للحصول على التقسيم البصري الأمثل.
    4. تحسين إعداد الليزر
      1. باستخدام قسم ملطخ بجميع العلامات ، ابدأ وضع المسح المستمر باستخدام الليزر بطاقة منخفضة. اضبط شدة كل ليزر حتى يمكن تحديد العلامات في SBR جيد.
        ملاحظة: على الرغم من أن هذا لن يسمح بالضبط الدقيق للفلوروفورات المتداخلة طيفيا ، إلا أنه سيساعد في تقليل عدد المرات التي يجب فيها تبديل الشرائح الملوثة على المجهر.
      2. استخدم أقساما أحادية البقعة لضبط شدة الليزر لكل فلوروفور. قم بالتبديل بشكل متكرر من الأقسام أحادية البقعة إلى القسم الذي يحتوي على جميع العلامات حتى يمكن تصور إشارة كل علامة دون زيادة التشبع.
        ملاحظة: في كل مرة يتم فيها ضبط شدة الليزر أو إعداد الكسب ، أعد النظر في الشرائح أحادية البقعة المحسنة مسبقا لضمان بقاء الإشارة مثالية. من أجل فك الخلط الأمثل ، يجب أن تكون مستويات شدة الإشارة متشابهة قدر الإمكان بين العلامات ، خاصة بين العلامات التي تتحالب مع الموقع. إذا أمكن ، يوصى باستخدام عينة مكررة أو منطقة غير مرغوب فيها لتحسين إعدادات المجهر قبل تصوير العينة التجريبية. هذا مهم بشكل خاص عند التلوين ب DAPI (لتجنب خطر التحويل الضوئي) أو الفلوروفورات التي يتم تبييضها ضوئيا بسرعة (على سبيل المثال ، PE).
    5. قم بتنفيذ الخطوات 7.1.8 - 7.1.14.

8. إزالة غطاء الغطاء (ينطبق فقط على الشرائح ، وليس زجاج الغطاء الغرفي)

  1. اغمر الشريحة في PBS واسمح للغطاء بالفصل. لا تحاول إجبار الغطاء على الانزلاق ، لأن هذا قد يؤدي إلى تشويه الأنسجة ، مما يتسبب في حدوث مشكلات في المحاذاة في جولات التصوير اللاحقة أو الانفصال التام عن الشريحة. استخدم حاوية كبيرة بما يكفي لتناسب الشريحة وتأكد من إمكانية غمرها بالكامل في PBS.

9. تبييض الفلوروفور وركوب الدراجات

  1. لزجاج الغطاء الموجود في الغرف فقط: قم بشفط أكبر قدر ممكن من وسائط التثبيت باستخدام ماصة، مع الحرص على عدم تلف الأنسجة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي إمالة الحجرة إلى الجانب إلى تسهيل الشفط.
  2. اغسل 3 مرات باستخدام ~ 1 مل (غطاء زجاجي بغرفة) أو ~ 100 ميكرولتر (شرائح) من PBS لمدة دقيقتين حتى تتم إزالة وسائط التثبيت تماما.
  3. تحضير محلول التبييض في غطاء الدخان. تزن 10 مجم LiBH4 مباشرة في دورق جاف باستخدام ملعقة صغيرة. أضف بعناية 10 مل من الماء عالي النقاء مباشرة إلى الدورق الذي يحتوي على LiBH4 واخلطه حتى يذوب تماما لعمل محلول التبييض.
    ملاحظة: استعد مباشرة قبل الاستخدام للحصول على أقصى قدر من التفاعل.
    تنبيه: LiBH4 قابل للاشتعال للغاية ، لذا تتطلب هذه الخطوة عناية فائقة - تأكد من استخدام غطاء الدخان بشكل صحيح (على سبيل المثال ، وشاح على ارتفاع مناسب ، ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة ، وما إلى ذلك) والعمل فقط مع <10 مجم من LiBH4 في المرة الواحدة. تأكد من جفاف الدورق تماما قبل إضافة LiBH4 - قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى نشوب حريق.
  4. أضف ~ 100 ميكرولتر من محلول التبييض ، باستخدام ماصة باستور زجاجية ، إلى كل قسم من الأنسجة واحتضان في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة. استخدم 2 مل من محلول التبييض لشرائح الغرفة.
  5. في حالة تبييض أصباغ BV (على سبيل المثال ، BV421 ، BV510 ، إلخ) ، انقل البئر بعناية إلى مجهر فوق الفلورسنت. حدد مرشح DAPI ، وركز العينة ، وأضيئها بكامل طاقتها.
    1. استخدم هدف 5x للحصول على مجال إضاءة أكبر. قم بخفض المسرح إلى أدنى مستوى ممكن لمنع تلف الأهداف والسكن.
  6. صب محلول LiBH4 من البئر باستخدام ماصة باستور زجاجية وأضفها مرة أخرى إلى دورق محلول LiBH4 .
    ملاحظة: هذه هي الآن نفايات LiBH4 ؛ لا يمكن تخزين الحل للاستخدام في المستقبل.
  7. اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام مخزن التخفيف واحتضان لمدة ~ 3 دقائق. الحجم الإجمالي 2 مل لشرائح الغرفة.
  8. أضف مزيج الأجسام المضادة والبقع وفقا للبروتوكول العادي (الخطوات 6.3 - 6.8).
  9. أضف 2N H2SO4 بالتنقيط إلى نفايات LiBH4 في غطاء الدخان ، واخلطه بانتظام.
    تنبيه: سوف تنفجر LiBH4 بقوة. هذه الفقاعات هي غاز H2 يتم إطلاقه من LiBH4. H2 قابل للاشتعال للغاية ، لذا توخ الحذر الشديد في هذه الخطوة وأضف H2SO4 ببطء شديد.
  10. اسكبه في وسادة سفلية ماصة عندما يتوقف المحلول عن الفقاعات. اشطف الدورق بالماء فائق النقاء واسكبه في الوسادة السفلية الماصة.
    تنبيه: ضع الوسادة السفلية الماصة في كيس كيميائي / بيولوجي ، وقم بتثبيته ، وتخلص منه وفقا لإرشادات المخاطر الكيميائية المحلية.

10. معالجة ما بعد اقتناء الصور

  1. افتح الصورة المرجعية (من الخطوة 7.1.14) في برنامج Zen بالنقر فوق ملف > فتح > حدد الصورة المرجعية.
    ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك تنفيذ خطوات معالجة الصور بعد الاقتناء في حزم برامج مفتوحة المصدر. (على سبيل المثال ، ImageJ).
  2. اضبط السطوع والتباين لتحسين النطاق الديناميكي بالنقر فوق معالجة > شدة > تمدد التباين > تلقائي > تطبيق.
  3. قم بتغيير نوع البكسل إلى 32 بت بالنقر فوق معالجة > الصورة > تحويل نوع البكسل > 32 بت (تعويم).
  4. قم بتسوية الصورة المرجعية بالنقر فوق معالجة > شدة > تطبيع (وحدات البكسل المشبعة = 0٪) > تطبيق.
  5. قم بتنعيم الصورة المرجعية بالنقر فوق معالجة > > التسليم > Gaussian إدخال نصف القطر (على سبيل المثال ، 2-5 بكسل) > تطبيق (الشكل التكميلي 1 ب).
    ملاحظة: قم بتحسين نصف قطر التمويه الغاوسي عن طريق تجربة قيم مختلفة. لمعرفة القيمة الصحيحة ، قم بتقسيم (العملية > حاسبة الصورة) ، يجب أن يكون للصورة المرجعية الأولية على الصورة المعالجة والصورة الناتجة كثافة موحدة (جميع وحدات البكسل بنفس القيمة تقريبا).
  6. افتح الصورة متعددة المربعات المراد تصحيحها بالنقر فوق ملف > فتح > حدد صورة متعددة البلاطات.
  7. قم بتطبيق تصحيح الخياطة والتظليل باستخدام المرجع المعالج بالنقر فوق معالجة > خياطة بالمعلمات التالية.
    1. حدد مربع المزج. حدد مربع التظليل الصحيح ومن القائمة المنسدلة اختر الصورة المرجعية التي تمت معالجتها (الخطوة 10.5). حافظ على جميع المعلمات الأخرى كما هي.
      ملاحظة: قد تحتاج المعلمات إلى ضبط للحصول على أفضل النتائج.
    2. في قائمة الإدخال/الإخراج، اختر الصورة متعددة المربعات كإدخال ومرجع التظليل كمرجع.
    3. اضغط على الزر "تطبيق" في الجزء العلوي ، وسيتم إنشاء صورة جديدة مع تصحيح الخياطة والتظليل (الشكل التكميلي 1D).
      ملاحظة: يعد تصحيح الخياطة (الشكل التكميلي 1I-J) ضروريا لضمان دقة محاذاة الصورة لاحقا في العملية.
    4. احفظ الصورة المصححة بالنقر فوق ملف > حفظ > حدد مجلد.

11. محاذاة الصورة

  1. قم بتحويل الصور المعالجة من أي تنسيق تكون به (.czs ، .tif ، إلخ) إلى تنسيق Imaris باستخدام أداة Imaris File Converter.
    ملاحظة: يمكن تنزيل الأداة وتثبيتها باتباع الإرشادات الموجودة على موقع الويب هذا (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
  2. قم بتشغيل أداة تسجيل امتدادات Imaris لتسجيل (محاذاة) الصور من جميع الجولات في صورة واحدة مع جميع القنوات.
    ملاحظة: لتثبيت الأداة ومحاذاة الصور بنجاح، اتبع الإرشادات الموجودة على موقع الويب التالي (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. انقر فوق الزر "ملحقات Imaris ". حدد SimpleITK Utilities > تصدير إعدادات القناة إلى CSV.
  4. انقر فوق استعراض، وانتقل إلى صورة .ims (من إحدى الجولات)، وحددها، وانقر فوق فتح.
  5. انقر فوق تصدير واختر موقعا لحفظ ملف CSV. أدخل اسما وانقر على حفظ.
  6. افتح ملف CSV المحفوظ وتحقق من صحة أسماء القنوات. عدل إذا لزم الأمر.
  7. إذا تم إجراء تعديلات، فانتقل إلى ملحقات Imaris > SimpleITK Utilities > Batch Configure Channel Settings.
    ملاحظة: هذه الخطوة غير مطلوبة إذا لم يتم إجراء أي تعديلات في الخطوة السابقة.
  8. انقر فوق استعراض، وانتقل إلى ملف CSV، وحدده، وانقر فوق فتح. انقر فوق التالي ، ثم تصفح مرة أخرى لتحديد نفس صورة .ims وانقر فوق فتح.
  9. انقر فوق تكوين لتطبيق التغييرات. كرر الخطوات من 11.3 إلى 11.8 لجميع الصور من جولات مختلفة.
  10. بمجرد تسمية القنوات بشكل صحيح ، انتقل إلى امتدادات Imaris > خوارزميات SimpleITK > تسجيل Affine ل Z-Stacks باستخدام قناة مشتركة.
  11. انقر فوق استعراض، وانتقل إلى المجلد الذي يحتوي على جميع الجولات، وحدد جميع الصور، وانقر فوق فتح.
  12. انقر فوق التالي ، وحدد قناة التسجيل (القناة الإيمانية). بالنسبة لهذا البروتوكول، تم استخدام قناة DAPI. ثم اختر الصورة الثابتة.
    ملاحظة: اختر قناة / علامة تظل ثابتة عبر الجولات ومقاومة للتبييض الكيميائي أو الضوئي (على سبيل المثال ، الأصباغ النووية مثل DAPI). ثم اختر الصورة الثابتة.
  13. انقر فوق إعدادات التسجيل المتقدمة، وحدد جميع المربعات باستثناء القناع التلقائي، واضبط سيجما التجانس الغوسي على 5.0.
  14. انقر فوق تم، ثم تسجيل لإجراء المحاذاة. بمجرد اكتمال التسجيل، انقر فوق إعادة تشكيل وحفظ الصورة المجمعة.
  15. بعد إعادة التسميت، حدد القناة الإيمانية وانقر فوق حساب الارتباط. تتضمن ملفات الإخراج صورة output.ims محاذاة ، وملزمين PDF يظهران جودة المحاذاة قبل التسجيل وبعده ، وملف JSON يحتوي على الإعدادات المستخدمة للتسجيل ، وملف TXT مع سجل العملية بأكملها.

12. محاذاة الصورة

  1. تقسيم الخلايا/الكائنات باستخدام CellPose (الإصدار 2.5)25
  2. لكل مجموعة بيانات أحادية البقعة، قم بإنشاء قناع تجزئة واحد من قناة الكشف الخاصة بالعلامة (مثال: بالنسبة للبقعة المفردة CD20، قم بإنشاء القناع من قناة الكشف AF488 (القناة المقصودة ل CD20)).
  3. تطبيق قناع التجزئة من الخطوة 2 على كل قناة في نفس مجموعة البيانات (في مثال CD20، يتم تطبيق القناع المشتق من AF488 على AF488 لقياس الإشارة الحقيقية وعلى جميع قنوات الكشف الأخرى لقياس النزيف).
  4. استخرج شدة ومناطق لكل كائن في Python باستخدام scikit-image (regionprops_table) و NumPy.
  5. نسبة الإشارة إلى الخلفية (SBR)
    1. احسب متوسط كثافة الكائن عبر جميع عائد الاستثمار المجزأ في قناة الكشف المقصودة للعلامة.
    2. حدد شدة الخلفية على أنها متوسط شدة جميع وحدات البكسل خارج عائد الاستثمار في نفس مجال الرؤية ، باستثناء الحشو ذي القيمة الصفرية أو وحدات البكسل خارج الحدود.
      احسب SBR على النحو التالي:
      figure-protocol-1
    3. تصور توزيعات SBR باستخدام مخططات الكمان ، وإظهار قيم كل كائن كنقاط (أو قيم لكل حقل عند الإشارة إليه).
  6. القياس الكمي للنزيف
    1. لكل قناة غير مقصودة، قم بحساب النزيل من خلال (٪) باستخدام نفس عائد الاستثمار من القناع في الخطوة 12.2:
      figure-protocol-2
    2. ملاحظة: المدخلات القطرية تساوي 100٪، لأن البسط والمقام متطابقين في القناة المقصودة لصورة ذات صبغة واحدة (إشارة العلامة الحقيقية تقاس في قناتها الخاصة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك تحديان أساسيان يواجههما تقنيات التصوير التألقي المناعي هما الارتباط غير المحدد لمجسات الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروفور والتألق الذاتي للأنسجة. تم تصميم هذا البروتوكول للمساعدة في تمييز إشارة حقيقية من الخلفية لتحسين تقنيات التألق المناعي متعدد الإرسال.

يقلل حجب الهيبارين من ارتباط الفلوروفور غير المحدد مع الحفاظ على الإشارة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعالج Spectral IBEX ، وهو تكيف لبروتوكول IBEX ، بنجاح مشكلتين رئيسيتين في التصوير المناعي: الربط غير المحدد والتألق الذاتي. أدى علاج الأنسجة شديدة اليوزينيات بالهيبارين واستخدام فك الخلط الطيفي للقضاء على التألق الذاتي والتداخل الطيفي بين القنوات إلى زيادة كبيرة في اكتشاف الإشارة الحقيقية فوق الخلفية. يؤدي التقاط جميع العلامات في مسار واحد إلى تقليل وقت الاستحواذ ، مما قد يزيد من معدل دورة IBEX. بينما يمكن استخدام الاستحواذ متحد البؤر التقليدي مع فك الخلط الحسابي في حالة عدم توفر أجهزة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتلقى JFEK ، MJ تمويلا من ALK Abello A / S. تتلقى JFEK رسوم استشارة من Merida Biosciences.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورين أندريا رادتك وزيف يانيف على دعمهم أثناء الإعداد والتكرار على IBEX. نشكر الدكتورين جواو برونز دي فيرمينو ومهند بابي على دعم الفحص المجهري واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، ومركز الفحص المجهري الضوئي المتقدم في ماكماستر للوصول إلى مجاهرهم. نشكر تينا ووكر وجيان بينغ وين ورانجانا تالبي جورجي على الدعم الفني. يتم دعم هذا العمل من خلال منحة أبحاث حساسية الطعام التي تمت مراجعتها من قبل الأقران بتمويل مشترك من قبل معهد CIHR للعدوى والمناعة (CIHR-III) ، ومعهد CIHR لصحة الدورة الدموية والجهاز التنفسي (CIHR-ICRH) ، والمؤسسة الكندية للحساسية والربو والمناعة (CAAIF). تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-198169; JFEK) ، منحة البحوث الطبية لمؤسسة JP Bickell (JFEK) ، المؤسسة الكندية للحساسية والربو والمناعة (JFEK ، MJ) ، الجمعية الكندية للحساسية والمناعة السريرية (VO ، MJ) ، مؤسسة شرودر (JFEK ، SW ، MJ) ، FOOD ALLERGY Canada (JFEK ، SW ، MJ) ، ALK Abello A / S (JFEK ، MJ) ، ZYCH FAMILY (SW ، MJ) ، Buckrell Family (JFEK) ، منحة أونتاريو للدراسات العليا (SD) ، وبرنامج بكالوريوس العلوم الصحية في جامعة ماكماستر (VO).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول حمض الكبريتيك 2N (H2SO4)لا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
كأس 500 مللا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
صفيحة ذات 6 آبارلا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
Bcl-6 - أليكسا فلور 647بكالوريوس العلوم الحيوية561525عامل التخفيف 1:100
مجموعة تثبيت السيتوفيكس/السيتوبيرم BDبكالوريوس العلوم الحيوية554722
مجهر تشريح على سطح الطاولةلا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
مصل البقر الألبومين (BSA)سيغما-ألدريتشA4503
CD11c - أليكسا فلور 700بكالوريوس العلوم الحيوية561352عامل التخفيف 1:100
CD138/سينديكان-1 - PEبيو ليجند356503عامل التخفيف 1:200
CD20 - أليكسا فلور 488إنفيتروجين53020282عامل التخفيف 1:100
CD21 - أليكسا فلور 532نوفوس بيوNBP2-60733AF532عامل التخفيف 1:100
CD23 - PEبيو ليجند338507عامل التخفيف 1:200
CD3 - iFluor 594AAT Bioquest100320C0عامل التخفيف 1:100
CD31 - أليكسا فلور 700بيو ليجند303134عامل التخفيف 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0عامل التخفيف 1:100
CD38 - أليكسا فلور 700بيو ليجند303523عامل التخفيف 1:100
CD4 - أليكسا فلور 647بيو ليجند300520عامل التخفيف 1:100
CD45 - أليكسا فلور 532ثيرموفيشر ساينتيفيك58045942عامل التخفيف 1:100
CD54/ICAM-1 - أليكسا فلور 647بيو ليجند353113عامل التخفيف 1:100
لاصق الجيلاتين المصنوع من الكروم ألوممصدر الوافدين الجدد1033A
كريومولدفيشر ساينتفيك NC9511236أيضا، الكتالوج رقم 50-465-347 للعينات الأكبر
شريحة معايرة DAPIأجار ساينتيفكAG2273
محلول DAPI، 1 ملغ/ملثيرموفيشر ساينتيفيك62248عامل التخفيف 1:3000
E-cadherin/CD324 - أليكسا فلور 647بيو ليجند147307عامل التخفيف 1:100
EpCAM/CD326 - أليكسا فلور 594بيو ليجند324228عامل التخفيف 1:100
أنابيب إبندورف/فالكونلا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
فلوروماونت-جيساوثرن بيوتيك0100-01
الملقطلا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
FoxP3 - eFluor 660ثيرموفيشر ساينتيفيك50577382عامل التخفيف 1:100
شرائح المجهر ذات الطرف المصجعكيمساينسGEW45-2575-W
GL7 - أليكسا فلور 488ثيرموفيشر ساينتيفيك53590282عامل التخفيف 1:100
ملح الصوديوم هيبارينسيغما-ألدريتشH339310KU
HLA-DR - PEنوفوس بيوNB100-77855PEعامل التخفيف 1:200
TruStain Universal FtX (حل حجب مستقبلات FC)بيو ليجند422302عامل التخفيف 1:100
غرفة الرطوبةلا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
دلو ثلج مع غطاءلا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
IgD - أليكسا فلور 488بيو ليجند348215عامل التخفيف 1:100
IL4Ra/CD124 - PEبيو ليجند144803عامل التخفيف 1:200
محول ملفات إيماريسآلات أكسفوردلا يوجدتغطية أي صيغة ملف صورة إلى صيغة .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
إيزوبنتان (2-ميثيلبوتان)لا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
Ki-67 - أليكسا فلور 488بكالوريوس العلوم الحيوية558616عامل التخفيف 1:100
مساحات كيمبرلي-كلارك العلمية المتخصصة في كيمتيك، مساحات مشابك دقيقة للمهام، 1-Plyعلوم كيمتيك06-666
ملقط كبير (أي بطول 25 سم)لا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
النيتروجين السائللا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
بوروهيدريد الليثيوم (LiBH4)سيغما-ألدريتش222356
MECA-79 - أليكسا فلور 488إنفيتروجين53603680عامل التخفيف 1:100
زجاج غطاء شريحة المجهر رقم 1 22x50 ممفيشر ساينتفيك 12-542A
ماء ميلي-كيولا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
MUC2 - أليكسا فلور 488نوفوس بيوNB120-11197AF488عامل التخفيف 1:100
زجاج Nunc Lab-Tek الغطاء الحجرةثيرموفيشر ساينتيفيك155380
قلم PAPأبكامAB2601
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)لا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
المشرطلا يوجدلا يوجدكل ما هو متاح أو مستخدم في المختبر
إضافات سيمبل إي تي كي إيماريسلا يوجدلا يوجدبرنامج يستخدم لمحاذاة الصور من جولات مختلفة (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
سكروزسيغما-ألدريتشS0389
مركب O.C.T. من Tissue-Tekساكورا فينتيك الولايات المتحدة4583
ترايتون X-100سيغما-ألدريتشX100
زايس LSM 980مجهر زايسلا يوجدنظام التصوير المستخدم في هذه الدراسة
زن بلومجهر زايسلا يوجدالبرنامج المستخدم في معالجة الصور بعد الاقتناء

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function. Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).
  2. Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. Defining Cell Identity with Single-Cell Omics. Proteomics. 18 (18), (2018).
  3. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genet. 10 (1), (2014).
  4. de Vries, N. L., Mahfouz, A., Koning, F., de Miranda, N. F. C. C. Unraveling the Complexity of the Cancer Microenvironment With Multidimensional Genomic and Cytometric Technologies. Front Oncol. , 10(2020).
  5. van Dam, S., Baars, M. J. D., Vercoulen, Y. Multiplex Tissue Imaging: Spatial Revelations in the Tumor Microenvironment. Cancers. 14 (13), (2022).
  6. Bressan, D., Battistoni, G., Hannon, G. J. The dawn of spatial omics. Science. 381 (6657), (2023).
  7. Williams, C. G., Lee, H. J., Asatsuma, T., Vento-Tormo, R., Haque, A. An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research. Gen Med. 14 (1), (2022).
  8. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), (2016).
  9. Pascal, L. E., et al. Correlation of mRNA and protein levels: Cell type-specific gene expression of cluster designation antigens in the prostate. BMC Genom. 9, (2008).
  10. Patel, S. S., Rodig, S. J. Overview of Tissue Imaging Methods. Methods Mol Biol. 2055, (2020).
  11. Ohno, M., Karagiannis, P., Taniguchi, Y. Protein expression analyses at the single cell level. Molecules. 19 (9), (2014).
  12. Zimmermann, T., Marrison, J., Hogg, K., O’Toole, P. Clearing up the signal: Spectral imaging and linear unmixing in fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. , 1075(2014).
  13. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), (2022).
  14. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Aca Sci U S A. 117 (52), (2020).
  15. Kothurkar, A. A., et al. ’Iterative Bleaching Extends Multiplexity’ facilitates simultaneous identification of all major retinal cell types. J Cell Sci. 137 (23), (2024).
  16. Cohn, D. E., et al. Delineating spatial cell-cell interactions in the solid tumour microenvironment through the lens of highly multiplexed imaging. Front Immunol. 14, (2023).
  17. Radtke, A. J., et al. IBEX: An open and extensible method for high content multiplex imaging of diverse tissues. arXiv. , (2021).
  18. Radtke, A. J., et al. The IBEX Knowledge-Base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  19. Croce, A. C. Light and Autofluorescence, Multitasking Features in Living Organisms. Photochem. 1 (2), (2021).
  20. Wizenty, J., et al. Autofluorescence: A potential pitfall in immunofluorescence-based inflammation grading. J Immunol Methods. 456, (2018).
  21. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Curr Protoc Cell Biol. 69 (1), 4.3.1-4.3.7 (2015).
  22. Sicherre, E., Favier, A. L., Riccobono, D., Nikovics, K. Non-specific binding, a limitation of the immunofluorescence method to study macrophages in situ. Genes. 12 (5), (2021).
  23. Monique Hartlen Histotechnology Lab Manual. , NSCC. (2022).
  24. Stephen Peters Frozen Section Technique. , Pathology Innovations, LLC. https://pathology-innovations.squarespace.com/frozen-section-technique (2023).
  25. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), (2021).
  26. Mayeno, A. N., Hamann, K. J., Gleich, G. J. Granule-associated flavin adenine dinucleotide (FAD) is responsible for eosinophil autofluorescence. J Leukocyte Biol. 51 (2), (1992).
  27. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and Nonspecific Immunofluorescent Labeling in Frozen Bovine Intestinal Tissue Sections: Solutions for Multicolor Immunofluorescence Experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), (2017).
  28. Vlaminck, S., et al. The importance of local eosinophilia in the surgical outcome of chronic rhinosinusitis: A 3-year prospective observational study. Am J Rhinol Allergy. 28 (3), (2014).
  29. Skinner, B. M., Johnson, E. E. P. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), (2017).
  30. Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), (1985).
  31. Valnes, K., Brandtzaeg, P. Selective inhibition of nonspecific eosinophil staining or identification of eosinophilic granulocytes by paired counterstaining in immunofluorescence studies. J Histochem Cytochem. 29 (5), (1981).
  32. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), (1999).
  33. Bystrom, J., Amin, K., Bishop-Bailey, D. Analysing the eosinophil cationic protein - a clue to the function of the eosinophil granulocyte. Respiratory Res. , 12(2011).
  34. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cyt Part A. 89 (6), (2016).
  35. Saitou, T., et al. Tissue intrinsic fluorescence spectra-based digital pathology of liver fibrosis by marker-controlled segmentation. Front Med. 5 (DEC), (2018).
  36. Acuña-Rodriguez, J. P., Mena-Vega, J. P., Argüello-Miranda, O. Live-cell fluorescence spectral imaging as a data science challenge. Biophys Rev. 14 (2), (2022).
  37. Constantinou, P., Dacosta, R. S., Wilson, B. C. Extending immunofluorescence detection limits in whole paraffin-embedded formalin fixed tissues using hyperspectral confocal fluorescence imaging. J Microscopy. 234 (2), (2009).
  38. Enninful, A., Baysoy, A., Fan, R. Unmixing for ultra-high-plex fluorescence imaging. Nat Comm. 13 (1), (2022).
  39. Chang, Q., et al. Imaging Mass Cytometry. Cyt Part A. 91 (2), (2017).
  40. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nat Med. 20 (4), (2014).
  41. Baharlou, H., Canete, N. P., Cunningham, A. L., Harman, A. N., Patrick, E. Mass Cytometry Imaging for the Study of Human Diseases—Applications and Data Analysis Strategies. Front Immunol. 10, (2019).
  42. Goltsev, Y., Nolan, G. CODEX multiplexed tissue imaging. Nat Rev Immunol. 23 (10), 613-613 (2023).
  43. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), (2021).
  44. Vorobjev, I. A., Kussanova, A., Barteneva, N. S. Development of Spectral Imaging Cytometry. Methods Mol Biol. 2635, (2023).
  45. Hernandez, S., et al. Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification for Immune Cell Profiling of Paraffin-Embedded Tumor Tissues. Front Mol Biosci. 8, (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة