مقالة منهجية

إحداث ارتفاع الحرارة الخفيف المستهدف في نماذج أورام الفئران من خلال التحويل الحراري الضوئي للضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء بواسطة قضبان الذهب النانوية داخل الورم

DOI:

10.3791/68656

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Dalhousie University, 2Sona Nanotech Inc., 3Department of Surgery, Dalhousie University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول التقنيات والمنهجية اللازمة للعلاج المستهدف لارتفاع الحرارة في نماذج الأورام الصلبة. يستفيد هذا النهج من التحويل الحراري الضوئي لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة عن طريق قضبان الذهب النانوية المحقونة داخل الورم للحث على التسخين الموضعي داخل البيئة المكروية للورم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ارتفاع الحرارة الخفيف (42-48 درجة مئوية) هو طريقة علاجية راسخة يمكن أن تحفز موت الخلايا السرطانية المتحكم فيه وتحفز الاستجابات المناعية المضادة للسرطان. ومع ذلك ، فإن توصيل الحرارة بدقة إلى أنسجة الورم مع تجنيب الأنسجة السليمة المحيطة لا يزال يمثل تحديا كبيرا. تتطلب طرق ارتفاع الحرارة التقليدية ، مثل نضح الأطراف المعزولة ، إجراءات معقدة وغازية وتنطوي على مخاطر كبيرة من السمية الموضعية ومراضة المرضى. في المقابل ، ظهر العلاج الحراري الضوئي باستخدام جزيئات الذهب النانوية التي يتم تنشيطها بواسطة ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) كاستراتيجية واعدة وأقل توغلا لتحقيق ارتفاع الحرارة الموضعي. تظهر قضبان الذهب النانوية (GNRs) ، على وجه الخصوص ، خصائص بصرية قابلة للضبط وكفاءة تحويل حرارية ضوئية عالية ، مما يجعلها مرشحة مثالية للتعديل الحراري الدقيق لمواقع الورم. على الرغم من أن هذه التقنية قد أظهرت وعدا كبيرا ، خاصة بالنسبة للأورام السطحية والتي يمكن الوصول إليها ، إلا أن الولادة القابلة للتكرار ، والحبس المكاني ، والسلامة لا تزال مجالات تنشيط الصقل. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقتنا التي تم التحقق من صحتها ومحسنة لتحقيق ارتفاع حرارة موضعي وخفيف باستخدام الحقن داخل الورم ل GNRs المتوافقة حيويا متبوعة بالتعرض قصير الأمد والمستهدف لليزر NIR. يتيح هذا النهج التسخين السريع الذي يمكن التحكم فيه ضمن النطاق العلاجي ، مما يعزز موت الخلايا السرطانية المناعية ويحفز الاستجابات المناعية الفطرية ، وهي آليات ذات صلة بشكل خاص بالأورام "الباردة" المناعية. تضمن مراقبة درجة الحرارة في الوقت الفعلي والتسليم المحلي قابلية التكرار والسلامة والحد الأدنى من التعرض النظامي. يوفر هذا البروتوكول المبسط منصة قوية ويمكن الوصول إليها للدراسات قبل السريرية ، مما يدعم الجهود الأوسع لتسخير ارتفاع الحرارة الخفيف في العلاج المناعي للسرطان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا تزال هناك تحديات كبيرة في علاج السرطان ، بما في ذلك مقاومة الأدوية ، والتهرب المناعي ، والسمية خارج الهدف ، وكلها تقوض نجاح العلاجات التقليدية على المدى الطويل. أدت هذه القيود إلى تطوير استراتيجيات علاجية تكميلية مصممة للتغلب على آليات المقاومة مع تقليل الأضرار الجانبية للأنسجة السليمة. لطالما تم التعرف على ارتفاع الحرارة الخفيف ، الذي يعرف بأنه ارتفاع درجات حرارة الأنسجة إلى 42-48 درجة مئوية ، كعامل مساعد فعال لعلاجات السرطان القياسية1. تاريخيا ، تم استخدام ارتفاع الحرارة الخفيف مع الجراحة أو العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي لتعزيز فعالية هذه العلاجات عن طريق زيادة تروية الورم ، وتعطيل بنية اللحمة ، وتحسس الخلايا الخبيثة للعوامل السامة للخلايا1. في الآونة الأخيرة ، مع النجاح المتزايد للعلاج المناعي في علم الأورام ، هناك اهتمام متزايد بالاستفادة من الإمكانات المناعية المتأصلة في ارتفاع الحرارة الخفيف لتحسين الاستجابات المناعية المضادة للأورام1،2،3.

على الرغم من فوائده السريرية المثبتة ، إلا أن التطبيق الأوسع لارتفاع حرارة الورم لا يزال محدودا بسبب التحديات في تحقيق تسخين موضعي ويمكن التحكم فيه وقابل للتكرار للأورام مع تجنب تلف الأنسجة غير المستهدف4. غالبا ما تعاني تقنيات ارتفاع الحرارة السريرية والتجريبية الحالية ، مثل تروية الأطراف الإقليمية أو الأساليب القائمة على الجسيمات النانوية التي يتم توصيلها نظاميا ، من دقة مكانية محدودة ، وامتصاص متغير للورم ، وإمكانية السمية الجهازية2،5،6،7،8،9. يعد العلاج بارتفاع الحرارة المستهدف طريقة ناشئة في هذا المجال من علاج السرطان ، وهو مصمم لرفع درجات حرارة الورم بشكل انتقائي مع تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة السليمة المحيطة. وبشكل أكثر تحديدا ، يعد التسليم المستهدف لقضبان الذهب النانوية (GNRs) طريقة واعدة للتغلب على القيود الحالية لدقة ارتفاع حرارة الورم الخفيف وسميته. تعتبر GNRs مناسبة بشكل خاص للتطبيقات الحرارية الضوئية نظرا لرنين البلازمون السطحي القابل للضبط في منطقة NIR ، وكفاءة التحويل الحراري الضوئي العالية ، وملامح التوزيع الحيوي المواتية مقارنة بالهياكل النانوية الذهبية الأخرى10،11. تتيح استجابتها للأطوال الموجية NIR امتصاصا فعالا للضوء وتدفئة موضعية حتى في الأنسجة العميقة ، مع الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بالهياكل المحيطة. على هذا النحو ، يمكن أن توفر GNRs فعالية محسنة واستهدافية وسلامة في علاجات ارتفاع الحرارة.

الهدف من هذه الطريقة هو توفير بروتوكول عالي الكفاءة ومنخفض الموارد وقابل للتكرار لتحقيق ارتفاع حرارة خفيف بوساطة الذهب النانوي في الأورام الصلبة. تعالج هذه التقنية ، التي تسمى العلاج بارتفاع الحرارة المستهدف بوساطة GNR (THT) ، القيود الرئيسية لمناهج ارتفاع الحرارة التقليدية من خلال الجمع بين الحقن المباشر ل GNR داخل الورم وتنشيط ضوء NIR الخارجي. وهذا يضمن تركيزا عاليا للجسيمات النانوية المحلية ، مما يحسن قابلية التكاثر والسلامة ، خاصة بالنسبة للأورام الصغيرة أو سيئة الأوعية الدموية التي قد لا تتراكم بكفاءة عوامل يتم توصيلها نظاميا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الحقن المباشر داخل الورم ل GNRs متبوعا بالتعرض لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) يضمن التسخين الدقيق والخاضع للرقابة والموضعية للأورام ، مع تقليل التعرض الجهازي والسمية والتأثيرات غير المستهدفة المرتبطة بتقنيات ارتفاع الحرارة الإقليمية التقليدية.

تصور العديد من أنواع السرطان آليات معقدة ومتنوعة للهروب المناعي ، مما يسمح لها بمقاومة العلاج المناعي من خلال وسائل مختلفة ، والأكثر وضوحا ، من خلال ضعف تسلل الخلايا المناعية داخل البيئة المكروية للورم2،4،5. يوفر ارتفاع الحرارة الخفيف حلا تآزريا عند استخدامه مع العلاجات المناعية. بالإضافة إلى التأثيرات السامة للخلايا المباشرة ، يؤدي ارتفاع الحرارة الخفيف بشكل تفضيلي إلى موت الخلايا المناعية (ICD) ، مما يؤدي إلى إطلاق المستضدات المرتبطة بالورم (TAAs) والأنماط الجزيئية المرتبطة بالتلف (DAMPs) 1،2. تنشط هذه الإشارات المسارات المناعية الفطرية ، وتعزز عرض مستضد الورم ، وتعزز نضوج الخلايا المتغصنة ، وتعزز فتيلة الخلايا التائية ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة تسلل الخلايا المناعية إلى البيئة المكروية للورم1،6،12. في نماذجنا قبل السريرية الخاصة ، عملت تقنية THT بوساطة GNR على تنشيط الاستجابات المناعية المحلية وتعزيز التسلل المناعي للورم13. عند دمجها مع العلاج بالإنترلوكين -2 (IL-2) داخل الورم أو تثبيط نقطة التفتيش الجهازية المضادة ل PD1 ، زادت تقنية THT بوساطة GNR من المناعة المضادة للورم وتفوقت على العلاج الأحادي وحده في نماذج سرطان الثديوالورم الميلانيني 13. تتوافق هذه النتائج مع مجموعة متزايدة من الأدلة التي تدعم التآزر بين ارتفاع حرارة الجسيمات النانوية والعلاج المناعي في الأورام الصلبة ، بما في ذلك سرطان الثدي14،15،16 وأورام المخ17،18. باختصار ، من خلال تحويل الأورام "الباردة" مناعيا إلى أورام "ساخنة" ، يمكن ل THT بوساطة GNR تحسين الاستجابة للعلاجات المناعية ، بما في ذلك مثبطات نقاط التفتيش1،2،12.

بروتوكول THT بوساطة GNR المقدم هنا منخفض الموارد ، ومباشر تقنيا ، وقابل للتكيف على نطاق واسع مع الأورام تحت الجلد أو السطحية. هذه التقنية مناسبة بشكل خاص للباحثين الذين يعملون مع نماذج الفئران للأورام تحت الجلد أو السطحية ، بما في ذلك سرطان الجلد وسرطان الثدي. ومع ذلك ، مع تعديلات طفيفة ، يمكن أن يمتد إلى أنواع الأورام والمواقع التشريحية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية منصة متعددة الاستخدامات لدمج ارتفاع الحرارة الذي يتم التحكم فيه مكانيا في دراسات السرطان قبل السريرية ، لا سيما تلك التي تبحث في استراتيجيات تعزيز العلاج المناعي ، وتتطلع إلى استكشاف ارتفاع الحرارة الخفيف لتحسين استجابة العلاج أو التغلب على مقاومة العلاج المناعي. علاوة على ذلك ، فإن المعرفة والمعدات المطلوبة لتنفيذ هذه التقنية يمكن الوصول إليها وقابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من إعدادات الرعاية الصحية ، مما يعزز جدواها في الاستخدام السريري الأوسع3.

في هذه المخطوطة ، نقدم إرشادات مفصلة خطوة بخطوة لتنفيذ بروتوكول THT بوساطة GNR في نماذج الماوس باستخدام نظام ليزر NIR يعمل بسرعة 860 نانومتر. يعتمد نجاح هذا البروتوكول على التنشيط الفعال للأنسجة العميقة لقضبان الذهب النانوية باستخدام الطول الموجي المناسب لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة. نسلط الضوء أيضا على الاعتبارات الإجرائية لتحقيق جرعات متسقة وآمنة وفعالة لارتفاع الحرارة الخفيف في نماذج أورام الفئران ، مثل المراقبة الدقيقة في الوقت الفعلي لدرجة حرارة الورم الداخلية طوال الإجراء. تعتمد هذه الطريقة على جوانب مناهج ارتفاع حرارة الجسيمات النانوية التي تم الإبلاغ عنها سابقا وتجمع بين ، مما يوفر بديلا شاملا ومعتمدا ودقيقا للغاية وقابلا للتكرار لأبحاث السرطان قبل السريري. بشكل عام ، يقدم هذا البروتوكول طريقة آمنة بيولوجيا وفعالة من حيث التكلفة ومنخفضة السمية لتوصيل ارتفاع الحرارة الموضعي للورم ، مع إمكانات قوية لتعزيز فعالية العلاجات المناعية للسرطان الحالية وتوسيع الفائدة السريرية لارتفاع الحرارة في علم الأورام.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة الجامعة لحيوانات المختبر في جامعة دالهوزي بموجب إرشادات المجلس الكندي للمعايير الأخلاقية لرعاية. تم اتباع جميع المبادئ التوجيهية الدولية والوطنية والمؤسسية المعمول بها لرعاية واستخدامها. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. متطلبات مرافق الليزر والعلاج

  1. الوصول الآمن إلى نظام ليزر معاير بالكامل قادر على توصيل الضوء بطول موجي يبلغ 860 ± 10 نانومتر بكثافة تصل إلى 4,000 مللي أمبير. تأكد من أن نظام الليزر يحتوي على آليات إغلاق مناسبة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، استخدمنا ليزر مصمم خصيصا. يحتوي النموذج المستخدم في هذا البروتوكول على مفتاح تمكين ليزر ، وزر توقف في حالات الطوارئ ، وعبور تعشيق (يمكن أيضا توصيل العبور المتصل بمفتاح أمان يستخدم للامتثال للسلامة ، على سبيل المثال ، الوصول إلى الباب إلى غرفة ليزر من الفئة 4).
  2. قم بإرفاق مسبار درجة حرارة معاير قابل للإدخال لمراقبة درجة الحرارة داخل الورم القادر على نقل بيانات درجة الحرارة الحية عبر برنامج تسجيل المزدوج الحراري المناسب.
  3. قم بإعداد غرفة ليزر مخصصة تلبي معايير السلامة المطلوبة لفئة الليزر. تأكد من وجود منطقة عمل خالية من العوائق ، مع تهوية جيدة ، وإضاءة مناسبة ، وجميع الأسطح العاكسة مغطاة. تقييد الوصول إلى الغرفة أثناء تشغيل الليزر لمنع التعرض غير المقصود. تأكد من أن جميع الموظفين المشاركين في الدراسة مدربون تدريبا كاملا على بروتوكولات تشغيل الليزر والسلامة وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة وحماية العين.
  4. قم بإنشاء مساحة عمل داخل غرفة الليزر تستوعب آلة تخدير على مقربة من إعداد الليزر. تأكد من أن الليزر مثبت بإحكام ، ولكن قابل للتعديل ، مع إمكانية وضع الموضوع التجريبي على بعد حوالي 1-2 سم من مصدر شعاع الليزر لضمان الاستهداف الدقيق لموقع الورم.
  5. استخدم كاميرا تصوير حراري على حامل ثلاثي القوائم، تم وضعه لالتقاط قراءات درجة الحرارة من سطح الهدف، طوال فترة التعريض الضوئي لليزر.

2. زراعة الخلايا والتلقيح (حقن الخلايا السرطانية)

  1. حدد نماذج الفئران المناسبة بناء على نوع الورم محل الاهتمام ، باتباع تقنيات إعداد وصيانة زراعة الخلايا المختبرية الموحدة. لاتباع هذا البروتوكول ، حدد إناث الفئران BALB / C البالغة من العمر 6-8 أسابيع لتطعيم الورم CT26.
    ملاحظة: يمكن استخدام الفئران ذات الكفاءة المناعية أو التي تعاني من نقص المناعة من مختلف الأعمار والسلالات ، اعتمادا على متطلبات الدراسة.
  2. زراعة خط الخلايا السرطانية CT26 في وسط RPMI 1640 المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني معطل حراريا (FBS) ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ، و 2 ملي جلوتامين. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بتجديد الوسط كل 2-3 أيام ، والخلايا الاستزراعية الفرعية عند التقاء 70-80٪ باستخدام نسبة انقسام 1: 4 إلى 1:10. استخدم الخلايا داخل الممرات المبكرة (على سبيل المثال ، ≤10 مقاطع) لضمان نمو ثابت وكفاءة التلقيح. توسيع الثقافات حسب الحاجة للحصول على العدد المطلوب من الخلايا للتلقيح.
    ملاحظة: سيختلف عدد الخلايا المطلوبة لكل فأر اعتمادا على النموذج ، على سبيل المثال ، بالنسبة لنموذج سرطان القولون والمستقيم CT26 ، احتجنا إلى 5 × 105 خلايا لكل فأر.
  3. افصل الخلايا الملتصقة باستخدام التربسين واغسل 2x باستخدام 1x PBS المعقم. أعد التعليق في محلول معقم 1x PBS لتحقيق التركيز المطلوب من 5 × 106 خلايا / مل. قم بتخزين تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 2 مل على الثلج لمدة أقصاها ساعة واحدة قبل الحقن.
  4. قبل الحقن ، قم بتخدير الفئران باستخدام غرفة تحريض مع 4٪ من الأيزوفلوران المتبخر بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة. بمجرد التخدير ، قلل الأيزوفلوران إلى 2٪ وحافظ على التخدير بمخروط الأنف أثناء إجراء التلقيح. تأكد من عمق التخدير باستخدام اختبار قرصة إصبع القدم لضمان عدم وجود استجابة للألم. ضع مادة تشحيم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف وتقليل تلف الليزر المحتمل.
  5. حلق موقع الحقن (على سبيل المثال ، الجناح الأيسر لهذا الطراز CT26 غير المتجانس) باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ونظف المنطقة بمنديل كحولي لإزالة الحطام وتطهير الجلد. اضغط على الجلد في موقع الحقن وحقن 100 ميكرولتر من معلق الخلية عند 5 × 106 خلايا / مل تحت الجلد باستخدام إبرة 26 جم وحقنة 1 مل. بعد الحقن ، قم بإزالة الفأر من مخروط الأنف وإعادته إلى قفصه للتعافي على بطانية الاحترار لمدة 1 ساعة.

3. نمو الورم وقياسه

  1. ابدأ قياسات الورم اليومية، التي تبدأ عادة في اليوم السابع بعد الحقن، باستخدام الفرجار لقياس الورم. قم بقياس أبعاد الورم في ثلاثة محاور: العرض والطول والارتفاع وحساب أحجام الورم باستخدام صيغة حجم الورم الإهليلجي π/6 × طول × عرض × ارتفاع.
  2. خطط لبدء THT بوساطة GNR بمجرد وصول الأورام إلى حجم تقريبي يبلغ 50 مم3 (± 20 مم3).
    ملاحظة: بالنسبة لنموذج CT26 الخاص بنا ، تم تحقيق حجم الورم هذا بين الأيام 10 و 12 بعد حقن الخلايا السرطانية).
  3. قبل العلاج بالليزر ، تأكد من التخصيص العشوائي للفئران في مجموعات التحكم والعلاج. ستتلقى مجموعة العلاج حقنة GNR داخل الأورام متبوعا بالتعرض لليزر ؛ وستتلقى المجموعة الضابطة حقنة PBS داخل الورم (نفس حجم حقن GNR) بدلا من GNRs ، متبوعا بالتعرض لليزر.

4. التحويل الحراري الضوئي لضوء NIR باستخدام GNRs داخل الورم

  1. في خزانة الأمان البيولوجي المعقمة ، استخدم حقنة 0.3-1 مل بإبرة 31 جرام لرسم الحجم المناسب من GNRs بناء على حجم كل ورم.
  2. قم بتخدير الفأر بنفس طريقة حقن الخلايا السرطانية (مع مخروط الأنف الذي يوفر 2٪ من الأيزوفلوران بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة وتأكد من عمق التخدير الكافي باستخدام اختبار قرصة إصبع القدم).
  3. بمجرد التخدير ، قلل الأيزوفلوران إلى 2٪ وضع الماوس في وضع الانبطاح على منصة الليزر مع الحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف. ضع مادة تشحيم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف وتقليل تلف الليزر المحتمل.
  4. احلق الفراء الزائد حول الورم ، إذا لزم الأمر ، لضمان تعرض سطح الجلد لليزر. استخدم الإيثانول لتطهير سطح الورم ، ومسح أي فراء / حطام.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، استخدمنا GNRs المحسنة للامتصاص عند 860 نانومتر. إذا كنت تستخدم منتج GNR مختلفا عن المقترح هنا ، فتأكد من تحسين توصيل الطول الموجي لليزر NIR وفقا للطيف امتصاص GNR.
  5. قبل التعرض لليزر ، قم بحقن GNRs داخل الورم بتركيز 1 ميكروغرام / مم3 من حجم الورم. إذا لزم الأمر ، قم بتقسيم الحقن بين موقعين داخل الورم لضمان التوزيع الفعال ل GNRs داخل الورم.
    ملاحظة: في فيديو البروتوكول هذا، تم استخدام GNRs بتركيز 2 ميكروغرام/ميكرولتر؛ لذلك ، بالنسبة للورم 50 مم3 ، تم حقن 25 ميكرولتر من GNRs في الورم. تأكد من مسح أي GNRs زائدة على سطح الجلد بعد الحقن المعنية.
  6. بالنسبة لفئران المجموعة الضابطة ، قم بإعطاء حقنة داخل الورم من PBS المعقم بالحجم المكافئ المستخدم لمجموعة (مجموعات) حقن GNR (على سبيل المثال ، حقن 25 ميكرولتر من PBS في حالة ورم 50 مم3).
  7. تطهير مسبار درجة الحرارة داخل الورم بالإيثانول وأدخله برفق في منتصف كتلة الورم.
  8. ضع طبقة موحدة من جل الصبار بسمك 5 مم تقريبا على سطح الورم لمنع تقرح الجلد وتقليل مخاطر الإصابة الحرارية أثناء العلاج.
  9. تأكد من ضبط الليزر ليصطف مباشرة فوق منتصف الورم. استخدم جدول البحث عن الإشعاع (الجدول 1) لتحديد ارتفاع الليزر المناسب بناء على قطر شعاع الليزر المطلوب لتغطية مساحة سطح الورم. تحسين ارتفاع الليزر بناء على قطر الورم لضمان توصيل الطاقة بشكل متسق.
    ملاحظة: في تجربتنا ، تطلب الورم الذي يبلغ قطره 1.3 سم ارتفاع ليزر يبلغ 1.5 سم).
  10. قم بتشغيل مصدر التبريد الكهربائي بالليزر والترمس (TEC)، ثم قم بتوصيل نظام الليزر بمصدر الطاقة (مكيف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة). قم بتشغيل مصدر التبريد الكهربائي للترمس ؛ انتظر حتى يتم تشغيل مؤشر LED الأزرق ، وتستقر درجة حرارة مصدر TEC لليزر عند 25 درجة مئوية بعد 30 ثانية.
  11. استخدم جدول البحث عن الإشعاع (الجدول 1) لتحقيق إشعاع مستهدف يبلغ 1 واط / سم2 ± 0.2 واط / سم2 عن طريق ضبط خرج تيار الليزر (أدر مقبض مصدر الليزر إلى نقطة الضبط الحالية المطلوبة).
    ملاحظة: في تجربتنا ، أدى ارتفاع الليزر البالغ 1.5 سم ، وقطر الشعاع 1.3 سم ، وتيار الليزر البالغ 1,800 مللي أمبير إلى قيمة إشعاع تبلغ 0 .82 واط / سم2 ، والتي تم تحسينها لنموذج الورم هذا.
    من هذه النقطة فصاعدا ، تأكد من أن جميع الأفراد في غرفة عمليات الليزر يرتدون نظارات أمان ليزر معتمدة للطول الموجي للضوء المستخدم.
  12. قم بإعداد الكاميرا الحرارية المجاورة لمنصة الليزر ، الموجهة إلى الماوس ، لمراقبة درجة حرارة سطح الجلد أثناء إجراء الليزر.
  13. في برنامج التسجيل الحراري ، قم بإنشاء ملف جديد وانقر فوق زر التسجيل . تأكد من عرض الرسم البياني لدرجة حرارة الورم الداخلي مقابل الوقت في الوقت الفعلي.
  14. أدر مفتاح الأمان لتمكين إخراج مصدر الليزر. ابدأ إعطاء الليزر عن طريق الضغط على دواسة القدم.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تكون وحدة التحكم Raspberry Pi هي الواجهة الداخلية بين دواسة القدم ومصدر الليزر.
  15. تحقق وتأكد من أن برنامج الكمبيوتر يكتشف زيادة في درجة حرارة الورم بمجرد تعرض الورم المحقون ب GNR لشعاع الليزر.
    ملاحظة: ستبدأ درجة حرارة الورم الداخلية في الزيادة عند بدء تشغيل الليزر ، حيث تستغرق حوالي 15 ثانية إلى دقيقتين للدخول في نطاق ارتفاع الحرارة المستهدف البالغ 42 درجة مئوية ، اعتمادا على حجم ونوع نموذج الورم.
  16. حافظ على درجة حرارة الورم الداخلية عند نطاق ارتفاع الحرارة (بين 42 درجة مئوية و 48 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق كاملة. راقب باستمرار درجة حرارة الورم الداخلي ، وإذا اقتربت من 48 درجة مئوية ، ارفع القدم عن الدواسة واترك درجة الحرارة تنخفض مرة أخرى. ابحث عن هذا الانخفاض في درجة الحرارة في الوقت الفعلي على الرسم البياني لعرض درجة الحرارة مقابل الوقت. بمجرد انخفاض درجة حرارة الورم الداخلية إلى ~ 43 درجة مئوية ، أعد تمكين إعطاء الليزر بالضغط على الدواسة مرة أخرى. استمر في هذا النمط من تشغيل / إيقاف دورة دواسة الليزر للحفاظ على درجة حرارة الورم الداخلية في النطاق المناسب لارتفاع الحرارة لمدة 5 دقائق كاملة ، ومراقبة الرسم البياني لعرض درجة الحرارة مقابل الوقت.
    1. إذا انخفضت درجة حرارة الورم إلى أقل من 42 درجة مئوية في أي وقت خلال فترة ارتفاع الحرارة لمدة 5 دقائق ، فقم بزيادة وقت ارتفاع الحرارة لتعويض الوقت الضائع. على سبيل المثال ، إذا انخفضت درجة الحرارة إلى أقل من 42 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، أضف 20 ثانية إلى نهاية وقت 5 دقائق الأولي. قد لا تصل درجة حرارة بعض الأورام المحقونة ب GNRs إلى 48 درجة مئوية ، ولن يكون من الضروري تشغيل / إيقاف تشغيل ركوب الدراجات بالليزر.
      ملاحظة: في الفئران الضابطة التي تم حقنها داخل الورم باستخدام PBS ، لن تصل الأورام إلى نطاق ارتفاع الحرارة. إذا رغبت في ذلك ، يجب أن يتبع تشغيل / إيقاف دورة الليزر لفئران التحكم نفس النمط الذي تم إنشاؤه للمجموعة المعالجة ب GNR ، على الرغم من النقص المتوقع في استجابة ارتفاع الحرارة.
  17. طوال فترة الحفاظ على ارتفاع حرارة الورم ، راقب باستمرار درجة حرارة سطح الجلد لضمان بقائها أقل من 50 درجة مئوية. بغض النظر عن درجة حرارة الورم الداخلية ، إذا وصلت درجة حرارة سطح الجلد إلى 50 درجة مئوية ، فقم بإيقاف تشغيل الليزر للسماح بالتبريد. إذا لم تتمكن درجة الحرارة الداخلية من الوصول إلى النطاق المرتفع للحرارة المطلوب دون التسبب في تجاوز درجة حرارة الجلد 50 درجة مئوية ، فقم بتقليل طاقة الليزر و / أو ضع صبار إضافي على موقع الورم للمساعدة في تبديد الحرارة. بعد 5 دقائق في نطاق ارتفاع الحرارة ، حرر دواسة القدم لإيقاف إعطاء الليزر والسماح لدرجة حرارة الورم الداخلية بالانخفاض إلى ~ 37 درجة مئوية وإيقاف تشغيل مفتاح أمان الليزر.
    ملاحظة: من المهم تقليل تلف الجلد الذي يمكن أن يؤدي إلى تقرح الورم عن طريق الحفاظ على درجة حرارة الجلد أقل من 50 درجة مئوية19.
  18. راقب مسبار درجة حرارة الورم الداخلي ، مما يسمح لدرجة حرارة الورم بالانخفاض مرة أخرى إلى حوالي 37 درجة مئوية. قم بإزالة مسبار درجة الحرارة برفق من الورم وامسح جل الصبار المتبقي على سطح الورم.
  19. أخرج الفأر من مخروط الأنف المخدر وراقب إثارة قبل إعادتها إلى القفص. ضع القفص جزئيا على وسادة حرارية تبلغ 37 درجة مئوية خلال فترة التعافي بعد الإجراء ، مما يسمح للفئران بالانتقال بين المناطق الأكثر دفئا والأكثر برودة حسب الحاجة لتنظيم درجة حرارة أجسامها. راقب كل فأر لضمان عودته إلى السلوك الطبيعي قبل إعادته إلى منشأة السكن الخاصة به.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من بروتوكول THT بوساطة GNR هو تسخين الأورام الصلبة باستمرار وموثوقية إلى نطاق ارتفاع الحرارة الخفيف المطلوب من 42-48 درجة مئوية. الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء موضحة في الشكل 1. يتوقف نجاح هذا البروتوكول على إنشاء والحفاظ على ارتفاع الحرارة الخفيف الخاضع للرقابة والتكرار داخل نموذج ورم صلب معين. تم تصنيع GNRs المستخدمة باستخدام طريقة خالية من CTAB حاصلة على براءة اختراع ، حيث تم تقليل ملح الذهب في محلول خافض للتوتر السطحي خاص لتعزيز نمو البلورات على شكل قضيب. بعد التخليق ، تم استبدال المواد الخافضة للتوتر السطحي الأصلية إلى حد كبير ب PEG منخفض الوزن الجزيئي لتعزيز التوافق الحيوي. كانت GNRs الناتجة موحدة الحجم (51.1 ± 10.8 نانومتر × 12.2 ± 1.9 نانومتر) ، ولها طول موجة إثارة مثالي يبلغ 860 ± 10 نانومتر ، وكانت خالية من السموم الداخلية التي يمكن اكتشافها.

لضمان تسخين الورم بشكل مناسب وتتبع دقيق لدرجة الحرارة ، يجب إدخال مسبار درجة الحرارة داخل الورم في مركز الورم. بالإضافة إلى ذلك ، تعد مراقبة درجة حرارة سطح الجلد طوال العملية باستخدام جهاز تصوير حراري أمرا بالغ الأهمية. من الممكن ، خاصة بالنسبة للأورام الأصغر حجما ، أن تنتشر GNRs المحقونة داخل الورم في المساحة المحيطة بالورم و / أو تحت الجلد حول الورم. عند التعرض لضوء الأشعة تحت الحمراء الطبيعية ، قد يتسبب ذلك في تسخين الجلد فوق المستويات الفسيولوجية الأساسية ، وإذا وصل الجلد إلى درجات حرارة أعلى من مستويات الحرارة الخفيفة (أكبر من 50 درجة مئوية) ، فقد يؤدي ذلك إلى تلف الجلد مثل الجرب و / أو التقرح19. يعد وضع طبقة من جل الصبار على سطح الورم خطوة احترازية مهمة للمساعدة في تنظيم درجة حرارة سطح الجلد ومنع التلف الحراري أثناء التعرض لليزر NIR. على أي حال ، يوصى بمراقبة المنطقة المعالجة بحثا عن علامات التقرح على مدار 48 ساعة بعد THT. يصور الشكل 2 تمثيلا مرئيا للإعداد المقترح لتحسين إدارة درجة حرارة الورم ، مما يوضح موقع مسبار درجة حرارة الورم الداخلي وطبقة هلام الصبار فيما يتعلق بمسبار ليزر NIR.

يمكن تحديد النجاح النسبي لهذا البروتوكول التجريبي من خلال مراقبة درجة حرارة الورم الداخلية مقابل الرسم البياني الزمني طوال عملية الليزر. بالنسبة للفئران التي تم حقنها داخل الورم ب GNRs ، من المتوقع أن تسخن الأورام إلى نطاق ارتفاع الحرارة الخفيف (42-48 درجة مئوية) في غضون 15 ثانية إلى دقيقتين. بمجرد دخول درجة حرارة الورم الداخلية في نطاق ارتفاع الحرارة المعتدل ، من المتوقع أن تستقر إما ضمن النطاق المناسب أو تتطلب دورة تشغيل / إيقاف تشغيل لإعطاء الليزر لضمان عدم ارتفاع درجة حرارة الورم الداخلية عن 48 درجة مئوية (كما هو موضح في الشكل 3 أ). تعتبر الصيانة الناجحة لارتفاع الحرارة الخفيف لمدة 5 دقائق نتيجة إيجابية. بالنسبة للفئران المحقونة داخل الورم باستخدام PBS ، لا يتوقع أن تسخن الأورام إلى نطاق ارتفاع الحرارة. لا يكفي التعرض لضوء NIR بطول موجي يبلغ 860 نانومتر وحده للتسبب في تسخين الأنسجة في نطاق ارتفاع الحرارة المعتدل ، ومن المتوقع أن تستقر أورام التحكم حوالي 39-40 درجة مئوية. يوضح الشكل 3 ب الرسم البياني لدرجة حرارة الورم الداخلية مقابل الوقت بين GNR والفئران الضابطة (المحقونة ب PBS) طوال الإجراء لمدة 5 دقائق. إذا كان الورم المحقون ب GNR غير قادر على الوصول إلى نطاق ارتفاع الحرارة عند التعرض لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة أو لا يمكن الحفاظ عليه في النطاق المناسب لارتفاع الحرارة لمدة 5 دقائق كاملة ، فهذا يعتبر نتيجة سلبية.

يتضمن التحليل النهائي الإضافي لتحديد نجاح بروتوكول THT بوساطة GNR قياس التغيرات في حجم الورم بعد الإجراء. يتسبب THT الذي تم إجراؤه بنجاح بوساطة GNR في موت الخلايا السرطانية المستهدف وتنشيط الاستجابات المناعية المضادة للسرطان ، مما يؤدي إلى انحدار الورم وما يرتبط به من تقليل حجم الورم13. يوضح الشكل 4 التغيرات في حجم الورم بعد THT بوساطة GNR لنموذجين لسرطان الفئران تحت الجلد (B16-melanoma و CT26-نموذج سرطان القولون والمستقيم غير المتجانس) ونموذج واحد لسرطان الفئران في وسادة الدهون الثديية (4T1-سرطان الثدي). في كل نموذج ، يتضح انخفاض كبير في حجم الورم مقارنة بالضوابط بعد 48-72 ساعة بعد إجراء THT بوساطة GNR. من المتوقع أن يختلف الجدول الزمني وحجم تقليل حجم الورم بعد الإجراء اعتمادا على سلالة الفأر ونموذج السرطان. بالإضافة إلى تقليل الورم ، لاحظنا استجابة مناعية فطرية قوية في غضون 48 ساعة من THT بوساطة GNR ، والتي تتميز بزيادة التعبير عن الجينات المشاركة في مسار STING-cGAS وتنظيم وتنشيط الخلايا المتغصنة والضامة والخلايا القاتلة الطبيعية في كل من طرازي B16F10 و 4T113. والجدير بالذكر أنه في نموذج الورم الثنائي 4T1 ، تسبب THT المدعوم من GNR في استجابة مناعية جهازية ، كما يتضح من زيادة تسلل خلايا CD8 + T إلى الأورام المقابلة غير المعالجة13. تدعم هذه النتائج أيضا إمكانات هذا النهج لاستنباط كل من التأثيرات السامة للخلايا المباشرة والمناعية الأوسع نطاقا المضادة للسرطان.

الجدول 1: جدول البحث عن الإشعاع. جدول يوفر قيم الإشعاع (W / cm²) لإعدادات خرج تيار الليزر المختلفة (mA) ومسافات العمل (سم). يستخدم الجدول لتحديد ارتفاع الليزر المناسب بناء على قطر الشعاع المطلوب لتغطية سطح الورم ولتحقيق إشعاع مستهدف يبلغ 1 واط / سم2 ± 0.2 واط / سم2. تشير القيم المميزة باللون الأخضر إلى مستويات الإشعاع المثلى بالقرب من 1 واط / سم2. جدول الإشعاع هذا خاص بليزر LDX وتم توفيره من قبل الشركة المصنعة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط رسومي لإجراء THT بوساطة GNR. منهجية العلاج الفائق الحراري المستهدف بوساطة الذهب النانوي لأورام الجناح تحت الجلد في نموذج الفئران. بعد إنشاء ورم واضح (حوالي 50 مم3) وتخدير الفأر ، (1) حقن GNRs داخل الورم بتركيز 1 ميكروغرام / مم3 ، (2) أدخل مسبار درجة الحرارة داخل الورم في منتصف كتلة الورم ، (3) ضع طبقة ~ 5 مم من جل الصبار على سطح الورم ، (4) ابدأ إعطاء ليزر NIR ، و (5) حافظ على درجة حرارة الورم الداخلية في نطاق ارتفاع حراري خفيف (42 درجة مئوية -48 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. الاختصارات: GNR = نانو الذهب ؛ THT = العلاج بارتفاع الحرارة المستهدف; NIR = الأشعة تحت الحمراء القريبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التمثيل المرئي للإعداد التجريبي. فأر BALB / c يحمل ورم القولون والمستقيم غير المتجانس مع مسبار درجة حرارة داخل الورم يتم إدخاله مركزيا ، وطبقة هلام الصبار الموضعية المطبقة مباشرة تحت التعرض لشعاع الليزر القريب من الأشعة تحت الحمراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الرسوم البيانية لدرجة الحرارة الداخلية في الوقت الفعلي. ملف تعريف (مواصفات) درجة حرارة الورم الداخلية التمثيلية بمرور الوقت (بمللي ثانية) تم تسجيله بواسطة مسبار درجة الحرارة الداخلية طوال فترة تعرض الورم لليزر NIR. (أ) تشغيل / إيقاف نمط دورة الليزر NIR في فأر محقون ب GNR مطلوب للحفاظ على درجة حرارة الورم الداخلية في نطاق ارتفاع حراري خفيف (42 درجة مئوية -48 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. هذا يسلط الضوء على أهمية المراقبة الدقيقة لدرجة حرارة الورم الداخلية وتدوير الليزر للحفاظ على نطاق انخفاض حرارة الجسم طوال العملية. (ب) متوسط الفرق في درجة حرارة الورم الداخلية بين الفئران المحقونة ب GNR (ن = 15) والفئران الضابطة (الحقنة ب PBS) (ن = 8) طوال 5 دقائق من التعرض لليزر NIR. لا يتم تسخين أورام الفئران المحقونة ب PBS في نطاق منخفض الحرارة الخفيف والهضبة حوالي 39-40 درجة مئوية على الرغم من تلقي نفس طول التعرض لليزر NIR مثل المجموعة المحقونة ب GNR ، والتي تصل أورامها إلى درجات حرارة عالية من 42-48 درجة مئوية. الاختصارات: GNR = نانو الذهب ؛ NIR = الأشعة تحت الحمراء القريبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: الرسوم البيانية لحجم الورم بعد THT بوساطة GNR. تحفز THT بوساطة GNR انكماش حجم الورم عبر نماذج متعددة لسرطان الفئران في غضون 48-72 ساعة بعد العلاج. (أ) قياسات حجم الورم في نموذج 4T1 (سرطان الثدي) بعد THT بوساطة GNR (ن = 24 PBS ، ن = 28 THT). (ب) قياسات حجم الورم في نموذج B16-F10 (الورم الميلانيني) بعد THT بوساطة GNR (ن = 19 PBS ، ن = 23 THT). (ج) قياسات حجم الورم في نموذج CT26 (سرطان القولون والمستقيم) بعد THT بوساطة GNR (ن = 9 PBS ، ن = 9 THT). يشير انخفاض أو تباطؤ نمو حجم الورم في غضون 48-72 ساعة بعد العلاج إلى نتيجة إيجابية. لم يتم دمج بيانات حجم الورم لنموذج CT26 في النقطة الزمنية "24 ساعة قبل" - فالقيم متشابهة ومتداخلة. تمثل أشرطة الخطأ SEM. * p < 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول
يوفر تصميم وتنفيذ تقنية THT بوساطة GNR القدرة على إجراء تسخين مستهدف ودقيق ومنخفض الموارد وقابل للتكرار للأورام الصلبة في الجسم الحي. تكمن الميزة الرئيسية لهذا النظام في دقته المكانية والتحكم الحراري ، مما يسمح بالعلاج الموضعي دون الإضرار بالأنسجة المحيطة. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة للتحويل الحراري الضوئي الناجح في ضمان التوافق بين GNRs المستخدمة ومصدر ضوء NIR. في هذه الدراسة ، استخدمنا GNRs المحسنة للامتصاص عند 860 نانومتر. عند هذا الطول الموجي ، يخترق الضوء الأنسجة بشكل فعال ، ويتم توليد الحرارة بشكل انتقائي في الأورام المحتوية على GNR ، بينما تظل الأنسجة السليمة المحيطة بالقرب من درجة الحرارة الفسيولوجية20. بالإضافة إلى ذلك ، عند تنفيذ هذا البروتوكول ، تعد المراقبة الدقيقة في الوقت الفعلي لدرجة حرارة الورم الداخلية أمرا بالغ الأهمية للتأكد من تحقيق نطاق ارتفاع حراري خفيف وأن العلاج يتم تقديمه باستمرار. يسمح وضع مسبار درجة حرارة الورم ، كما هو موضح في الشكل 2 ، بالمراقبة في الوقت الفعلي للجرعة الحرارية للورم ، كما هو موضح في الشكل 3 ب.

استكشاف أخطاء التقنية وإصلاحها
اعتمادا على النموذج في الجسم الحي ونوع الورم ، قد تكون التعديلات الطفيفة على البروتوكول ضرورية لتحسين النتائج. على سبيل المثال ، في نماذج سرطان الجلد في الفئران وسرطان القولون والمستقيم وسرطان الثدي المشار إليها في الشكل 4 ، قمنا بتحسين تركيز حجم GNR إلى الورم عند 1 ميكروغرام / مم3. لقد قمنا أيضا بتحسين كفاءة هذا البروتوكول من خلال إجراء التعرض لليزر NIR مباشرة بعد حقن GNR ، حيث لم يتم ملاحظة أي اختلافات في فعالية العلاج عند مقارنة هذا الحقن وتوقيت العلاج بفترات أطول تبلغ 0.5 أو 1 أو 4 أو 18 أو 24 ساعة. بالنسبة لنماذج الورم التي تختلف عن نماذجنا (نماذجنا) من حيث الفيزيولوجيا المرضية للورم أو توطين الجسم ، قد يكون تركيز GNR المختلف ، الذي يتم حقنه في نقطة زمنية مختلفة ، هو الأمثل لتحقيق و / أو البقاء ضمن نطاق ارتفاع الحرارة. بعد هذا الإجراء ، يجب إجراء قياسات يومية لحجم الورم لتسجيل التغيرات في حجم الورم. يعد انحدار الورم في غضون 2-3 أيام مؤشرا إيجابيا على نجاح العلاج.

نظرا لطبيعة بروتوكول الليزر ، تعد حروق الجلد السطحية والتقرحات عامل خطر محتمل ، خاصة في البشرة المصطبغة أو الحساسة. قد تكون التعديلات على ناتج تيار الليزر ضرورية للحفاظ على التوازن المناسب بين سطح الجلد ودرجة حرارة الورم الداخلية ، اعتمادا على النموذج في الجسم الحي المستخدم. على سبيل المثال ، وجدنا أنه بسبب الاختلافات في محتوى الماء وصبغة الميلانين في الجلد21 ، تتطلب الفئران C57Bl / 6 إعطاء ليزر NIR بتيار أقل مقارنة بفئران BALB / c ، للحفاظ على درجة حرارة الجلد أقل من 50 درجة مئوية. عند تعديل ناتج تيار الليزر ، تأكد من ضبط ارتفاع الليزر وفقا لذلك للحفاظ على إشعاع مستهدف يبلغ 1 واط / سم2 ± 0.2 واط / سم2 مع الاستمرار في تغطية معظم سطح الورم بقطر شعاع الليزر. بدلا من ذلك ، يمكن أن يساعد تطبيق جل الصبار الإضافي في خفض درجة حرارة الجلد أثناء العملية دون التأثير بشكل كبير على درجة حرارة الورم الداخلية. يعد الحفاظ على درجة حرارة سطح الجلد المناسبة من خلال التعديلات اللازمة أمرا مهما لتقليل خطر التقرح ، والذي لوحظ كأثر جانبي محتمل لهذا العلاج. عند إجراء تعديلات على طبقة جل الصبار ، تأكد من إيقاف إعطاء شعاع ليزر NIR مؤقتا. في الأيام التي تلي بروتوكول الليزر ، تأكد من مراقبة الفئران عن كثب بحثا عن الحروق و / أو التقرحات المحتملة.

قيود THT بوساطة GNR
من المخاوف الرئيسية المتعلقة بالسلامة التي يجب معالجتها عند تنفيذ هذا الإجراء استخدام نظارات السلامة بالليزر المعتمدة للطول الموجي للضوء المستخدم أثناء تشغيل الليزر. يجب أن يشتمل نظام الليزر على ميزات أمان مدمجة ، مثل التعشيق بمفتاح ، لمنع التنشيط العرضي. ومع ذلك ، فإن معدات الحماية الشخصية الإضافية - خاصة نظارات السلامة بالليزر المناسبة - مطلوبة للحماية من التعرض المحتمل للأشعة المنعكسة أو المتناثرة. العين هي الأكثر عرضة للإصابة من شعاع الليزر ، حيث تعتبر حروق الشبكية مصدر قلق كبير مع ليزر NIR22. أخيرا ، يجب أن يحصل جميع الموظفين الذين يقومون بتشغيل الليزر على التدريب المناسب.

اختار هذا البروتوكول الحقن داخل الورم ل GNRs على الحقن الجهازي لتقليل سمية النظام ، والحد من توزيع الجسيمات النانوية في الأعضاء غير المستهدفة مثل الكبد والطحال والكلى ، وتعزيز الدقة والفعالية والسلامة لعلاج ارتفاع الحرارة. ومع ذلك ، نظرا لأن هذا البروتوكول يتطلب حقنا داخل الورم من GNRs ، فقد يكون محدودا في قدرته على إحداث ارتفاع الحرارة في نماذج معينة من الأورام. لقد أثبتنا حتى الآن فعالية هذه الطريقة في أورام الوسادات الدهنية تحت الجلد والثدي، وكلاهما يقع بالقرب من سطح الجلد ويمكن الوصول إليه بسهولة من حيث حقن GNR والتعرض لضوء NIR. قد تنشأ صعوبات لوجستية في استهداف الأورام الموجودة داخل تجاويف الجسم ، مثل الصفاق ، أو عند محاولة استهداف المواقع النقيلية للورم الأولي. يمكن أن يتضمن التعديل المحتمل لهذا البروتوكول حقن GNR الجهازي ، بشرط أن يتم تصميم الجسيمات النانوية أو تعديلها لضمان التراكم الفعال في مواقع الورم قبل التعرض للأشعة تحت الحمراءالطبيعية 23. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن أن يؤدي حقن GNR داخل الورم إلى توزيع غير متساو للجسيمات النانوية في الورم ، مما يؤثر على توحيد التدفئة. ومع ذلك ، لا يتوقع أن يكون لتسخين الورم غير المنتظم تأثير كبير على درجة فعالية العلاج ، بالنظر إلى أن النتيجة الأولية لبروتوكول THT بوساطة GNR هي تحريض مزيل الرجفان القابل للزراعة لتنشيط المناعة المضادة للسرطان. أخيرا ، تعتمد قراءة درجة الحرارة داخل الورم على موقع مسبار درجة الحرارة داخل الورم. منتصف الورم هو المكان الأمثل للمسبار ليعكس بدقة متوسط درجة حرارة الورم الإجمالية. ومع ذلك ، إذا كان من الصعب ضمان و / أو تأكيد إدخال المسبار المركزي بسبب حجم الورم و / أو شكله ، فقد يكون من الضروري التسجيل باستخدام مجسين أو أكثر لدرجة الحرارة في مواقع مختلفة.

الأهمية فيما يتعلق بالطرائق القائمة
توفر هذه المخطوطة بروتوكولا شاملا ومحسنا وقابلا للتكرار ل THT بوساطة GNR في الأورام الصلبة والتي يمكن الوصول إليها بشكل سطحي. بالمقارنة مع الطرق الأخرى للحث على ارتفاع الحرارة ، تقدم هذه التقنية مزايا مميزة ، وهي أنها منخفضة الموارد ، ودقيقة مكانيا ، وترتبط بالحد الأدنى من السمية الجهازية. في حين أن استخدام GNRs للعلاج الحراري الضوئي موثق جيدا ، إلا أنه لا يزال هناك تباين كبير عبر الأدبيات في كيفية تنفيذ هذه البروتوكولات. غالبا ما تختلف العناصر الإجرائية الرئيسية مثل مدة تشعيع الأشعة تحت الحمراء الجرية ، واختيار أدوات المراقبة الحرارية (مجسات المزدوجة الحرارية أو الكاميرا الحرارية) ، وإعداد محلول GNR ، وطرق حقن GNR بين الدراسات.

على سبيل المثال ، تتطلب الطرق الأخرى جرعات أطول (20 دقيقة) 24 أو جرعات متعددة (4 × 15 دقيقة) 25 من التعرض للأشعة تحت الحمراء النيجيرية لتحقيق نتائج مماثلة لنتائجنا. علاوة على ذلك ، تستخدم معظم البروتوكولات إما مجسات مزدوجة حرارية أو كاميرات حرارية ولكن نادرا ما تجمع بين كلتا الأداتين26،27. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم تحضير حلول GNR باستخدام CTAB28،29،30 ، وتختلف طريقة توصيلها بين الحقن الجهازية24،30 والحقن داخل الورم31 ، والتي يمكن أن تؤثر على تشتتها / موقعها داخل TME. على هذا النحو ، لم يتم بعد إنشاء طريقة شاملة وقابلة للتكيف ل THT بوساطة GNR تعمل على تحسين البروتوكولات الحالية وتحسينها.

يعالج بروتوكولنا أوجه القصور هذه من خلال دمج المكونات الأكثر فعالية وقابلية للتكرار من الأدبيات في نهج واحد موحد. على وجه التحديد ، نستخدم المراقبة الحرارية المزدوجة (المزدوجة الحرارية والكاميرا الحرارية) لضمان توصيل الحرارة بدقة وآمنة. نحن نستخدم الحقن داخل الورم من GNRs الخالية من CTAB لتعظيم توطين الورم وتقليل السمية. وندمج استخدام جل الصبار للحماية من حروق الجلد السطحية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين GNRs المستخدمة في هذا البروتوكول من أجل التحويل الحراري الضوئي الفعال عند 860 نانومتر NIR ، مما يسمح بتحقيق درجات حرارة عالية الحرارة المعتدلة بسرعة في غضون ثوان. بمجرد الوصول إلى نطاق درجة الحرارة هذا ، يمكن الحفاظ عليه بثبات لمدة 5 دقائق من العلاج ، والتي قررنا أنها كافية للحث على موت الخلايا المناعية والتنشيط المناعي. يوفر الطول الموجي 860 نانومتر NIR نفسه أيضا توازنا مناسبا بين عمق اختراق الأنسجة وسلامتها ، مما يعزز النافذة العلاجية لهذه الطريقة.

باختصار ، يقدم بروتوكولنا بديلا موحدا ومعتمدا وفعالا بيولوجيا لمناهج ارتفاع الحرارة الحالية بوساطة GNR ، ويملأ فجوة حرجة في هذا المجال من خلال توفير طريقة مفصلة بالكامل وقابلة للتكيف مناسبة لأبحاث السرطان قبل السريرية وتطوير العلاج المركب.

التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية
أخيرا ، على الرغم من أنه يمكن دمج هذا البروتوكول بسهولة مع علاجات السرطان المختلفة ، إلا أنه مناسب بشكل خاص لتعزيز فعالية العلاجات المناعية ، نظرا لقدرة THT المتأصلة على تحفيز المناعة المضادة للسرطان. من خلال إحداث موت الخلايا المناعية ، وتعزيز إطلاق المستضدات الخاصة بالورم ، وزيادة عدد الخلايا المناعية الفطرية التي يتم تجنيدها في TME في غضون 48 ساعة بعد العلاج ، يساعد THT بوساطة GNR على "إعادة توعية" الأورام الباردة مناعيا للكشف عن الجهاز المناعي ومهاجمته13. نتيجة لذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحسين فعالية العلاجات المناعية في علاج السرطانات التي ربما تكون قد طورت مقاومة سابقا ، مما يوفر استراتيجية محتملة للتغلب على حواجز علاج السرطان وتطور المرض13.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أن هذه الدراسة تلقت تمويلا من شركة Sona Nanotech Inc. شارك الممول في الدراسة التالية: توفير التمويل للمواد والموارد اللازمة للبحث ، بالإضافة إلى دعم الأهداف العامة للمشروع. كارمان جياكومانتونيو هي كبيرة المسؤولين الطبيين في شركة Sona Nanotech Inc.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بامتنان بالدعم المالي من شركة Sona Nanotech Inc. نود أيضا أن نشكر مؤسسة سيدني كروسبي ، والدكتور مارك جونستون ، وقسم الجراحة في جامعة دالهوزي ، وكرسي مركز العلوم الصحية في جبل وجميل راميا QEII في مؤسسة أبحاث الأورام الجراحية ، ومنحة DMRF Capital Equipment على مساهماتهم السخية ، وكلها دعمت هذا البحث. شكرا لريك وليندسي كلارك على توفير معدات الأفلام والمساعدة في إخراج المشهد. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام https://BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تربسين   ؛ثيرمو فيشر العلمي25200-056
10 مل Stripetteفيشر العلمية7200574
15 مل أنبوب فالكونكورنينج352095
حقنة 1 ملBD Biosciences3331431
إبرة 28 جرامBD Biosciences1298811
خط خلايا سرطان الثدي 4T1مجموعة ثقافة النوع الأمريكيCRL-2539
5 مل Stripetteفيشر العلمية7200573
أنبوب الصقر 50 ملفيشر العلمية14-432-22
70٪ إيثانولالكحول التجاري36195
جل الصبارعلامة لايف براند57800985495
B16-F10 خط خلايا الورم الميلانينيمجموعة ثقافة النوع الأمريكيCRL-6475
بيوريندربيو رندرغير متاح
خزانة السلامة الثنائيةنويرغير متاح
نظارات السلامة بالليزر من الفئة 4   ؛ليزر فيجنF22. ص 5 بي18.5000استخدمنا إطار P22 مع مرشح P5P18
حاضنة ثاني أكسيد الكربون < الفرعية > 2 < / فرعية > (37 & درجة ؛ ج، 5٪ ثاني أكسيد الكربون <الفرعي>2)نويرغير متاح
كورنينج 1-200 & L ماصة أرفف Universal Fit   ؛ النصائحكورنينج4865
ماصة Corning المفلترة  نصائح, 30 µ Lفيشر العلمية07-200-265
CT26 خط خلايا القولون والمستقيم في الفئرانمجموعة ثقافة النوع الأمريكيCRL-2638
DPBSثيرمو فيشر العلمي10010-049
أنابيب Eppendorfثيرمو فيشر العلمي3451
إناث الفئران BALB / cمختبرات نهر تشارلز (مونتريال ، كندا)028
أنثى C57Bl/6مختبرات نهر تشارلز (مونتريال ، كندا)027
مصل الأبقار الجنينيةThermo Fisher العلمي invitrogen12483020
GNRشركة سونا نانوتكغير متاح
مسبار درجة الحرارة داخل الورماوميغاHYP1-30-1 / 2-T-G-60-SMP-Mمسبار مزدوج حراري موديل HYP-1
IsoTip 1000 µ L ماصة عالمية مفلترة   ؛ النصائحكورنينج4809
ليزر LDX (الموديل: LDX- 3520-860-HHLFC)مينيترونيكسغير متاحتيار الليزر بحد أقصى لنقطة الضبط عند 4600 مللي أمبير
زيوت العين Optixcareأفينتيكسغير متاح
البنسلين - الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15140148
بريزم 10.6.0لوحة الرسم البيانيغير متاح
RPMI 1640 متوسطثيرمو فيشر العلمي11875119
TC-08 برنامج مسجل البيانات الحرارية   ؛تقنية بيكوبيكولوج V5.25.3
كاميرا حرارية هايك مايكروهاتف إيه 1086922
صحن زراعة الأنسجة 100 × 20 ممفيشر العلمية877222
محلول تريبان بلو 0.4٪ثيرمو فيشر العلمي15250061
الفرجار قياس الورم   ؛شركة جايلز العلميةMitutoyo500-321

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crezee, J., Franken, N. A. P., Oei, A. L. Hyperthermia-based anti-cancer treatments. Cancers (Basel). 13 (6), 1-4 (2021).
  2. Zhang, Y., Li, Z., Huang, Y., Zou, B., Xu, Y. Amplifying cancer treatment: advances in tumor immunotherapy and nanoparticle-based hyperthermia. Front Immunol. 14, 1258786(2023).
  3. Huang, X., Lu, Y., Guo, M., Du, S., Han, N. Recent strategies for nano-based PTT combined with immunotherapy: from a biomaterial point of view. Theranostics. 11, 7546-7569 (2021).
  4. Yi, G. Y., Kim, M. J., Kim, H. I., Park, J., Baek, S. H. Hyperthermia treatment as a promising anti-cancer strategy: therapeutic targets, perspective mechanisms and synergistic combinations in experimental approaches. Antioxidants (Basel). 11, 625(2022).
  5. Hajebi, S., et al. Advances in stimuli-responsive gold nanorods for drug-delivery and targeted therapy systems. Biomed Pharmacother. 180, 117493(2024).
  6. Cancino-Bernardi, J., et al. Gold-based nanospheres and nanorods particles used as theranostic agents: an in vitro and in vivo toxicology studies. Chemosphere. 213, 41-52 (2018).
  7. Cheng, D., et al. Dual-responsive nanohybrid based on degradable silica-coated gold nanorods for triple-combination therapy for breast cancer. Acta Biomater. 128, 435-446 (2021).
  8. Qin, H., et al. Biosynthesized gold nanoparticles that activate Toll-like receptors and elicit localized light-converting hyperthermia for pleiotropic tumor immunoregulation. Nat Commun. 14, 5178(2023).
  9. Wu, L., et al. Enzyme-responsive multifunctional peptide coating of gold nanorods improves tumor targeting and photothermal therapy efficacy. Acta Biomater. 86, 363-372 (2019).
  10. Chatterjee, D. K., Diagaradjane, P., Krishnan, S. Nanoparticle-mediated hyperthermia in cancer therapy. Ther Deliv. 2, 1001-1014 (2011).
  11. Scutigliani, E. M., Liang, Y., Crezee, H., Kanaar, R., Krawczyk, P. M. Modulating the heat stress response to improve hyperthermia-based anticancer treatments. Cancers (Basel). 13 (6), 1-20 (2021).
  12. Liu, Y. T., Sun, Z. J. Turning cold tumors into hot tumors by improving T-cell infiltration. Theranostics. 11, 5365-5386 (2021).
  13. Kennedy, B. E., et al. Targeted intra-tumoral hyperthermia using uniquely biocompatible gold nanorods induces strong immunogenic cell death in two immunogenically 'cold' tumor models. Front Immunol. 15, 1512543(2025).
  14. Chen, H., et al. Depleting tumor-associated Tregs via nanoparticle-mediated hyperthermia to enhance anti-CTLA-4 immunotherapy. Nanomedicine (Lond). 15, 77-92 (2020).
  15. Oei, A. L., et al. Enhancing the abscopal effect of radiation and immune checkpoint inhibitor therapies with magnetic nanoparticle hyperthermia in a model of metastatic breast cancer. Int J Hyperthermia. 36, 47-63 (2019).
  16. Mouratidis, P. X. E., Costa, M., Rivens, I., Repasky, E. E., Ter Haar, G. Pulsed focused ultrasound can improve the anti-cancer effects of immune checkpoint inhibitors in murine pancreatic cancer. J R Soc Interface. 18, 20210266(2021).
  17. Liu, Y., et al. Plasmonic gold nanostar-mediated photothermal immunotherapy for brain tumor ablation and immunologic memory. Immunotherapy. 11, 1293-1302 (2019).
  18. Cano-Mejia, J., et al. Prussian blue nanoparticle-based photothermal therapy combined with checkpoint inhibition for photothermal immunotherapy of neuroblastoma. Nanomedicine. 13, 771-781 (2017).
  19. Okuyama, S., et al. Avoiding thermal injury during near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT): the importance of NIR light power density. Oncotarget. 8, 113194-113201 (2017).
  20. Ruggiero, E., Alonso-de Castro, S., Habtemariam, A., Salassa, L. Upconverting nanoparticles for the near infrared photoactivation of transition metal complexes: new opportunities and challenges in medicinal inorganic photochemistry. Dalton Trans. 45, 13012-13020 (2016).
  21. Sabino, C. P., et al. The optical properties of mouse skin in the visible and near infrared spectral regions. J Photochem Photobiol B. 160, 72-78 (2016).
  22. Lasers in health care. , Canadian Centre for Occupational Health and Safety. Available: https://www.ccohs.ca/oshanswers/phys_agents/lasers.html#section-6-hdr (2021).
  23. Kesharwani, P., et al. Gold nanoparticles and gold nanorods in the landscape of cancer therapy. Mol Cancer. 22, 98(2023).
  24. Zhang, Z., et al. Near infrared laser-induced targeted cancer therapy using thermoresponsive polymer encapsulated gold nanorods. J Am Chem Soc. 136, 7317-7326 (2014).
  25. Liu, X., et al. antigen-trapping gold nanorods elicit anticancer immunity against abscopal tumors by photothermal therapy-induced in situ vaccination. Biomaterials. 275, 120921(2021).
  26. Schuh, E. M., Portela, R., Gardner, H. L., Schoen, C., London, C. A. Safety and efficacy of targeted hyperthermia treatment utilizing gold nanorod therapy in spontaneous canine neoplasia. BMC Vet Res. 13, 294(2017).
  27. Dickerson, E. B., et al. Gold nanorod assisted near-infrared plasmonic photothermal therapy (PPTT) of squamous cell carcinoma in mice. Cancer Lett. 269, 57-66 (2008).
  28. Huff, T. B., et al. Hyperthermic effects of gold nanorods on tumor cells. Nanomedicine (Lond). 2, 125-132 (2007).
  29. Ghafarkhani, M., et al. Mild hyperthermia induced by gold nanorods acts as a dual-edge blade in the fate of SH-SY5Y cells via autophagy. Sci Rep. 11, 23984(2021).
  30. Gong, B., et al. Thermo-responsive polymer encapsulated gold nanorods for single continuous wave laser-induced photodynamic/photothermal tumour therapy. J Nanobiotechnology. 19, 41(2021).
  31. Hainfeld, J. F., et al. Gold nanoparticle hyperthermia reduces radiotherapy dose. Nanomedicine. 10, 1609-1617 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة