مقالة بحثية

تفاعل سلسلة البوليميراز الرقمي Microdroplet للكشف الدقيق عن طفرات سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة

DOI:

10.3791/68770

⸱

يوليو 29, 2025

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف بحساسية وتحديدا عن طفرات EGFR T790M باستخدام تفاعل البوليميراز الرقمي المتسبقي (ddPCR) ، والذي يمكن أيضا تمديده لتحديد طفرات الورم الأخرى بسرعة مثل G719S و L858R و L861Q و S768I.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على المستوى العالمي ، لا يزال سرطان الرئة هو المساهم الرئيسي في الوفيات المرتبطة بالسرطان ، حيث يحتل انتشاره المرتبة الثانية بعد سرطان الكلى. يشكل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) ما يقرب من 80-85٪ من جميع حالات سرطان الرئة المبلغ عنها. تعد طفرة T790M في جين EGFR محددا أساسيا معترفا به على نطاق واسع للمقاومة المكتسبة لمثبطات مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR-TKIs). لوحظ وجود هذه الحالة في حوالي 50-60٪ من أولئك الذين يعانون من مرض تدريجي. لذلك ، فإن تنفيذ نهج سريع وسريع الاستجابة للكشف عن طفرات T790M في جين EGFR أمر ضروري للتحديد السريع لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة. في الدراسة الحالية ، تم استخدام ddPCR للكشف عن طفرة T790M بحد اكتشاف يبلغ 10 نسخ / ميكرولتر ، وهو أعلى بمقدار 10 أضعاف من حساسية qPCR (1 × 102 نسخة / ميكرولتر). بالنسبة للعينات ال 15 التي تمت محاكاتها ، كان ddPCR قادرا على اكتشاف وجود طفرات T790M في جين EGFR ، والتي لوحظ أنها عند مستويات منخفضة عند تحليلها باستخدام qPCR. يتم التحقيق في الكشف عن طفرات T790M داخل جين EGFR بطريقة الكشف السريع لتحديد مدى ملاءمتها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم ، وهو ثاني أكثر الأورام الخبيثة انتشارا بشكل عام. يمثل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) أغلبية كبيرة ، حوالي 80٪ إلى 85٪ ، من جميع حالات سرطان الرئة المبلغ عنها1،2،3،4. بالنسبة للمرضى الذين تم تشخيص إصابتهم ب NSCLC المتقدمة التي تؤوي طفرات EGFR ، يتضمن النهج العلاجي المعمول به تطبيق مثبطات التيروزين كيناز (TKIs) من الجيل الأول أو الثاني أو الثالث (EGFR) 5،6،7. ومع ذلك ، فإن معظم المرضى الذين عولجوا بالجيل الأول أو الثاني من EGFR-TKIs يطورون في النهاية مقاومة مكتسبة للدواء. غالبا ما تعزى هذه المقاومة إلى وجود طفرة T790M في جين EGFR ، والتي توجد في ما يقرب من 50-60٪ من المرضى الذين يعانون من تطور المرض8،9،10،11،12.

تقليديا ، يتم تحديد التشوهات الجينية في الحمض النووي للورم من عينات الأنسجة باستخدام تقنيات مثل التهجين الموضعي الفلوري (FISH) أو تسلسل الجيل التالي (NGS) 13،14. ومع ذلك ، يمكن أن تكون خزعات الأنسجة صعبة بسبب عدم إمكانية الوصول إلى الورم ، أو سوء صحة المريض ، أو عدم كفاية محتوى الخلايا السرطانية15،16،17. كبديل ، توفر الخزعات السائلة ، خاصة من البلازما ، طريقة أقل توغلا لتحديد الطفرات الدافعة عن طريق الكشف عن الحمض النووي للورم المنتشر (ctDNA). تسقط الخلايا السرطانية الحمض النووي في مجرى الدم أو السائل الجنبي أو اللعاب أو البراز ، مما يوفر مصدرا قيما للتحليل الجيني18،19. غالبا ما يعكس المظهر الجيني ل ctDNA التركيب الجيني للورم ، مما يوفر رؤية شاملة لعدم تجانس الورم - وهو عامل حاسم للتشخيص الدقيق والعلاج الشخصي للسرطان20،21.

من بين التقنيات المختلفة لتحديد طفرات EGFR في الدم المحيطي ، بما في ذلك التسلسل ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-PCR) ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي ، وتغيير طبيعة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (DHPLC) ، ونظام الطفرات المقاومة للحرارة (ARMS) ، و PCR المخصب بالطافرة (ME-PCR) ، برز تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات الدقيقة (ddPCR) كأداة فعالة للغاية للكشف عن طفرات ctDNA22،23. حساسيتها الفائقة ودقتها وقدرتها على اكتشاف الطفرات منخفضة الوفرة بدقة عالية تميزها عن غيرها. على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ، يقسم ddPCR العينات إلى آلاف القطرات ، مما يتيح القياس الكمي المطلق لتسلسلات الحمض النووي المستهدف بدون منحنيات قياسية. هذا يجعلها مناسبة بشكل استثنائي للكشف عن الطفرات النادرة مثل طفرة T790M في EGFR. على الرغم من مزايا ddPCR ، إلا أن تطبيقه السريري الواسع النطاق كان محدودا بسبب التحديات في إعداد العينات وتحسين النظام وتحليل الأداء المقارن باستخدام التقنيات الراسخة مثل qPCR. توجد فجوة حرجة في تحسين بروتوكولات ddPCR للكشف عن طفرة ctDNA ، لا سيما فيما يتعلق بالحساسية والخصوصية والاستنساخ الضرورية للتبني السريري.

في هذه الدراسة ، نفترض أن ddPCR يوفر حساسية وموثوقية فائقة للكشف عن طفرة EGFR T790M في ctDNA مقارنة بطرق qPCR التقليدية. ركزنا على تحسين عملية استخراج الحمض النووي لتعزيز الكفاءة ، متبوعا بتحسين ddPCR للكشف عن الطفرات. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بمقارنة أداء ddPCR و qPCR من حيث الحساسية والنوعية والاستنساخ باستخدام عينات محاكاة. من خلال التقييم المنهجي لإمكانات ddPCR ، نهدف إلى ترسيخها كبديل قابل للتطبيق ومتفوق ل qPCR للكشف عن طفرات EGFR في الخزعات السائلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم تشمل هذه الدراسة مشاركين من البشر أو الأنسجة البشرية أو التجارب الحيوانية الحية. وبالتالي ، لم تكن هناك حاجة إلى موافقة أخلاقية رسمية. ونفذت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية. تم تصنيع البلازميد الطافرة T790M تجاريا. تم الحصول على دم الخنزير المستخدم لمحاكاة العينات السريرية من مورد معتمد يتبع لوائح رعاية ، دون مشاركة حية. جميع الكواشف الأخرى ، بما في ذلك الخرز المغناطيسي ، والبادئات ، والمجسات ، وإنزيمات PCR ، تم الحصول عليها من مصادر تجارية واستخدامها وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.

استخراج الحمض النووي
تم إجراء استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الخرز المغناطيسي وأداة استخراج الحمض النووي الأوتوماتيكية بالكامل. تضمن الإجراء القياسي إضافة 200 ميكرولتر من العينة و 20 ميكرولتر من البروتيناز K إلى العمود 1 أو 7 من لوحة البئر العميقة المعبأة مسبقا. بعد ذلك ، تمت إضافة 15 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المرفق مع المجموعة إلى العمود 2 أو 8. بدأ برنامج الاستخراج على الأداة ، مع وضع الغلاف المغناطيسي في موقعه المحدد. بعد الاستخراج ، تم نقل السائل من العمود 6 أو 12 إلى أنبوب جديد خال من النوكلياز سعة 1.5 مل وتخزينه عند -20 درجة مئوية.

لتحسين استخراج الأحماض النووية المستهدفة منخفضة التركيز ، تم إجراء تجارب التحسين. كانت معلمات الاستخراج الموصى بها: درجة حرارة التحلل 70 درجة مئوية ، ووقت التحلل 10 دقائق ، ودقيقة واحدة لكل من محاليل الغسيل الثلاثة ، ودقيقتين للتجفيف ، و 3 دقائق من الشطف عند 56 درجة مئوية. تم تحسين المعلمات الأكثر تأثيرا بشكل منهجي: درجة حرارة التحلل (62 درجة مئوية ، 66 درجة مئوية ، 70 درجة مئوية ، 74 درجة مئوية ، و 78 درجة مئوية) ، ووقت التحلل (1 ، 3 ، 5 ، 7 ، و 9 دقائق) ، وحجم الخرزة المغناطيسية (100 نانومتر ، 200 نانومتر ، 300 نانومتر ، 400 نانومتر ، 500 نانومتر ، و 1000 نانومتر). تم إجراء هذه التحسينات باستخدام البلازميد الطافرة T790M عند 1 × 105 نسخ / ميكرولتر. تم تزويد الخرزات المغناطيسية 100 نانومتر مع مجموعة الاستخراج ، بينما تم الحصول على أحجام جسيمات أخرى من شركة تكنولوجيا حيوية. تم تقييم كفاءة كل حالة من حالات الاستخراج من خلال تحليل منحنيات تضخيم qPCR وقيم Ct للعينات المستخرجة. تم إجراء التحليل الإحصائي لهذه النتائج باستخدام البرمجيات الإحصائية.

الحمض النووي البلازميد القياسي
تم تصنيع البلازميد الطافرة T790M لجين EGFR خصيصا من قبل شركة تكنولوجيا حيوية. تم تعليق أربعة ميكروغرامات من مسحوق البلازميد الجاف في 100 ميكرولتر من 1x TE Buffer. تم تحديد تركيز البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تم حساب رقم النسخة لكل ميكرولتر باستخدام الصيغة: رقم النسخ / ميكرولتر = [(6.02 × 1023) × (تركيز الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) × 10-9)] / (طول الحمض النووي في أزواج القواعد × 660). كان تركيز الجزء المركب 1.26 × 109 نسخ / ميكرولتر. ثم تم تخفيف بلازميد المخزون هذا 126 ضعفا للحصول على تركيز عمل يبلغ 1 × 108 نسخ / ميكرولتر.

تصميم وتوليف التمهيدي
تم تصميم البادئات ومسبار TaqMan لطفرة EGFR T790M باستخدام Primer 6 بناء على مبادئ تصميم التمهيدي القياسية. التمهيدي المنبع: 5 ′-CCTCACCTCACCGTGC-3 ′ ؛ التمهيدي المصب24: 5 ′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3 ′ ؛ المسبار: 5 ′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3 ′. تم تصنيع جميع البادئات والمجسات بواسطة خدمة تخليق قليل النوكليوتيدات التجارية.

إنشاء وتحسين نظام الكشف الكمي الفلوري ddPCR و TaqMan
تم تخفيف مخزون البلازميد T790M من 1 × 108 نسخ / ميكرولتر إلى 1 × 106 نسخ / ميكرولتر باستخدام 1× TE Buffer لاستخدامه في تجارب تحسين نظام ddPCR و qPCR.

تحسين نظام ddPCR: تم تحسين نظام ddPCR بناء على توصيات الشركة المصنعة للإنزيم. تضمن النظام الأولي الموصى به: 7.5 ميكرولتر من مزيج 4x PCR ، 1.2-3 ميكرولتر من التمهيدي المنبع (10 ميكرومتر) ، 1.2-3 ميكرولتر من التمهيدي المصب (10 ميكرومتر) ، 0.3-1.8 ميكرولتر من المسبار (10 ميكرومتر) ، 1-15 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، والماء الخالي من النوكلياز إلى حجم نهائي قدره 30 ميكرولتر. تضمنت دورة التضخيم الموصى بها 10 دقائق أولية عند 95 درجة مئوية ، تليها 40 دورة من 30 ثانية عند 94 درجة مئوية و 60 ثانية عند 55-65 درجة مئوية. تم تحسين درجة حرارة التلدين (55-61.8 درجة مئوية) ، وتركيز التمهيدي (1-3 ميكرولتر) ، وتركيز المسبار (0.75-1.75 ميكرولتر) ، وتركيز القالب (3-15 ميكرولتر) بشكل منهجي. تم تحليل نتائج التحسين إحصائيا باستخدام البرامج الإحصائية.

تحسين نظام qPCR: تم تحسين نظام qPCR وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للإنزيم. تضمن النظام الأولي المقترح: 5 ميكرولتر من بوليميراز Taq ، و 0.45 ميكرولتر من 250 ملي مولار MgCl2 ، و 0.5-2.5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر) ، و 0.5-2.5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر) ، و 0.5-2.5 ميكرولتر من المسبار (10 ميكرومتر) ، و 5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي ، والماء الخالي من النوكلياز إلى حجم نهائي قدره 25 ميكرولتر. كان برنامج التضخيم الموصى به 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. تليها 45 دورة من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية و 30 ثانية عند 56-64 درجة مئوية ، مع جمع التألق عند 56-64 درجة مئوية. تم تحسين درجة حرارة التلدين (56-64 درجة مئوية) ، وتركيز التمهيدي (1-3 ميكرولتر) ، وتركيز المسبار (0.5-2.5 ميكرولتر) ، وتركيز القالب (1-5 ميكرولتر). تم إجراء التحليل الإحصائي لهذه النتائج باستخدام البرمجيات الإحصائية.

ddPCR واختبار حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري تقدير
لتقييم حساسية ddPCR مقابل qPCR ، تم تخفيف البلازميد 1 × 108 نسخ / ميكرولتر T790M بشكل متسلسل 10 أضعاف باستخدام 1x TE Buffer لإنشاء تدرج تركيز يتراوح من 106 إلى 101 نسخة / ميكرولتر. بالنسبة ل ddPCR ، تم إعداد سبعة حلول تفاعلية وفقا لنظام ddPCR الأمثل ، واحد لكل تركيز ، بما في ذلك التحكم السلبي. تم تحميل العينات على شريحة مولد قطرات صغيرة ومعالجتها باستخدام أداة توليد القطرات لتوليد قطرات صغيرة. ثم تم تضخيم هذه القطرات باستخدام جهاز تدوير حراري PCR ثم تم تحليلها لاحقا بواسطة أداة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي. في الوقت نفسه ، تم إعداد سبعة حلول تفاعلية بناء على نظام qPCR الأمثل ، مع قوالب متطابقة. تم تشغيلها على أداة PCR في الوقت الفعلي لتقييم حساسيات النهجين (ن = 3).

اختبارات تكرار ddPCR
لتقييم التكرار ، تم تخفيف الحمض النووي البلازميدي القياسي T790M عند 1 × 108 نسخ / ميكرولتر لتوليد معايير تركيز عالية (1 × 106 نسخ / ميكرولتر) ومتوسطة (1 × 104 نسخ / ميكرولتر) ومنخفضة (1 ×10 2 نسخة / ميكرولتر). تم إعداد ستة حلول تفاعل وفقا لنظام ddPCR الأمثل. تم تحميل العينات على شريحة مولد قطرات صغيرة ومعالجتها باستخدام أداة توليد القطرات لتشكيل قطرات صغيرة. ثم تم تضخيم القطرات الدقيقة باستخدام جهاز تدوير حراري وتحليلها بواسطة أداة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي. تم تضمين عنصر تحكم سلبي. أجريت التجربة في ثلاث نسخ. تم تقييم قابلية التكاثر من خلال مقارنة ملفات تعريف التضخيم وحساب قيم معامل التباين (CV) من التكرارات التجريبية الثلاثة.

اختبار العينة التناظرية
من أجل اختبار موثوقية أنظمة ddPCR و qPCR لطفرة T790M ، استخدمنا دم الخنزير الممزوج بشكل عشوائي بتركيزات عالية ومنخفضة من البلازميدات القياسية الطفرة T790M على التوالي ، وتم استخدام دم الخنزير بدون بلازميدات قياسية مختلطة كعينات سلبية ، وتم تحضير 15 عينة محاكاة بشكل عشوائي ، وتم استخراج الحمض النووي من العينات المحاكاة ، وتم اكتشافها باستخدام طرق ddPCR و qPCR ، على التوالي.

التحليل الإحصائي
تم إجراء جميع التجارب في ثلاث تكرارات تقنية على الأقل. يتم عرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism 10. تم تحليل الاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار t للطالب أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) حسب الاقتضاء. واعتبرت قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحسين استخراج الحمض النووي
يتم تلخيص سير العمل المستند إلى ddPCR للكشف عن طفرة EGFR T790M بشكل تخطيطي في الشكل 1. أولا ، حددنا درجة حرارة التحلل المثلى. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، أسفرت درجة حرارة الانقسام البالغة 66 درجة مئوية عن أصغر متوسط قيمة Ct ، مما يشير إلى الانقسام الأكثر كفاءة. لذلك ، تم اختيار 66 درجة مئوية للتجارب اللاحقة. بعد ذلك ، قمنا بتحسين وقت التحلل عند درجة الحرارة المثلى المحددة البالغة 66 درجة مئوية. يوضح

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لطالما كان سرطان الرئة ، باعتباره السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم ، نقطة محورية في البحث الطبي. في هذه الدراسة ، نستكشف العديد من الجوانب الحاسمة لسرطان الرئة ، بهدف تقديم رؤى أعمق حول تشخيصه وعلاجه وتشخيصه. حجر الزاوية في التشخيص الدقيق والعلاج لسرطان الرئة هو الاختبار الجيني الدقيق. كما أوضح Zhao et al.25 ، يعتمد الاختبار الجيني التقليدي بشكل كبير على عينات الأنسجة عالية الجودة ، وهو مكلف ويستغرق وقتا طويلا. يقدم نموذج DeepGEM ، الذي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قسم العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة يونان وجامعة كونمينغ الطبية مشروع خاص مشترك للبحث الأساسي التطبيقي ، 202101AY070001-134

مساهمة المؤلف
ساهم Youming Lei و Guoli Lv بالتساوي في هذا العمل وهما مؤلفان مشاركان في الأوائل. صمم Youming Lei و Guoli Lv وصمموا الدراسة. ساهم Qingmei Yang في جمع البيانات وتحليلها. أشرف جين دوان ويونفي شي على تحليل البيانات وتفسيرها ، وراجعوا المخطوطة ، ووافقوا على النسخة النهائية ليتم نشرها. لقد قرأ جميع المؤلفين المخطوطة النهائية ووافقوا عليها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 وأقات. TE BufferSangon BiotechB548144Tris-EDTA buffer يستخدم لتخفيف الحمض النووي
4 مرات ؛ مزيج إنزيم Unimix-UTargetingOne BioUNIMIXU-4XddPCR مزيج إنزيم
A300 سريع التدوير الحراريLongGeneA300تضخيم PCR
محلل الرقاقة الحيويةSEED BioDigitalPCR-Biochipنظام الكشف عن الرقاقة الحيوية لجهاز
تحضير عينة علامة الإسقاطPCR أداة Xinyi التكنولوجيا الحيويةالرقمية منصة PCR الرقمية TD-2تحضير القطرات الدقيقة
طقم استخراج الحمض النووي للحبة المغناطيسيةLemnisCare TechnologyMXP-1005رقاقة مولد استخراج الحمض
MicrodropletTargetingOne BiotechMG-Chip-01تستخدم لتوليد قطرات دقيقة ل ddPCR
NanoDropAllshengNC-500قياس تركيز الحمض النووي بعد استخراج
العينة مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND-500Allsheng الأدواتND-500مقياس الطيف الضوئي لقياس الحمض النووي
PCR أداة A300 Fast Heat CyclerLongGeneA300Thermal Cycler لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
الاشعال ومسبار TaqManSangon Biotechبادئات مركبة حسب الطلبومسبار TaqMan للكشف عن T790M
أداة qPCR Gentier miniTianlong تقنيةGentier miniReal-time PCR أداة
T790M طفرة البلازميدTsingke علم الأحياءT790Mالمنحنى القياسي واختبار حد
الرقمية النووي اختبار الكشف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Harkati, I., Hilali, M. K., Oumghar, N., Khouchani, M., Loukid, M. Lifestyle and sociodemographic and economic characteristics of patients with lung cancer in Morocco. Can Respir J. 2020 (1), 8031541(2020).
  4. Zhang, X., Zhao, Y., Wang, M., Yap, W. S., Chang, A. Y. -c Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutations in cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 60 (2), 175-182 (2008).
  5. Hackner, K., et al. Detection of EGFR activating and resistance mutations by droplet digital PCR in sputum of EGFR-mutated NSCLC patients. Clin Med Insights Oncol. 15, 1179554921993072(2021).
  6. Hanna, N., et al. Systemic therapy for stage IV non-small-cell lung cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (30), 3484-3515 (2017).
  7. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 378 (2), 113-125 (2018).
  8. Rosell, R., Bivona, T. G., Karachaliou, N. Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment. Lancet. 382 (9893), 720-731 (2013).
  9. Ohashi, K., Maruvka, Y. E., Michor, F., Pao, W. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease. J Clin Oncol. 31 (8), 1070-1080 (2013).
  10. Simarro, J., et al. Technical validation and clinical implications of ultrasensitive PCR approaches for EGFR-Thr790Met mutation detection in pretreatment FFPE samples and in liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Int J Mol Sci. 23 (15), 8526(2022).
  11. Yu, H. A., et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 19 (8), 2240-2247 (2013).
  12. Wang, W., Song, Z., Zhang, Y. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Cancer Med. 6 (1), 154-162 (2017).
  13. Hendriks, L. E., et al. Lung cancer in the Netherlands. J Thorac Oncol. 16 (3), 355-365 (2021).
  14. Visser, E., et al. Up-front mutation detection in circulating tumor DNA by droplet digital PCR has added diagnostic value in lung cancer. Transl Oncol. 27, 101589(2023).
  15. Ilié, M., Hofman, P. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy. Transl Lung Cancer Res. 5 (4), 420(2016).
  16. Cheng, M. L., et al. Circulating tumor DNA in advanced solid tumors: clinical relevance and future directions. CA Cancer J Clin. 71 (2), 176-190 (2021).
  17. Weber, B., et al. Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays. BMC Cancer. 14, 1-6 (2014).
  18. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  19. Bruhn, N., et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 906 (1), 72-82 (2000).
  20. Kohsaka, S., Petronczki, M., Solca, F., Maemondo, M. Tumor clonality and resistance mechanisms in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: implications for therapeutic sequencing. Future Oncol. 15 (6), 637-652 (2018).
  21. Takeda, M., et al. Impact of coexisting gene mutations in EGFR-mutated non-small cell lung cancer before treatment on EGFR T790M mutation status after EGFR-TKIs. Lung Cancer. 139, 28-34 (2020).
  22. Demuth, C., et al. Measuring KRAS mutations in circulating tumor DNA by droplet digital PCR and next-generation sequencing. Transl Oncol. 11 (5), 1220-1224 (2018).
  23. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Rev Mol Diagn. 18 (1), 7-17 (2018).
  24. Yu, Q., et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Mol Med Rep. 16 (2), 1157-1166 (2017).
  25. Zhao, Y., et al. Deep learning using histological images for gene mutation prediction in lung cancer: a multicentre retrospective study. Lancet Oncol. 26 (1), 136-146 (2025).
  26. Williamson, D. F., et al. Detection of EGFR mutations in non-small cell lung cancer by droplet digital PCR. PLoS One. 17 (2), e0264201(2022).
  27. Tang, C., et al. Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients. Clin Chim Acta. 510, 88-96 (2020).
  28. Xu, S., et al. Exploring the impact of egfr T790m neighboring snps on arms-based t790m mutation assay. Oncol Lett. 12 (5), 4238-4244 (2016).
  29. Merker, J. D., et al. Circulating tumor DNA analysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists joint review. J Clin Oncol. 36 (16), 1631-1641 (2018).
  30. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  31. Newman, A., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med. 20 (5), 548-554 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EGFR T790M qPCR EGFR TKI
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة