مقالة منهجية

التطورات في التنميط الأيضي لكرويات أورام الدماغ ثلاثية الأبعاد لفحص الأدوية

DOI:

10.3791/68833

⸱

سبتمبر 5, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقوم بإنشاء منصة للتنميط الأيضي تدمج كرويدات الورم الدبقي ثلاثية الأبعاد (3D) والتطبيع القائم على التصوير عبر تحليل التدفق خارج الخلية. يتيح هذا النهج تقييما أكثر دقة للاستجابات الأيضية للورم للعلاجات الدوائية ويوفر رؤى حول آليات المقاومة المحتملة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصعب علاج أورام المخ ، وخاصة الأورام الدبقية ، بسبب طبيعتها العدوانية وبيئتها الدقيقة المعقدة للورم ومقاومتها للعلاجات التقليدية. غالبا ما تفشل مزارع الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في تكرار بيئة الورم الحقيقية ، مما يؤدي إلى تنبؤات غير دقيقة لفعالية الدواء. تقيس تقنية تحليل التدفق خارج الخلية ، التي تستخدم عادة لتحليل التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي في الثقافات ثنائية الأبعاد ، المعلمات الأيضية الرئيسية ، مثل معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ، مما يوفر رؤى حول التمثيل الغذائي الخلوي. يمثل استخدام النماذج ثلاثية الأبعاد تقدما كبيرا ، لأنها تحاكي بشكل أكثر دقة بيئة الورم في الجسم الحي . تم تكييف محلل التدفق خارج الخلية مع نماذج خلايا الورم الدبقي ثلاثية الأبعاد (3D) ، مما يتيح تحليل مسارات التمثيل الغذائي الحرجة ، بما في ذلك تحلل السكر والفسفرة المؤكسدة ، في سياق أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية.

تم زرع خلايا U87 بكثافات مناسبة في صفيحة منخفضة الارتباط مكونة من 96 بئرا وتم زراعتها لمدة 5 أيام. في اليوم 5 ، لوحظ تكوين كروي ثلاثي الأبعاد عن طريق التصوير عالي المحتوى. ثم تم نقل الفيريات التي تم تشكيلها بنجاح إلى لوحة فحص التمثيل الغذائي المغلفة ب poly-L-lysine لتحليل التمثيل الغذائي. لتحسين دقة هذه القياسات ، تقوم أنظمة التصوير عالية المحتوى بتقييم حجم الخلية ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح بالتطبيع الدقيق لبيانات التدفق خارج الخلية وتقليل الاختلافات الأيضية بسبب الاختلافات في حجم الخلية. يوفر هذا النهج المتكامل تحليلا أكثر موثوقية للاستجابات الأيضية لخلايا الورم الدبقي للعلاجات الدوائية ، مما يكشف عن الآليات المحتملة لمقاومة الأدوية. في النهاية ، تقدم هذه المنهجية رؤى قيمة حول ديناميكيات التمثيل الغذائي للأورام الدبقية وتدعم تطوير استراتيجيات علاجية جديدة ذات صلة سريريا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكل الأورام الدبقية ، وهي شكل سائد وعدواني من أورام المخ ، تحديات سريرية كبيرة بسبب تطورها السريع ، والبيئة المكروية للورم غير المتجانسة للغاية ، والمقاومة الملحوظة للعلاجاتالتقليدية 1. تتطلب هذه التعقيدات نماذج تجريبية أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لتحسين دقة التقييمات العلاجية. تفشل أنظمة زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في تلخيص بنية الورم في الجسم الحي وتفاعلات الخلية2 ، مما يؤدي غالبا إلى استنتاجات مضللة فيما يتعلق بفعالية الدواء وبيولوجياالورم 3.

لمعالجة هذه القيود ، ظهرت نماذج الورم ثلاثية الأبعاد (3D) كبديل متفوق ، مما يوفر أهمية بيولوجية معززة من خلال محاكاة الخصائص الهيكلية والوظيفية للأورام في الجسم الحي4،5. في الوقت نفسه ، يتم التعرف على إعادة برمجة التمثيل الغذائي بشكل متزايد كسمة مميزة لتطور الورم الدبقي ومقاومةالعلاج 6،7،8. أصبح تحليل التدفق خارج الخلية تقنية معتمدة على نطاق واسع لقياس معلمات التمثيل الغذائي الرئيسية في الوقت الفعلي ، مثل معدل التحمض خارج الخلية (ECAR ، قياس تدفق البروتون بشكل أساسي من إنتاج اللاكتات المحللة للسكر) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR ، تحديد استخدام الأكسجين في الميتوكوندريا في الفسفرة المؤكسدة) ، مما يوفر رؤى مهمة حول مسارات الفسفرة المحللة للسكر والأكسدة9،10،11.

في هذه الدراسة ، تم تكييف تحليل التدفق خارج الخلية لتحليل كرويات الورم الدبقي ثلاثية الأبعاد ، مما يتيح التحقيق في مسارات التمثيل الغذائي في سياق يشبه إلى حد كبير ظروف الورم في الجسم الحي . تم زرع خلايا الورم الدبقي U87 بكثافة 1,500 خلية لكل بئر في صفائح شفافة مستديرة القاع منخفضة للغاية من 96 بئرا وتم زراعتها لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لتسهيل تكوين كروي. تم استخدام التصوير عالي المحتوى لتأكيد التشكل الكروي وتقييم حجم الخلية. قبل التحليل الأيضي ، تم نقل كرويات الخلايا ثلاثية الأبعاد الكثيفة والدائرية التي يبلغ قطرها حوالي 220 ميكرومتر إلى ألواح الفحص المطلية مسبقا ب poly-L-lysine لضمان استقرار الالتصاق والقياس. الأهم من ذلك ، تم إجراء تطبيع البيانات الأيضية على أساس الحجم الكروي عبر تصوير متكامل عالي المحتوى ، مما يقلل من التباين ويعزز موثوقية البيانات.

تتيح هذه المنصة المتكاملة ، التي تجمع بين الثقافة ثلاثية الأبعاد ، وتقنية تحليل التدفق خارج الخلية ، والتطبيع القائم على التصوير ، تقييما أكثر دقة للاستجابات الأيضية للورم الدبقي للتدخلات العلاجية. توفر هذه الدراسة إطارا قويا لدراسة الأسس الأيضية لمقاومة الأدوية وتساهم في تطوير استراتيجيات علاج أكثر فعالية وقابلة للترجمة سريريا للأورام الدبقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تفصيل المواصفات الكاملة لجميع الكواشف والمواد الاستهلاكية في جدول المواد.

1. ثقافة الخلايا 2D

  1. الحفاظ على خلايا U87 في الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) مع 10٪ (v/v) مصل بقري الجنين (FBS) في ظل ظروف معقمة. قم بإجراء إجراءات المرور القياسية بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء.
    ملاحظة: طوال عملية الاستزراع ، راقب عن كثب حالة الخلية واستبعد الخلايا التي تظهر نموا غير طبيعي أو تغيرات مورفولوجية من التجارب اللاحقة.
  2. قم بزرع خلايا U87 في أطباق زراعة الخلايا مقاس 10 سم وتحتضن في حاضنة زراعة الخلايا المعقمة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ (حجم / حجم) ثاني أكسيد الكربون2 و 90-95٪ رطوبة نسبية.
    ملاحظة: يجب استبدال الوسط بانتظام للحفاظ على ظروف النمو المثلى.

2. 3D تكوين كروي للخلايا

  1. التحضير التجريبي
    1. راجع سير العمل بالكامل في الشكل 1 قبل البدء في الإجراءات التجريبية.
      تنبيه: التزم الصارم بالتقنيات المعقمة طوال التجربة لضمان صحة الخلية ومنع التلوث.
  2. تفكك الخلايا وعدها
    1. قم بإزالة الوسط المستهلك من طبق زراعة الخلايا وغسل خلايا U87 ثلاث مرات باستخدام 9 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) (3 مل لكل غسلة). تخلص من الكواشف المستخدمة في محلول مبيض بنسبة 20-25٪ (حجم / حجم) لتعطيل جميع المواد النشطة بيولوجيا.
    2. أضف 1 مل من محلول التربسين إلى الطبق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق. قم بتحييد التربسين مع 2 مل من DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية بمجرد فصل جميع الخلايا تحت المراقبة المجهرية.
    3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بسعة 200 × جم لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS. قم بضرب الخلايا برفق لضمان تعليق خلية موحد. ثم العد عبر مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي ، وسجل عدد الخلايا الأولي.
      ملاحظة: تعامل مع الخلايا برفق أثناء الغسيل وإضافة الوسائط لتجنب التلف الميكانيكي. يمكن التحكم في قوة سحب العينات لمنع تكوين الفقاعات ، مما قد يؤثر على بقاء الخلية ودقة العد.
  3. تخفيف تعليق الخلية
    1. سخن الوسط غير المستخدم إلى 37 درجة مئوية. حافظ على تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ 25 ± 2 °C) لمدة 30 دقيقة.
    2. على أساس عدد الخلايا الأولي ، قم بتخفيف معلق الخلية باستخدام DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى حجم نهائي يبلغ 20 مل ، مما يضمن ما يقرب من 200,000 خلية.
      ملاحظة: قبل التخفيف النهائي، قم بعمل ماصة معلق الخلية برفق لمنع الترسيب. تم الحفاظ على الوسط غير المستخدم عند 37 درجة مئوية ، وتم احتضان معلقات الخلية في RT. إذا تم زرع 96 بئرا بها 1500 خلية لكل بئر ، فقد تم إعداد حجم إجمالي قدره 22 مل لحساب الفائض. تم نقل معلق الخلية المخفف إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل وخلطه جيدا.
  4. بذر الخلايا في ألواح 96 بئرا منخفضة للغاية
    1. امزج معلق الخلية النهائي جيدا عبر ماصة سعة 200 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولتر من المعلق (1,500 خلية / بئر) ببطء إلى كل بئر من لوحة 96 بئر مستديرة شفافة ذات قاع دائري للغاية ومنخفضة للغاية على طول الحافة.
      ملاحظة: لتحقيق الكفاءة، ضع في اعتبارك استخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. تخلص من أي تعليق متبقي بعد ملء جميع الآبار لمنع التلوث.
  5. الطرد المركزي
    1. أغلق اللوحة بإحكام باستخدام البارافيلم لمنع التسرب أثناء الطرد المركزي. الطرد المركزي الخليط على حرارة 200 × جم لمدة دقيقتين لتكوير الخلايا في قاع كل بئر.
    2. قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي ، وقم بإزالة البارافيلم بعناية ، وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .

3. طلاء Poly-D-Lysine للوحات الفحص الأيضي

ملاحظة: صفيحة دقيقة لفحص التمثيل الغذائي عبارة عن صفيحة دقيقة متخصصة مصممة للالتصاق كروي الخلية أثناء تحليل التدفق خارج الخلية.

  1. تحضير محلول طلاء عن طريق إذابة 5 ملغ من بولي د-ليسين في 50 مل من الماء المعقم. تخلط جيدا.
  2. أضف 30 ميكرولتر من محلول الطلاء إلى كل بئر من لوحة الفحص الأيضي. تأكد من عدم وجود فقاعات عن طريق هز المحلول الزائد برفق أو شفطه.
  3. احتضن اللوحة وقم بتغطيتها لمدة 20 دقيقة في RT. قم بشفط محلول الطلاء ، واغسل الآبار مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم.
  4. جفف اللوحة بالهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل ثم قم بتسخينها عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة لتثبيت الطلاء.
  5. أضف 175 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا إلى كل بئر ، واحتفظ باللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصبح جاهزة لنقل كروي الخلية.

4. مراقبة النمو الكروي

  1. انقل الألواح الكروية إلى نظام تصوير عالي المحتوى بعد 5 أيام من الاستزراع.
  2. معلمات تصوير التكوين: اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون2 إلى 5٪، واضبط نوع اللوحة والقنوات ونطاق التركيز البؤري.
  3. احصل على صور كروية عبر مجهر متحد البؤر بأهداف 10x وبرنامج تصوير.
  4. تحديد الآبار التي تحتوي على كرويات سليمة (على سبيل المثال ، الشكل 2A-C) وتسجيل مواقعها للنقل. استبعاد الآبار ذات الكرات غير المنتظمة (على سبيل المثال ، الشكل 2 د)."

5. العلاج الكروي

ملاحظة: تم إجراء العلاج بالعقاقير على الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد الناضجة لتقييم الاستجابات الأيضية.

  1. تعيين مجموعة كروية
    1. قم بتعيين الكرويات السليمة لمجموعتين:
      المجموعة الضابطة: 6 آبار مكررة
      مجموعة العلاج: 6 آبار مكررة (معالجة بالفينوفيبراتي)
  2. تحضير محلول الدواء
    1. تحضير محلول عمل الفينوفيبرات في وسط جديد مسخن مسبقا بالتركيز الأمثل (على سبيل المثال ، 100 ميكرومتر).
      ملاحظة: تم إعادة تشكيل مجموعات المعالجة في DMSO بنسبة 100٪ لإنشاء حلول مخزون ، والتي تم تخفيفها لاحقا في وسط طازج مسخن مسبقا. تم إعطاء المجموعات الضابطة نفس التركيز النهائي ل DMSO (0.1٪ من الحجم) كما كان موجودا في العينات المعالجة بالدواء. تم تحديد التركيز النهائي عن طريق فحوصات الاستجابة للجرعة.
  3. استبدال متوسط
    1. استنشق 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر ببطء على طول الجدار.
      ملاحظة: تجنب ملامسة قاع البئر لمنع الاضطراب الكروي.
    2. أضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج إلى آبار التحكم.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل الفينوفيبرات إلى آبار المعالجة.
  4. حضانة ما بعد العلاج
    1. أعد الطبق برفق إلى 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 . ثقافة لمدة 72 ساعة.
  5. التقييم المورفولوجي
    1. تقييم سلامة الكرات الكروية بعد إجراء التصوير في الخطوة 4.

6. نقل الخلايا الكروية

  1. قم بإزالة اللوحة منخفضة التثبيت المحتوية على كروية بعناية من نظام التصوير وضعها على سطح معقم داخل خزانة السلامة الحيوية. ضع لوحة الفحص المطلية ب poly-L-lysine بجوار بعضها البعض لنقلها.
  2. قم بقص طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر لتسهيل الشفط اللطيف لكرويات الخلية دون تلف.
  3. استنشق كل كروي سليم برفق من قاع البئر وانقله إلى البئر المقابل للوحة الخلية ، مما يسمح له بالاستقرار لمدة 20 ثانية. تأكد من الالتصاق بعدم وجود شظايا عائمة تحت الفحص المجهري 10×.
  4. كرر العملية لجميع الكرويات وتحقق من كفاءة النقل عبر نظام التصوير الموضح في الخطوة 4.

7. فحص التمثيل الغذائي

  1. تفريغ العينات
    1. ضع لوحة الفحص الكروي المعالجة بالعقاقير في غرفة ترطيب متوازنة مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية خالية من ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: تم إجراء التفريغ المستمر لمدة 1 ساعة مع رقابة بيئية صارمة لضمان دقة قياس التمثيل الغذائي.
  2. تحضير الكاشف وإدارة الدواء
    1. بالتوازي تحضير الكاشف وتحميل الدواء خلال فترة التفريغ 1 ساعة.
      ملاحظة: الهدف الأساسي من هذه التجربة هو تقييم إجهاد الميتوكوندريا. يجب أن تتماشى جميع الإجراءات بدقة مع هذا الهدف. يجب اتباع بروتوكولات محددة لأنواع تجريبية متميزة لضمان دقة البيانات وموثوقيتها.
    2. تحضير الدواء: استخدم المركبات التالية:
      أوليغومايسين (مثبط V لمركب الميتوكوندريا)
      كربونيل سيانيد -4 (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP ، مفك الاقتران)
      خليط من الروتينون (مثبط معقد I) ومضاد مايسين أ (مثبط معقد III)
      ملاحظة: تم الحصول على الأدوية من مجموعة اختبار إجهاد الميتوكوندريا المستخدمة في هذه الدراسة. بعض المركبات خطرة بيولوجيا. يجب استخدام بروتوكولات السلامة البيولوجية الصارمة (معدات الحماية الشخصية والتأهب للطوارئ).
    3. تركيبة الدواء
      1. تحضير محاليل مخزون الأدوية المسحوقة كما هو موضح في الجدول 1.
      2. تمييع محاليل المخزون إلى تركيزات العمل المحددة في الجدول 2.
        ملاحظة: يتم تحريك المحاليل أو تحريكها جيدا لضمان التجانس عبر تدرجات التركيز.
  3. تحميل المركبات في خراطيش مسبار الكشف
    ملاحظة: خرطوشة مسبار الكشف عبارة عن خرطوشة يمكن التخلص منها تحتوي على مجسات مستشعر حيوي لقياس الأكسجين ودرجة الحموضة في الوقت الفعلي.
    1. تنشيط خرطوشة المسبار (يجب أن يسبق التحميل المركب):
      ملاحظة: تأكد من تنشيط المستشعر عن طريق إكمال هذه الخطوات قبل 12 ساعة على الأقل من الاستخدام:
      1. أضف 200 ميكرولتر من محلول العيار إلى كل بئر من لوحة الترطيب.
      2. ضع خرطوشة مسبار الكشف بعناية على لوحة الترطيب ، مما يضمن الغمر الكامل لجميع المجسات في محلول العيار.
      3. احتضان الوحدة المجمعة في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون37 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة لتنشيط المستشعرات.
        ملاحظة: يؤدي الغمر غير المكتمل أو الترطيب غير الكافي إلى انحراف القياس (±خطأ في التعرف الضوئي على الحروف بنسبة 15٪).
    2. استخدم ماصات إلكترونية متعددة القنوات لتوصيل كميات دقيقة إلى الآبار، وتجنب القطرات المتبقية عند حواف البئر.
      ملاحظة: نظرا لعدم الحاجة إلى تحفيز الدواء الحاد ، اتبع تسلسلات التحميل القياسية.
    3. ضع لوحة المسبار على سطح ثابت بعد التحميل لمنع الاضطرابات أثناء النقل.
      ملاحظة: تؤثر دقة التحميل بشكل كبير على النتائج.
  4. تكوين البرامج
    1. قم بتشغيل البرنامج وحدد بروتوكول فحص اختبار إجهاد الميتوكوندريا.
    2. قم بتعيين المجموعات وفقا للمجموعة التجريبية المحددة مسبقا.
    3. قم بتعيين اسم الملف وانقر فوق بدء التشغيل.
  5. معايرة خراطيش مسبار الكشف.
    1. أدخل لوحة المسبار المحملة برفق في فتحة الجهاز لكل مطالبة بالنظام.
    2. بدء المعايرة (15-20 دقيقة). الحفاظ على ظروف مستقرة تجنب الاهتزازات.
    3. قم بإزالة لوحة الترطيب على الفور بعد المعايرة (باتباع التعليمات التي تظهر على الشاشة).
      ملاحظة: قم بإزالة غطاء اللوحة قبل المعايرة.
  6. التنميط الأيضي للكرات ثلاثية الأبعاد
    1. انقل لوحة الفحص الكروية ثلاثية الأبعاد المفعوقة إلى فتحة قياس الأداة. تأكد من المحاذاة الدقيقة مع مصفوفة المسبار من خلال تأكيد ما يلي: (i) أدلة فتحة مطابقة زاوية اللوحة ؛ (ثانيا) يتماشى البئر A1 مع الموضع المفهرس ؛ (ثالثا) لا توجد فجوة مرئية بين اللوحة وسطح الجهاز
    2. انقر فوق ابدأ لبدء فحوصات إجهاد الميتوكوندريا (المدة: ~ 1.5 ساعة). مراقبة معلمات الجهاز في جميع الأنحاء.
      ملاحظة: قم بإزالة أغطية لوحة الفحص الكروي ثلاثية الأبعاد قبل القياس.
  7. تحليل البيانات
    1. تحليل التصوير
      1. نقل لوحات الفحص الكروية ثلاثية الأبعاد إلى نظام تصوير عالي المحتوى.
        ملاحظة: تم الحصول على الصور كما هو موضح في الخطوة 4. كشف التصوير أن غالبية الكرويات ظلت سليمة ، في حين تعرضت أقلية لأضرار أثناء عملية النقل ، كما هو موضح في الشكل 3.
      2. قم بتحليل البيانات المورفولوجية (على سبيل المثال ، المساحة ، الطول ، العرض) لكرويات الخلية عبر إصدار برنامج Harmony 5.2 ، باتباع الخطوات 7.7.1.3-7.7.1.7.
      3. قم بتطبيق الوحدة النمطية Texture Region بشكل خشن لفصل الكرويات ثلاثية الأبعاد عن الخلفية عن طريق تقسيم محتوى الصورة إلى ثلاث مجموعات على أساس ميزات نسيج الكائنات في الصور.
      4. قم بتطبيق الوحدة النمطية Find Image Region لتحسين فصل الأشكال الكروية ثلاثية الأبعاد المعزولة مسبقا عبر خصائص الحجم المستندة إلى الحجم لإزالة الشوائب والاحتفاظ بالكرات السليمة.
      5. قم بقياس المعلمات المورفولوجية للكفيريات ثلاثية الأبعاد عبر وحدة خصائص الصرف .
      6. قم بتطبيق الوحدة النمطية تحديد السكان لتصفية الخلايا الكروية ثلاثية الأبعاد الأصلية في النهاية.
      7. تصدير نتائج البيانات المورفولوجية ، كما هو موضح في الجدول 3.
    2. معالجة البيانات
      ملاحظة: تطبيع بيانات الخلية عبر المعلمات من مخرجات التصوير لتقليل القطع الأثرية التجريبية.
      1. افتح بيانات التمثيل الغذائي الأولية عبر برنامج التحليل.
      2. حدد خيار التسوية للوصول إلى واجهة تحرير وضع التسوية.
      3. أدخل مساحة المقطع العرضي للمركبات الموجودة في كل بئر مقابل للوحة الفحص في حقل قيم التطبيع .
      4. اضبط معلمة عامل المقياس على 1,000,000.
      5. انقر فوق الزر "تطبيق" لإنهاء عملية التطبيع. النتائج النهائية موضحة في الشكل 4.

8. التخلص من النفايات

  1. تخلص من جميع النفايات التجريبية (الوسائط والكواشف والمواد الاستهلاكية ومعلقات الخلايا) وفقا لبروتوكولات إدارة المخاطر البيولوجية وإدارة النفايات المختبرية. الأوتوكلاف أو تطهير النفايات النشطة بيولوجيا كيميائيا قبل التخلص منها لمنع التلوث البيئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الثلاث الأكثر أهمية في عملية الكشف عن استقلاب الطاقة لكرويات الخلايا ثلاثية الأبعاد هي ثقافة كرويات الخلايا ثلاثية الأبعاد ، وعملية نقل الكروية ، وتصوير الكرويات وتقديرها بعد الكشف (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، فإن مراقبة حالة الخلايا الكروية أمر مهم للغاية. عندما أجريت التجارب وفقا للإجراءات التجريبية المذكورة أعلاه ، تم اكتشاف الكراتفي اليوم الخامس (الشكل 2) ، ونمت الكرويات إلى مساحة متوسطة تبلغ حوالي 50,000 ميكرومتر مربع (الجدول 3

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل تكييف تحليل التدفق خارج الخلية مع نماذج الورم الدبقي ثلاثي الأبعاد تقدما منهجيا حاسما في دراسة استقلاب الخلايا السرطانية. في حين أن الثقافات ثنائية الأبعاد التقليدية كانت بمثابة الأساس للتجارب في المختبر ، إلا أنها فشلت في التقاط الهندسة المكانية ، وتفاعلات الخلية والخلية والمصفوفة ، وتدرجات الأكسجين والمغذيات المميزة للأورام في الجسم الحي 12. هذه الميزات ذات صلة خاصة في الأورام الدبقية ، حيث تلعب إعادة برمجة التمثيل الغذائي دورا رئيسيا في ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ، وأرقام المنح 82471329 و 82001248.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق 10 سمكورنينج430167
أنبوب طرد مركزي 15 ملكورنينج430791
أنبوب الطرد المركزي 50 ملكورنينج430828
كالسين ، صباحاإنفيتروجينم: C1430
الكونتيسة 3ثيرمو فيشرعداد الخلايا الأوتوماتيكي
مصل الأبقار الجنينيةجيبكوA5669701
الانسجام 5.2بيركين إلمربرنامج التصوير
هوشست 33342سولاربيوج0031
MEM EBSS متوسطهايكلونSH30024.01
أوبريت CLSبيركين إلمرنظام تحليل التصوير عالي المحتوى
برنامج تلفزيونيهايكلونSH30256.01
بولي د يسين هيدروبروميدسيجما ص 7280
ألواح مستديرة القاع منخفضة للغاية ب 96 بئراكورنينج4515
برنامج Seahorse Wave Desktopأجيلينت
فرس البحر XFe96أجيلينتآلة اختبار التمثيل الغذائي خارج الجسم
سورفال ST8Rثيرمو فيشرالطرد المركزي
تريبسين 0.25٪ EDTAجيبكو25200072
خط الخلايا U87MG   ؛البنية التحتية الوطنية لموارد الخلايا
XF 1.0 M محلول جلوكوز ، 50 ملأجيلينت103577-100
XF 100 ملي محلول بيروفات ، 50 ملأجيلينت103578-100
XF 200 ملي محلول جلوتامين ، 50 ملأجيلينت103579-100
XF معايرة محلول 500 مل أجيلينت100840-000
طقم اختبار الإجهاد XF Cell Mitoأجيلينت103015-100
XF DMEM متوسط، درجة حموضة 7.4، 500 ملأجيلينت103575-100
XFe96 / XF Pro مصفوفة مسبار الكشف عن Fluxpakأجيلينت103792-100
لوحات الفحص الأيضي XFe96 / XF Pro Fluxpakأجيلينت103792-100

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacol Res. 171, 105780(2021).
  2. Crowley, A. E. 85th annual report on medical education in the United States. Executive summary. Jama. 254 (12), 1553-1554 (1985).
  3. Zhang, X., et al. Nutritionally physiological cell culture medium and 3D culture influence breast tumor proteomics and anticancer drug effectiveness. Pharmacol Res. 210, 107519(2024).
  4. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  5. Bahl, R., et al. Growing desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids from coculture. J Vis Exp. 211, e66625(2024).
  6. Faubert, B., Solmonson, A., Deberardinis, R. J. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 368 (6487), eaaw5473(2020).
  7. Baksh, S. C., Finley, L. W. S. Metabolic diversity drives cancer cell invasion. Nature. 605 (7911), 627-628 (2022).
  8. Yoshida, G. J. Metabolic reprogramming: The emerging concept and associated therapeutic strategies. J Exp Clin Cancer Res. 34, 111(2015).
  9. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  10. Hong, X., Muñoz-Cánoves, P. Measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in muscle stem cells using a Seahorse analyzer: Applicability for aging studies. Methods Mol Biol. 2640, 73-88 (2023).
  11. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Rybkowska, P., et al. The metabolic changes between monolayer (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions in human mesenchymal stem/stromal cells derived from adipose tissue. Cells. 12 (1), 178(2023).
  14. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  15. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  16. Juarez-Moreno, K., Chávez-García, D., Hirata, G., Vazquez-Duhalt, R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 85, 105461(2022).
  17. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. Elife. 9, e52904(2020).
  18. Beaufort, I. N., et al. Author commentary on Ilse N. Beaufort et al. Endoscopy. 56 (5), v6(2024).
  19. Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 542-554 (2021).
  20. Trettner, K. J., Hsieh, J., Xiao, W., Lee, J. S. H., Armani, A. M. Nondestructive, quantitative viability analysis of 3D tissue cultures using machine learning image segmentation. APL Bioeng. 8 (1), 016121(2024).
  21. Dominijanni, A. J., Devarasetty, M., Forsythe, S. D., Votanopoulos, K. I., Soker, S. Cell viability assays in three-dimensional hydrogels: A comparative study of accuracy. Tissue Eng Part C Methods. 27 (7), 401-410 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Poly D Lysine

مقالات ذات صلة