طريقة بسيطة وسريعة للعزل المتزامن للجزر الأولية وخلايا البنكرياس الأولية من الفئران

Summary

طورت هذه الدراسة طريقة مبسطة لاستخراج الجزر الأولية الوظيفية والخلايا الأسينارية بكفاءة من بنكرياس الفأر، مما يوفر أداة قيمة لدراسة التواصل بين الخلايا في مسببات مرض السكري الحاد الناتج عن التهاب البنكرياس.

Abstract

في البحث حول مسببات التهاب البنكرياس بعد الحاد السكري (PPDM-A)، يركز بشكل رئيسي التواصل غير الطبيعي في الاتجاهين بين خلايا البنكرياس الحارة (PACs) وخلايا الجزر الصغيرة. ومع ذلك، لا تستطيع خطوط الخلايا الخالدة تكرار الحالات الفسيولوجية المرضية، مما يجعل استخراج الخلايا الأولية عالية الجودة أمرا بالغ الأهمية. تعتمد الطرق الحالية لاستخراج الجزر الأولية من الفئران بشكل رئيسي على تروية البنكرياس في الجسم الحي عبر قناة القنوات الصفراءية، والتي لها حاجز تقني عالي ولا تساعد على تشغيل الباحثين بدون خبرة.

عدلت هذه الدراسة الطريقة، مما ألغى الحاجة إلى التروية المعقدة داخل الجسم . تم تخدير وقتل الفئران بدرجة SPF C57BL/6J (عمرها 6-8 أسابيع) وقتل الرحيم، تلاها عزل البنكرياس. تم هضم البنكرياس في المختبر باستخدام الكولاجناز P؛ تم فصل الجزر الأولية عبر الطرد المركزي بتدرج كثافة فيكول، وتم الحصول على خلايا أسينار من خلال ترشيح وطرد مركزي بمنخل الخلية. تم تقييم بقاء الخلية ووظيفتها باستخدام صبغة يوديد الكالسيين/البروبيديوم (كالسيين/PI)، واختبار إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز، وكشف نشاط الأميلاز.

أظهرت النتائج أن الطريقة المعدلة كانت سهلة الاستخدام: كان العائد لكل فأر (120 ± 5) جزر أولية و1.6-1.95 × 10⁷ خلايا أسينار؛ كانت معدلات بقاء الجزر وخلايا الأسينار (97.52 ± 0.16)٪ و(96.55 ± 0.95)٪ على التوالي. علاوة على ذلك، أظهرت الجزر الصغيرة قدرة طبيعية على إفراز الأنسولين، وكانت خلايا الأسينار حساسة لتحفيز السيرولين. هذه الطريقة بسيطة وموثوقة، وتوفر إطارا عمليا لدراسة التفاعلات بين البنكرياس والإخراج والغدد الصماء وPPDM-A. ومع ذلك، له قيود، مثل التطبيق غير المتحقق من صحته في الفئران.

Introduction

يمكن لالتهاب البنكرياس الحاد (AP) أن يعطل وظيفة الغدد الصماء في البنكرياس من خلال عدة مسارات، مثل إصابة البنكرياس المحيطي والسلاسل الالتهابية، مما يؤدي إلى التهاب البنكرياس الحاد لداء السكري (PPDM-A^)1,2. حاليا، لا يزال العامل الأساسي لمرض PPDM-A غير واضح، ويعد التواصل غير الطبيعي في الاتجاهين بين أقسام الغدد الصماء والخارجية في البنكرياس محور بحث رئيسي³. على الرغم من أن خطوط الخلايا β الخالدة الموجودة (مثل INS-1، MIN6) تستخدم عادة لنماذج خلايا السكري المختبرية، إلا أن طبيعتها المشتقة من الأورام تؤدي إلى اختلافات كبيرة عن الخلايا الأولية الطبيعية للجزر من حيث استجابة الجلوكوز وتباين الخلايا. وبالتالي، لا يمكنها حقا تكرار الحالة الفيزيولوجية المرضية في البيئة الدقيقة لالتهاب البنكرياس الحاد ^4,5. لذلك، أصبح الحصول على جزر أولية عالية الجودة وخلايا أسينار الأساس التقني الأساسي لتوضيح آلية تفاعلها.

تعتمد الطرق الحالية لعزل الجزر الأولية من الفئران بشكل أساسي على تقنية قنية القنوات، التي تتضمن تحديد الموقع الدقيق وتقنب القناة الصفراوية لحقن محلول الكولاجيناز في نسيج البنكرياس لعملية التروية في الجسم الحي ^6,7. ومع ذلك، لعزل الجزر الأولية من الفئران حديثة الولادة^{، حقق} هوانغ وآخرون نتائج ممتازة باستخدام الهضم المجري دون تروية البنكرياس في الجسم الحي. استنادا إلى خبرة فريق البحث لدينا العملية، فإن إجراء تفريغ البنكرياس الأمثل عبر قنوات الصفراء يمثل تحديا بسرعة وفعالية دون تدريب متخصص. استلهاما من طريقة عزل الجزر الأولية عن الفئران الوليدة، عدل فريقنا بروتوكول الاستخلاص ليصبح أكثر سهولة وسهولة للباحثين الذين لا يملكون خبرة في التروية. يوفر هذا النهج المعدل أيضا بديلا أبسط لعزل الجزر الأولية عن الفئران الصغيرة أو تلك التي لديها قنوات صفراء حساسة. علاوة على ذلك، تقدم هذه الطريقة مزايا في كفاءة العزل (الكمية) والنقاء (الجودة) للجزر الصغيرة وخلايا الأسينار. يتيح ذلك للباحثين إجراء تجارب ضمن نفس السياق المرضي والفسيولوجي، مما يسهل تحليلا معمقا لآلية التفاعل بين الجزر والخلايا الأسينارية.

تتطلب الطريقة تحكما صارما في وقت هضم البنكرياس؛ تفريغ البنكرياس قبل الهضم هو أيضا خطوة حاسمة. بالإضافة إلى ذلك، يجب الانتباه بشدة التشتت الميكانيكي لأنسجة البنكرياس بعد الهضم. تؤثر جميع هذه العوامل على كمية وجودة الجزر المعزولة وخلايا الأسينار. لم يتم التحقق من صحة هذه الطريقة في الفئران ولا يمكن توسيع إنتاجها في الوقت الحالي.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات أو لجنة أخلاقيات مركز المختبرية في مستشفى تشانغهاي (رقم الموافقة: CHEC (A.E)-2025-026). تم الحفاظ على فئران C57BL/6J بدرجة SPF (عمرها 6-8 أسابيع، وزنها 18-25 جرام، ذكر أو إناث، n = 3) على دورة ضوئية/ظلامية لمدة 12 ساعة مع وصول مجاني إلى الطعام (نظام غذاء صيانة) والماء.

يجب جمع الحادات النفايات مثل الحقن والإبر في حاويات الحادة المخصصة للمختبر والتخلص منها من قبل وكالات مهنية مؤهلة. وفقا لإرشادات السلوك الأخلاقي في رعاية واستخدام غير البشرية في البحث، يجب وضع جثث الفئران في فريزر مخصص للمختبر وحرقها من قبل وكالات مهنية.

1. تحضير المواد التفاعلية

ملاحظة: يجب جمع المحاليل مثل وسط تدرج الكثافة المعقم في "أسطوانة جمع النفايات الكيميائية" في المختبر. يجب التخلص من جميع النفايات الكيميائية من قبل وكالات مهنية مؤهلة كما يرتب المختبر.

1. تحضير محلول كولاجناز P
   1. في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل، يزن بالتتابع 25 ملغ من كولاجناز، و42 ملغ من كلوريد الكالسيوم اللامائي، و0.02 جرام من مثبط التريبسين. أضف 45.5 مل من محلول هانك المتوازن للملح و500 ميكرولتر من محلول HEPES، ثم استمر الدوامة حتى تذوب تماما. تعقيم المحلول عن طريق الترشيح عبر فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر، ثم نقل المحلول المفلتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد معقم بسعة 50 مل. ينتج عن ذلك محلول كولاجناز P بسعة 0.5 ملغ/مل، يستخدم لهضم أنسجة البنكرياس لاحقا.
2. معالجة محلول تدرج الكثافة المعقمة
   1. قم بترشيح محلول تدرج الكثافة المعقمة عبر مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر للتعقيم، ثم نقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد معقم بسعة 50 مل. ضع علامة واضحة على معلومات المحلول وخزنها عند 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا. ومن الآن فصاعدا، يشار إليه باسم "فيكول".
3. تحضير حاجز التوقف والوسط الكامل
   1. أضف 10٪ مصل البقري الجنيني (FBS) و1٪ محلول البنسلين-ستربتوميسين إلى وسط DMEM الفارغ ووسط RPMI-1640 على التوالي، لتحضير وسط DMEM كامل ووسط RPMI-1640 كامل (وهو أيضا العامل المؤقت لهضم البنكرياس). ضع علامة واضحة على معلومات المحلول وخزنها عند 4 درجات مئوية للاستخدام لاحقا.
4. تحضير محاليل الجلوكوز بتركيزات مختلفة
   1. في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل، أضف 50 مل من محلول كريبس-رينجر بيكربونات HEPES (KRBH) و0.25 جرام من ألبومين مصل البقر (BSA)-V لتحضير محلول KRBH يحتوي على 0.5٪ BSA. ثم، في محلول KRBH يحتوي على 0.5٪ BSA، في 28.33 مل من محلول KRBH يحتوي على 0.5 مل، أضف 168 ميكرولتر من الجلوكوز (1 م) و1.5 مل من محلول كلوريد الكالسيوم (50 ملليموتر) لتحضير محلول جلوكوز بحجم 5.6 ملليمول. في محلول KRBH يحتوي على 0.5٪ BSA، في 9.28 مل من محلول KRBH يحتوي على 0.5٪، أضف 220 ميكرولتر من الجلوكوز (1 م) و500 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم (50 ملم) لتحضير محلول جلوكوز بحجم 22 ملليمول.

2. عزل جزر البنكرياس وخلايا الحارة في البنكرياس (PACs)

ملاحظة: يجب أن تخضع جميع الأدوات الجراحية للتعقيم باستخدام المعقم الموضعي.

1. أضف محلول الملح المتوازن هانك ومحلول كولاجناز P إلى صفيحة 12 بئرا. وأضف 3 مل من محلول كولاجناز P إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل للهضم لاحقا.
   ملاحظة: أضف 2 مل من محلول الملح المتوازن هانك إلى ثلاثة آبار و2 مل من محلول كولاجناز P إلى بئر واحد.
2. وزن وتخدير الفأر بحقن 1.25٪ من تريبروموإيثانول داخل الصفاق بجرعة 0.025 مل/جم قبل الجراحة، وتحقق من حالة التخدير عن طريق قرص وسادة قدم الفأر: يتم تحديد عمق التخدير بانخفاض تدريجي في معدل التنفس وعدم الاستجابة لضغط وسادة القدم. بمجرد تأكيد التخدير العميق، قم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم. اغمر الفئران في إيثانول بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق للتعقيم، ثم انقلها إلى خزانة أمان حيوي لعزل البنكرياس.
   ملاحظة: يتم توفير تريبروموإيثانول (1.25٪) كمحلول جاهز مسبقا عند الشراء؛ لا حاجة لتحضير يدوي. يجب على الباحثين ارتداء القفازات والكمامات طوال فترة التجربة. إذا حدث تلامس الجلد أثناء حقن 1.25٪ تريبروموإيثانول، امسح فورا المادة المتبقية بالإيثانول اللامائو، ثم اشطف بالماء الجاري لمدة 5 دقائق، ثم ضع مرطبا لتخفيف الجفاف. لا توجد مواد كيميائية تآكلية في هذه الدراسة. يجب جمع المواد الكيميائية النفايات، مثل 1.25٪ تريبروموإيثانول، في حاويات مختومة مخصصة تحمل علامة "نفايات كيميائية خطرة".
3. قم بعمل شق بطني على شكل حرف "V" لفتح تجويف بطن الفأر. العضو اللمفاوي الأحمر الداكن في منطقة الهوس الغضروفي اليسرى هو الطحال، والعضو الأبيض المتصل بالطحال هو البنكرياس. قم بإجراء تشريح دقيق للبنكرياس على طول الحافة السفلية للمعدة ونقطة الربط البنكرياسية الاثني عشر.
4. اغسل الأنسجة المعزولة من البنكرياس في محلول الملح المتوازن هانك وإزالة الوصلات المساريقية المتبقية، والطحال، وأنسجة الدهون حول البنكرياس.
5. انقل البنكرياس المعالج مسبقا إلى صفيحة تحتوي على 2 مل من محلول كولاجناز. ثبت البنكرياس في مكانه بالملاقط باليد اليسرى، واستخدم حقنة 1 مل باليد اليمنى لحقن محلول الكولاجناز P في نسيج البنكرياس حتى يبدو نسيج البنكرياس شفافا ومليئا بالوذمة.
   ملاحظة: حجم محلول الكولاجناز P للتروية يتراوح بين 600-800 ميكرولتر.
6. اقطع البنكرياس إلى قطع نسيج بحجم 1-2 ملم مكعب بسرعة باستخدام المقص الجراحي.
   ملاحظة: حجم قطع الأنسجة يعادل تقريبا القطر الداخلي لرأس ماصة قياسي بسعة 200 ميكرولتر.
7. اقطع الجزء البعيد من 1 إلى 1.5 سم من طرف ماصة بسعة 1 مل (لتكبير الفتحة) واستخدم هذا الطرف المعدل لنقل قطع نسيج البنكرياس مع 2 مل من محلول كولاجناز P إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل محمل مسبقا بمحلول كولاجناز.
8. حضن أنبوب الطرد المركزي في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة، مع هز الأنبوب بلطف كل 5-6 دقائق خلال هذه الفترة.
   ملاحظة: الغرض من هز أنبوب الطرد المركزي هو ضمان الاتصال الكامل بين نسيج البنكرياس ومحلول الكولاجناز.
9. أضف 10 مل من الوسط الكامل RPMI-1640 لإنهاء التأثير الهضمي لمحلول كولاجناز.
10. قم بتقليص الحبيبات مرارا وتكرارا باستخدام ماصة باستور بحجم 5 مل (15-20 حركة صعود وهبوط) حتى لا تبقى كتل نسيج كبيرة واضحة.
11. أضف 10 مل من RPMI-1640 المتوسط الكامل، ثم استخدم الطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتان.
12. أعد تعليق الرصاصة بسعة 20 مل من RPMI-1640 متوسطة كاملة. قم بترشيح نظام التعليق عبر منخل ب 40 شبكة، ثم استخدم الطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
13. تخلص من المادة الفوقية برفق، أضف 20 مل من محلول Ficoll لإعادة تعليق الحبيبة، ثم أضف ببطء 15 مل من RPMI-1640 المتوسط الكامل.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن ملاحظة واجهة سائلة شفافة.
14. استخدم الطرد المركزي بلطف عند 640 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب الاهتزاز العنيف أثناء الطرد المركزي لمنع تعطيل الواجهة.
15. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي بعناية، واسحب الطبقة الحمراء المتوسطة العليا باستخدام ماصة باستور بسعة 5 مل. ثم يتم استنشاق السائل الذي يحتوي على الجزر الصغيرة عند واجهة الطبقة السائلة بحذر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 مل. أضف 20 مل من RPMI-1640 المتوسط الكامل، والطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتانت.
16. أعد تعليق الحبيبة ب 20 مل من RPMI-1640 المتوسط الكامل، والطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية، وتخلص من السوبرناتان.
17. أعد تعليق الحبيبة ب 10 مل من الوسط الكامل RPMI-1640 وانقلها إلى طبق زراعة خلايا بحجم 60 مم.
18. تحت المجهر البيولوجي المقلوب (تكبير 100x)، اختر الجزر الصغيرة يدويا باستخدام ماصة بسعة 20 ميكرولتر. انقل الجزر المختارة إلى صفيحة زراعة خلايا مكونة من 24 بئرا محملة مسبقا ب 500 ميكرولتر من الوسط الكامل RPMI-1640 لكل بئر.
19. تخلص من طبقة محلول فيكول، وأعد تعليق الحبيبة (من الخطوة 2.15) بسعة 10 مل من وسط DMEM الكامل، وتصفية عبر مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر، وجهاز الطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتينت.
20. أعد تعليق الحبيبة ب 10 مل من DMEM متوسط كامل، والطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية، وتخلص من السوبرناتانت. ثم أعد تعليق الحبيبة ب 5 مل من الوسط الكامل DMEM للتجارب القادمة.

3. اكتشاف قابلية الجزر الصغيرة للبنكرياس وخلايا الأسينار

1. انقل الجزر المعزولة وعدد مناسب من الخلايا الأسينارية إلى ألواح زراعة خلايا ب 12 بئرا و24 بئرا تحتوي على 1 مل من الوسط الكامل RPMI-1640 و1 مل من وسط DMEM الكامل على التوالي. ضع الألواح في حاضنة خلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ CO₂ لمدة 15 دقيقة للتوازن.
2. قم بالطرد المركزي بألواح زراعة الخلايا ذات 12 بئرا و24 بئر عند 180 × جرام لمدة 30 ثانية عند 25 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه، حضر مادة التلوين وفقا لتعليمات مجموعة اختبار بقاء وسمية خلايا كالسيين/بروبيديوم (كالسيين/بي آي) (الحماية من الضوء أثناء التحضير).
3. تخلص من الوسط بلطف، وغسل الجزر والخلايا الأسينارية مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، ثم استخدم الطرد المركزي تحت نفس ظروف الخطوة 3.2.
4. تخلص من PBS، وأعد تعليق الجزر والخلايا الأسينارية باستخدام مادة التلوين المحضرة. لف لوحة الزراعة بورق الألمنيوم (لحمايتها من الضوء) وحضن في حاضنة خلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة.
5. تحت بيئة محمية بالضوء، التقط الصور باستخدام مجهر فلوري (تكبير 100x) وأجر تحليل حيوية الخلايا عبر ImageJ.

4. اختبار أسينار أميليز

1. زرع الخلايا الأسينارية في صفيحة مكونة من 12 بئر بكثافة 1.5 × 10⁶ خلايا/بئر مع 1 مل من الوسط. قم بإعداد الخلايا الضابطة (Ctrl) والخلايا المحفزة بالأخضر (10 نانومتر، 20 نانومتر، 50 نانومتر؛ موسومة ب C10، C20، C50). بعد 30 دقيقة من التحفيز، اجمع المواد الفائقة للكشف عن نشاط الأميلاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

5. اختبار إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز

1. زرع 10 جزر صغيرة لكل بئر في صفيحة تحتوي على 24 بئرا. ثبت الجزر الصغيرة في متوسط RPMI-1640 كامل لمدة ساعتين، ثم تخلص من الوسط.
2. حضن الجزر الصغيرة في 1 مل من محلول جلوكوز 5.6 ملليمولار لمدة ساعة واحدة. اجمع السوبرناتينت بعد ذلك.
3. اغسل الجزر الصغيرة باستخدام مخزن KRBH. بعد ذلك، حضن الجزر الصغيرة في محلول جلوكوز 22 ملليمولار لمدة ساعة واحدة وجمع الفائق مرة أخرى.
4. اكتشف تركيزات الأنسولين في الفائقين (من الحالات منخفضة الجلوكوز وعالية الجلوكوز) باستخدام مجموعة ELISA الخاصة ب MIT. احسب مؤشر الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSI):
   GSI = تركيز الأنسولين في وسط عالي الجلوكوز / تركيز الأنسولين في وسط منخفض الجلوكوز

Results

بعد الطرد المركزي بتدرج كثافة محلول فيكول، لوحظت جزر صغيرة بالقرب من الواجهة بين الطبقة السائلة الشفافة عديمة اللون والوسط، مع وجود وحدات PAC كرواسب في أسفل الأنبوب (الشكل 1).

تحت المجهر البصري، كانت الجزر عادة دائرية أو بيضاوية اللون وبنية ذهبية، مع عائد ثابت يبلغ (120 ± 5) جزر لكل فأر (الشكل 2A,B). كانت PACs المعزولة حديثا كروية وموزعة بشكل رئيسي في مجموعات (3-8 خلايا حبة في كل مجموعة). كانت نهايات القمم لخلايا الأسينار أغمق اللون، مع حبيبات زيموجين واضحة الرؤية؛ لم تلاحظ أي حبيبات أو هياكل حويصلية حول الخلايا، وكانت خلفية المحلول واضحة. تراوحت إنتاجية الخلايا الأسينارية بين 1.6 إلى 1.95 × 10⁷ الخلايا لكل فأر [(1.77 × 10⁷) ± (1.75 × 10⁶)] (الشكل 2C,D).

تظهر نتائج صبغ الكالساين/باي للجزر الصغيرة وخلايا الأسينار في الشكل 3A: الخلايا المصبوغة بالكالسين (الأخضر) شكلت الغالبية العظمى، بينما كانت الخلايا المصبوغة ب PI (الحمراء) نادرة. تم إجراء تحليل كمي للصور المتلطخة الحية/الميتة باستخدام ImageJ. أظهرت النتائج أن معدلات بقاء الجزر المعزولة وخلايا الأكينار كانت (97.52 ± 0.16)٪ و(96.55 ± 0.95)٪ على التوالي (الشكل 3B).

كان نشاط الأميلاز القاعدي لخلايا البنكرياس المعزولة (0.79 ± 0.01) U/mL. بعد التحفيز بالكايرولين بتركيزات 10 نانومال، 20 نانومول، و50 نانومال، كانت أنشطة الأميلاز في الخلايا الأسينارية (1.45 ± 0.03) يو/مل، (1.65 ± 0.05) يو/مل، و(1.39 ± 0.02) يو/مل على التوالي. أشارت نتائج تحليل أنوفاك أحادي الاتجاه إلى أنه مقارنة بمجموعة التحكم (Ctrl)، أظهرت جميع المجموعات التي تم تحفيزها بالأخشب فروقا ذات دلالة في نشاط الأميلاز (جميع الف < 0.001). بالإضافة إلى ذلك، لوحظ فرق كبير في نشاط الأميلاز بين مجموعتي السيرولين 20 نانوميل و10 نانومالين (P < 0.001) (الشكل 4A).

عند تحفيزها بمحلول جلوكوز 5.6 ملليمول، كان إفراز الأنسولين في الجزر المعزولة (0.27 ± 0.04) نانوغرام/مل/جزيرة/ساعة. عند تحفيزها بمحلول جلوكوز 22 ملمولار، كان إفراز الأنسولين في الجزر المعزولة (0.94 ± 0.04) نانوغرام/مل/جزيرة/ساعة، مع مؤشر GSI 3.44. تشير النتائج إلى أن الجزر المعزولة تظهر استجابة إفراز أنسولين نموذجية وفعالة تحت التحفيز باستخدام محاليل جلوكوز بتركيزات مختلفة (الشكل 4B).

لاحظ أعضاء فريق البحث أن كمية وجودة الجزر المعزولة والخلايا العجينية مرتبطة ارتباطا وثيقا بزمن الهضم، الذي يتطلب تحكما صارما أثناء التشغيل وأقل تأثرا بمختلف المشغلين. وفي الوقت نفسه، ترتبط تقلبات الإنتاج وقابلية العيش ارتباطا وثيقا أيضا بالتشريح الكامل للبنكرياس والفصل الميكانيكي لأنسجة البنكرياس، وهو ما يتطلب الانتباه أثناء العملية.

الشكل 1: نتائج الطرد المركزي بتدرج كثافة محلول فيكول. تقع طبقة الجزر عند الواجهة بين طبقة السائل الشفافة عديمة اللون ووسط الزراعة. الترسيب في أسفل أنبوب الطرد المركزي هو PACs. الاختصار: PACs: خلايا البنكرياس الحارة البحرية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: الخصائص الشكلية والكمية للجزر الصغيرة وPACs. (أ) شكل الجزر المعزولة من نسيج البنكرياس في الفئران. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تحليل كمي لعدد الجزر المعزولة من نسيج البنكرياس الفأري (n = 3). (ج) شكل راكبات التحليل العاطفي المعزولة من أنسجة البنكرياس في الفئران. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (D) تحليل كمي لعدد PACs المعزولة من نسيج البنكرياس في الفئران (n = 3). تم التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± SD. الاختصار: PACs: خلايا البنكرياس الحزينية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تقييم قابلية الحياة للجزر الصغيرة وPACs. (أ) تلوين فلوري يوديد الكالسيين/البروبيديوم لتقييم جدوى الجزر الصغيرة والPACs. الأخضر: خلايا حية. الأحمر: خلايا ميتة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تحليل كمي لفعالية الجزر الصغيرة وPACs (n = 3). تم التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± SD. الاختصارات: PACs: خلايا البنكرياس الحصلية؛ PI = يوديد البروبيديوم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تقييم نشاط الأميلاز في PACs وقدرة إفراز الأنسولين في الجزر الصغيرة. (A) نشاط الأميليز لPACs تحت التحفيز بتركيزات مختلفة من السيرولين (Ctrl: مجموعة الضابطة؛ C10، C20، وC50: كانت تركيزات السيرولين 10 نانوم، 20 نانوم، و50 نانومول (n = 3). (ب) التحليل الكمي لتركيزات إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (n = 3). تم التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± SD. ***P < 0.001. الاختصارات: GSI = مؤشر الأنسولين المحفز بالجلوكوز؛ الخلايا الحساسة للعمل العاطفي: خلايا حارة البنكرياس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

في السنوات الأخيرة، حظي مرض السكري بعد التهاب البنكرياس (PPDM) باهتمام واسع ^1,9,10. يعد التحقيق في الآليات الجزيئية التي تؤثر بها PACs على إفراز هرمون الجزر في سياق AP ذا أهمية كبيرة.

يرتبط المرض المرضي لفيروس AP بشكل رئيسي بالتنشيط المفرط لإنزيمات البنكرياس في خلايا البنكرياس المفرطة، مما يؤدي إلى الهضم الذاتي لأنسجة البنكرياس^11,12. على الرغم من توفر خطوط خلايا مثل AR42J و266-6 (خطوط الخلايا الحارة النارية) وMIN6 وINS-1 (خطوط الخلايا β) حاليا، إلا أن هذه النماذج المختبرية لا يمكنها تكرار التعقيد الفسيولوجي لخلايا الأسينار الأولية والجزر ^4,5 بشكل كامل. لذلك، فإن عزل الخلايا والأجزرية الأولية الحمارية أمر بالغ الأهمية لدراسات معمقة حول التفاعل بين الأقسام الخارجية والغدد الصماء في البنكرياس. حاليا، طرق عزل الجزر الصغيرات معروفة جيدا؛ ومع ذلك، معظمها لا يلبي احتياجات البحث لدراسة التفاعل بين الجزر الصغيرة وخلايا البنكرياس الأسينية ^6,7,8.

هذا البروتوكول التجريبي يحسن إجراء تروية البنكرياس، مما يقلل الحاجز التقني، مما يمكن الباحثين الذين لا يملكون تدريبا متخصصا في تدشين القنوات الصفراوية من إجراء التجارب. وفي الوقت نفسه، يضمن كمية وجودة الجزر المعزولة وخلايا الأسينار، مما يوفر طريقة بسيطة وسريعة لعزل الجزر الأولية للفئران وخلايا البنكرياس الأولية في نفس الوقت.

على الرغم من أن هذه الطريقة تبسط عملية عزل الجزر، إلا أن الخطوات الرئيسية لا تزال تتطلب رقابة صارمة لضمان إنتاجية عالية وفصل فعال بين الجزر وخلايا البنكرياس الحارة الصغيرة. تشمل هذه الخطوات تفريغ البنكرياس الكافي، وتعطيل الأنسجة بشكل صحيح (ضمان التقطيع الشامل)، وهضم البنكرياس (التحكم الدقيق في وقت الهضم والهز اليدوي أثناء الهضم)، والتوصيل الميكانيكي (التحكم في عدد وشدة ضربات المابيب). قبل اختيار الجزر، يجب تثبيت الجزر المعلقة في حاضنة الخلية لمدة تقارب 10 دقائق لتسهيل اختيار الجزر بشكل أكثر كفاءة.

من المهم ملاحظة أنه أثناء تروية البنكرياس، تحقق نتائج أفضل عند حقن الحويصلات السائلة الشفافة؛ يجب أن يكون نسيج البنكرياس بالكامل مثقلا بالكامل، لكن يجب التحكم في وقت التروية خلال دقيقة إلى دقيقتين. إذا تم اكتشاف انخفاض قدرة الخلايا، قم بضبط وقت التلامس بين نسيج البنكرياس والكولاجناز P (بما في ذلك وقت التروية ووقت هضم حمام الماء). بالإضافة إلى ذلك، انتبه للتلف الميكانيكي أثناء العزل - على سبيل المثال، تجنب القوة الزائدة عند تشتت أنسجة البنكرياس. يجب الحفاظ على تقنية المعقم طوال فترة عزل الجزر الصغيرة والخلايا الحارة لمنع التلوث. يجب ترشيح الكواشف المحضرة عبر مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر. يجب إجراء عملية العزل في خزانة السلامة البيولوجية، ويجب أن تكون جميع الأدوات والمواد الاستهلاكية المستخدمة أثناء العزل معقمة. كما يحتوي الوسطان الكاملان المحضران على محلول بنسلين-ستربتوميسين بنسبة 1٪.

لتخدير الفأر: ثبت جلد عنق الفأر بالإبهام الأيسر والسبابة، وادعم بطنه بالأصابع الخوامضة والصغيرة (مع الحفاظ على وضعية الرأس للأسفل، البطن للأعلى لكشف تجويف البطن). امسك الحقنة باليد اليمنى، وأدخلها بزاوية 30° في جلد أسفل بطن الفأر الأيسر (1 سم من الفخذ و0.5 سم من خط الوسط)، وحقن المخدر ببطء، واضغط على موقع الحقن بمسحة قطنية معقمة لمدة 10 ثوان بعد سحب الإبر لمنع تسرب الدواء. القتل الرحيم للفأر فقط عن طريق خلع عنق الرحم بعد أن يكون مخدرا بالكامل.

إذا وخزت بإبرة ملوثة (تعرضت لدم أو أنسجة فأر) أو عضها فأر، اضغط فورا على المنطقة حول الجرح عند أقرب حوض (اضغط من الطرف القريب إلى الطرف البعيد لطرد كمية صغيرة من الدم)، ثم اشطف الجرح باستمرار بالماء الجاري لمدة 15 دقيقة، ثم عقم الجرح بنسبة 75٪ إيثانول أو 0.5٪ بوفيدون-يودين.

أظهرت نتائج اختبارات نشاط الأميلاز لخلايا الأسينار أن خلايا الأسينار المعزولة في البنكرياس كانت ذات مستوى منخفض من التنشيط القاعدي وكانت حساسة لتحفيز السيرولين: حيث زاد نشاط الأميلاز تدريجيا مع ارتفاع تركيز السيرولين، ووصل إلى أعلى مستوى عند 20 نانومتر من السيرولين، وانخفض قليلا عندما كان تركيز السيرولين 50 نانومتر. أظهرت نتائج اختبار إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز أن الجزر المعزولة أظهرت استجابة إفراز أنسولين نموذجية وفعالة تحت التحفيز باستخدام محاليل جلوكوز بتركيزات مختلفة. تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا الأسينارية والجزر الصغيرة المستخرجة من هذا البروتوكول مناسبة للتجارب المختبرية اللاحقة.

إجراء عزل الجزر والخلية الحارة في هذا البروتوكول التجريبي سهل التنفيذ. تظهر النتائج التجريبية أن الجزر الصغيرة والخلايا الأسينارية المعزولة عبر هذا البروتوكول تظهر كمية ممتازة وقابلية للبقاء الممتازة. بالإضافة إلى ذلك، قام العديد من أعضاء فريقنا بالتحقق من صحة هذا البروتوكول باستخدام عدة فئران؛ تشير نتائج التحقق إلى أنه يتمتع بقابلية إعادة إنتاج جيدة، وبيانات موثوقة، وتقلبات طفيفة في إنتاج الخلية. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول له بعض القيود. على الرغم من اعتماده المنخفض على المهارات التقنية للمشغل الكهربائي، إلا أنه لا يزال يتطلب معرفة أساسية بتشريح الفأر لتشريح بنكرياس الفأر بالكامل - وهذا شرط أساسي لعملية العزل بأكملها. إذا تم عزل أنسجة البنكرياس من عدة فئران في نفس الوقت، يجب تعديل كمية محلول الكولاجناز P وغيره من المواد الكيميائية وفقا لذلك. بالإضافة إلى ذلك، لا ينصح بالعزل المتزامن لأكثر من فأرين: الفرق الزمني بين معالجة أنسجة البنكرياس لفئران مختلفة أثناء التشريح، والتروية، والتقطيع يؤثر على وقت التلامس بين نسيج البنكرياس والكولاجناز، مما يؤثر على كفاءة وفعالية عزل الخلايا. لذا، قد يكون تطبيقه على نطاق واسع محدودا. علاوة على ذلك، لم يتم التحقق من صحة هذا البروتوكول في الفئران. إذا تم عزل الجزر والخلايا الأسينارية من الفئران، فقد تحتاج جرعة بعض المواد ووقت الهضم إلى تعديل إضافي.

في الختام، يوفر هذا البروتوكول التجريبي طريقة بسيطة وسريعة لعزل جزر الفئران الأولية وخلايا البنكرياس الأسينارية الأولية في نفس الوقت. من الأنسب للباحثين غير المتمرسين عزل الخلايا الصغيرة والخلايا الحارة الصماء، مع توفير إطار تجريبي عملي للدراسات المخبرية حول تفاعلات البنكرياس الخارجية والغدد الصماء.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μ مرشح m	ميلكس	SLGPR33RB	تصفية محلول الكولاجناز P المحضر
كلوريد الكالسيوم 0.25 ميل (معقم)	بيوتايم	ST365	مسار الإشارات المعتمد على الكالسيوم لتنشيط إفراز الأنسولين
حقنة بحجم 1 مل	جيروي	10084692516405	يستخدم لتروية الكولاجناز، P، إلى أنسجة البنكرياس.
محلول تريبروموإيثانول بنسبة 1.25٪	شركة بكين يوسيدا للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	JT0781	التخدير
أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل	إبندورف	30121589	اجمع المادة الفائقة للخلية للطرد المركزي والتخزين.
1x هانك' محلول الملح المتوازن S	بايوشارب	BL561A	جهز محلول الكولاجناز P وشطف نسيج البنكرياس
لوحة زراعة الخلايا ذات 12 بئر	سارستيدت	83.3921	امسك نسيج البنكرياس والأسينار المستخرج من الزراعة
أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل	شركة بكين لابجيك للتكنولوجيا، المحدودة.	CT-002-15A	الاحتفاظ بالحلول أثناء التجربة
لوحة زراعة الخلايا ذات 24 بئر	سارستيدت	83.3922	الزراعة في الجزر المستخرجة
40-mesh  منخل	ويدان إنسترومنتس	لا يوجد	ترشيح أنسجة البنكرياس
ماصة باستور بسعة 5 مل	بايوشارب	BS-XG-03L	تفريغ السوائل وتعطيل أنسجة البنكرياس جسديا
أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل	شركة بكين لابجيك للتكنولوجيا، المحدودة.	CT-002-50A	الاحتفاظ بالمحاليل أثناء التجربة، واحتواء الأنسجة، والطرد المركزي
أطباق زراعة الخلايا بحجم 60 مم	شركة بكين لابجيك للتكنولوجيا، المحدودة.	12211	حاوية لحمل وسط الزراعة يحتوي على جزر صغيرة لتسهيل القطف
محلول الإيثانول بنسبة 75٪	هينوت	لا يوجد	انقع الفئران للتعقيم.
أدوبي فوتوشوب 2023	شركة أدوبي	لا يوجد	قم بتوليد صور.
جهاز الطرد المركزي بيكمان أليغرا X-12/X-12R	بيكمان	أليغرا X-12/X-12R	الطرد المركزي
مصل البقر الألبومين (BSA)-V	سولاربيولوجيا	A8020	حافظ على الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية للجزر الصغيرة واستخدم (هذا/هذا) لتحضير محاليل الجلوكوز بتركيزات مختلفة.
فئران C57BL/6J، درجة SPF، 6– عمره 8 أسابيع، ووزني 18 وأقل من أسبوع؛ 25 جرام	مركز المختبرية في جامعة الطب البحري
مجموعة اختبار فعالية خلايا كالسيين/PI وسمية الخلايا	بيوتايم	C2015L	اكتشاف بقاء الخلايا وسمية الخلايا في الخلايا الحيوانية بناء على التلوين الفلوري المزدوج كالسيين-AM (كالسين AM) ويوديد البروبيديوم (PI) في الخلايا الحية والميتة في نفس الوقت.
كلوريد الكالسيوم (اللاماء)	سانغون بيوتيك	10043-52-4	تحضير محلول الكولاجنازات P
مصفاة الخلايا (100 وأكثر؛ m)	بايوشارب	BS-100-XBS	ترشيح الخلايا الأسينارية
كولاجناز P	سيغما	11213857001	هضم أنسجة البنكرياس
محلول D-(+)-جلوكوز (20٪، معقم)	بيوتايم	ST491	تحفيز إفراز الأنسولين من الجزر الصغيرة.
DMEM الأساسي (1x) (دولبيكو' S معدل إيجل ميديوم)	جيبكو	C11995500BT	زراعة الخلايا الأسينارية
مصل البقر الجنيني (FBS)	بيوويست	S140B-500	تحضير وسيط الزراعة
حل Ficoll-Paque PREMIUM المعقم	سيتيفا	17544203	وسط تدرج الكثافة لطبقات تدرج الكثافة
منشور GraphPad 8.0.1	جراف باد سوفتوير ذ.م.م	لا يوجد	توليد الصور وإجراء التحليل الإحصائي.
محلول HEPES (1 M)	بايوشارب	BL1061A	تحضير محلول الكولاجنازات P
الطرد المركزي عالي السرعة/المبرد	سيغما	3K15	الطرد المركزي
ImageJ	مختبر المعاهد الوطنية للصحة للأجهزة البصرية والحوسبة (LOCI)	لا يوجد	تحليل صور التألق الخلوي وحساب مدى بقاء الخلية.
المجهر البيولوجي المقلوب	لايكا	لا يوجد	راقب شكل الخلية واختر الجزر الصغيرة.
مجهر الفلورة المقلوب	أوليمبوس	IX73	راقب إشارات الفلورسنت الخلوية والتقط صورا فلورية.
مخزن بيكربونات كريبس-رينجر HEPES	ليجين	CZ0103	حافظ على الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية للجزر الصغيرة واستخدم (هذا/هذا) لتحضير محاليل الجلوكوز بتركيزات مختلفة.
مجموعة ELISA لجهاز INS (الأنسولين) للفأر	شركة ووهان فاين للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	EM0260	اكتشف مستوى إفراز الأنسولين في الجزر الصغيرة.
ملقط العيون (10 سم، منحني بخطاف)	أجهزة تشينغي الطبية	لا يوجد	المساعدة في التشريح
ملقط العين (10 سم، مستقيم مع السن)	أجهزة تشينغي الطبية	لا يوجد	المساعدة في تشريح وفصل أنسجة البنكرياس المفاجئ واستخلاص أنسجة البنكرياس
محلول البنسلين الستربتوميسين	جيبكو	15140-122	جهز وسط الزراعة لمنع التلوث
RPMI-1640 متوسط،	كي جين بيوتك	KGL1501-500	إنهاء محلول الهضم كولاجناز P وزراعة الجزر الصغيرة
مثبط التربسين من غلايسين ماكس (فول الصويا)	سيغما	T6522	تحضير محلول الكولاجنازات P
مقص جراحي (10 سم، مدبب مستقيم)	أجهزة تشينغي الطبية	لا يوجد	المساعدة في التشريح وقطع أنسجة البنكرياس إلى قطع صغيرة
حمام الماء	OAICLAB	OW-HF	حافظ على درجة حرارة الهضم.
مجموعة اختبار نشاط α-amylase و Β-Amylase	علم اللاب	E-BC-K006-M	اكتشاف مستويات الأميلاز التي تفرزها خلايا الأسينار تحت ظروف مختلفة