مقالة منهجية

الكشف عن التغيرات القابلة للاستهداف في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة باستخدام تسلسل الجيل التالي

DOI:

10.3791/69091

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول سير عمل تسلسل الجيل التالي الآلي والمعتمد من ISO15189 للكشف عن التغيرات الجينومية القابلة للاستهداف في الأنسجة المضمنة بالبارافين الثابت بالفورمالين لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتوقف نجاح العلاج الموجه في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) على التحديد الدقيق لتغيرات السائق ، بما في ذلك الطفرات ودمج الجينات والتضخيم. ظهر تسلسل الجيل التالي (NGS) كأداة تشخيص جزيئية شاملة ، قادرة على اكتشاف الانحرافات الجينومية المعروفة والجديدة ، مما يوفر دعما مهما لعلاج NSCLC الشخصي. ومع ذلك ، لا تزال NGS طريقة معقدة وصعبة من الناحية الفنية. على الرغم من اعتمادها على نطاق واسع ، لا تزال NGS تواجه بعض التحديات ، بما في ذلك التعقيد التقني وأوقات التسليم الطويلة. هنا ، يتم تقديم سير عمل NGS المعتمد من ISO15189 والذي تم تنفيذه في المختبر السريري. شمل البروتوكول الموحد تقييم خلوية الورم (≥20٪) ، واستخراج الحمض النووي من أنسجة البارافين الثابتة للفورمالين (FFPE) (إدخال الحمض النووي ≥ 50 نانوغرام) ، وإعداد المكتبة الآلي ، وتحليل المعلوماتية الحيوية. من خلال دمج تدابير مراقبة الجودة الصارمة (QC) في كل خطوة ، يضمن سير العمل موثوقية عالية للبيانات. إلى جانب ذلك ، كان الابتكار الرئيسي في سير العمل هو أتمتة بناء مكتبة NGS. تضمن النظام الآلي لبناء مكتبة NGS الإصلاح النهائي ، والمخلفات A ، وربط المحول ، والتقاط التهجين ، والتنقية ، وتقليل الخطأ البشري بشكل فعال ، وتعزيز قابلية التكاثر التجريبي ، وتقليل الوقت العملي ، وبالتالي تحسين الكفاءة. توضح التجربة معا أن مراقبة الجودة الصارمة والإعداد الآلي للمكتبة ضروريان للحفاظ على الدقة وقابلية التوسع في اختبار NGS السريري. لا يضمن هذا النهج المحسن الامتثال لمعايير ISO15189 فحسب ، بل يدعم أيضا الطلب المتزايد على علم الأورام الدقيق في إدارة NSCLC.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) 75٪ -85٪ من جميع حالات سرطان الرئة ، وهو ما يمثل أولوية سريرية وتحديا علاجيا1،2،3. في السنوات الأخيرة ، مع التطوير الناجح والتطبيق السريري للأدوية المستهدفة جزيئيا مثل مثبطات التيروزين كيناز المستقبلات لعامل نمو البشرة (EGFR-TKIs) ، دخل علاج NSCLC المتقدم عصر العلاجات الدقيقة الشخصية4،5،6. يوفر العلاج الموجه فعالية دقيقة وخصوصية عالية وآثار جانبية ضئيلة7،8. أدى هذا التحول في العلاج إلى زيادة الطلب على تقنيات التشخيص الجزيئي في نفس الوقت.

في الوقت الحالي ، أصبح الاختبار الشامل الذي يستهدف الورم مكونا لا غنى عنه في الممارسة السريرية التي يمكن أن تساعد في توضيح ملامح الطفرات الجينية الدقيقة ، وبالتالي توفر أساسا موثوقا به لاستخدام الأدوية المستهدفة اللاحقة ، ومراقبة مقاومة الأدوية ، وتقييم التشخيص للمرضى. على وجه الخصوص ، تمت التوصية بالفعل بالاختبار متعدد الجينات المستند إلى NGS ، والذي يستفيد من المزايا التقنية عالية الإنتاجية والحساسية العالية ، للتطبيق السريري9،10،11،12.

بالمقارنة مع تقنيات التشخيص الجزيئي التقليدية ، توضح NGS مزايا رائدة. تكمن الميزة الأولى ل NGS في قدرتها عالية الإنتاجية. إنه يتيح الكشف المتزامن عن جينات متعددة ، بما في ذلك التغيرات الجينية المعروفة وغير المعروفة13،14. وفي الوقت نفسه ، تحقق NGS اختبارا شاملا في جولة واحدة ، مما يقلل نسبيا من التكلفة ، واستهلاك العينة ، واختبار وقت الاستجابة15،16. بالنظر إلى هذه المزايا ، تم تطبيق NGS بشكل متزايد في الممارسة السريرية. ومع ذلك ، فإن عمليات NGS معقدة ، بما في ذلك تقييم خلوية الورم ، واستخراج الحمض النووي ، والتحضير الآلي للمكتبة ، وتحليل المعلوماتية الحيوية. تؤثر جودة المعالجة الأولية للعينات بشكل مباشر على أداء تحليلات المعلوماتية الحيوية اللاحقة17. على وجه الخصوص ، يتضمن إعداد المكتبة سلسلة من الخطوات لتحويل عينات الحمض النووي الخام إلى مكتبات موحدة متوافقة مع أدوات التسلسل. يتضمن إعداد المكتبة التجزئة ، والإصلاح النهائي ، وربط المحول ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل18. غالبا ما تقدم هذه العملية المعقدة تحيزات تقنية مختلفة: على سبيل المثال ، قد يؤدي التجزئة إلى نقص تمثيل مناطق الكروماتين غير المتجانس. يمكن أن يؤدي تفضيل الركيزة ل Ligase أثناء ربط المحول إلى فقدان تسلسلات معينة ؛ ويميل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى التسبب في تغطية غير متساوية في المناطق ذات المحتوى الشديد من GC19. لا تقلل هذه التحيزات النظامية من جودة بيانات التسلسل فحسب ، بل قد تؤدي أيضا إلى استنتاجات خاطئة في تحليلات المعلوماتية الحيوية اللاحقة. لذلك ، يعد إنشاء نظام صارم لمراقبة الجودة أمرا ضروريا لضمان موثوقية واتساق النتائج التجريبية.

لمواجهة هذه التحديات التقنية طويلة الأمد ، اعتمد المختبر نظام NGS مؤتمت بالكامل. تم تصميم النظام لتقليل وقت المعالجة اليدوية وتقليل فترات التسليم الإجمالية. إنه يشتمل على بروتوكولات قابلة للبرمجة لضمان المرونة التشغيلية ودقة المعالجة مع استخدام الوحدات والوحدات المتكاملة لتقليل التحيزات الفنية المحتملة بشكل فعال في كل خطوة. علاوة على ذلك ، لا يحسن هذا الحل الآلي قابلية التكاثر وإنتاجية إعداد المكتبة فحسب ، بل الأهم من ذلك ، يضمن أن بيانات التسلسل تعكس بشكل أكثر دقة التركيب الجزيئي للعينات الأصلية. هنا ، يرغب المختبر في تقديم النظام من خلال الكشف عن تعديلات السائق باستخدام NGS المستند إلى الحمض النووي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصل البروتوكول على تنازل IRB لعينات أرشيفية مجهولة المصدر.

1. خطوات الاختبار المسبق ومراقبة الجودة

  1. تسجيل معلومات العينة في نظام إدارة معلومات المختبر (الجدول 1). املأ نموذج الموافقة المستنيرة لاختبار الطفرات الجينية.
  2. تلقي عينة NSCLC FFPE. تأكد من أن العينة المستخدمة للاختبار هي عينة من أنسجة البارافين التي تم تخزينها لمدة لا تزيد عن عامين. تأكد من معالجة العينات وتخزينها وفقا للطرق المرضية القياسية.
    ملاحظة: تركز هذه الدراسة بشكل أساسي على سير العمل المنهجي ، بدلا من إجراء تحليل سريري واسع النطاق. لذلك ، لم يتم تعيين متطلبات محددة لرقم العينة لهذه المرحلة من البحث.
  3. قطع الأقسام باستخدام شفرات ميكروتوم يمكن التخلص منها. قم بتغيير الشفرات والملقط والأنابيب الدقيقة سعة 1.5 مل بين العينات لمنع التلوث المتبادل وتجنب إدخال الملوثات المشتقة من المشغل (مثل الشعر وخلايا الجلد واللعاب).
    ملاحظة: حجم العينة الكبير (≥ 0.5 سم × 0.5 سم) 6-10 ميكرولتر ، خمس أوراق ؛ حجم العينة الصغيرة (< 0.5 سم × 0.5 سم) وعينات ثقب ، 6-10 ميكرولتر ، 10 أوراق.
  4. قم بإجراء تلطيخ روتيني للهيماتوكسيلين يوزين (HE) لتقييم محتوى الخلايا السرطانية.
  5. حدد العينات التي تحتوي على ≥20٪ من الخلايا السرطانية الخبيثة لتحليلها النهائي. يتم تقييم محتوى الورم من قبل علماء الأمراض على شرائح الزجاج الملون HE20.
    ملاحظة: إذا كان محتوى الورم أقل من 20٪ ، بتوجيه من مناطق الورم المحددة على شريحة HE ، فقم بكشط منطقة أنسجة الورم المقابلة. تحقق هذه العملية إثراء أنسجة الورم عن طريق إزالة المكونات غير الورمية المحيطة بشكل فعال ، وبالتالي زيادة كبيرة في نسبة الخلايا السرطانية في المواد التي تم جمعها.
  6. قم بإجراء استخراج الحمض النووي باستخدام نظام تنقية آلي كما هو موضح أدناه.
    1. قسم كتلة FFPE باستخدام ميكروتوم للحصول على شريط. ضع الشريط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. انقل الشريط إلى موقع إدخال العينة المعين على أداة الاستخراج الآلي.
    2. استخدم أداة استخراج تلقائية مع مجموعة شفط تلقائية واستبدل سحب العينات اليدوي بنظام استخراج الحمض النووي الأوتوماتيكي من الخرزات المغناطيسية.
      ملاحظة: تساعد أتمتة هذه الخطوة على ضمان الاستخراج التلقائي لضمان إنتاج الحمض النووي عالي الدقة والقابل للتكرار لتطبيقات NGS النهائية.
    3. ارجع إلى تعليمات جهاز تنقية الحمض النووي الأوتوماتيكي بالكامل وكاشف استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي.
    4. بعد ذلك ، حدد برنامج C1102 ، واختر وقت حضانة إزالة الشمع من العينة 16 ساعة ، وحجم الشطف 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: إذا لم يتم اختبار محلول الحمض النووي المستخرج على الفور ، فيجب تخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 6 أشهر.
  7. تقييم جودة الحمض النووي (الجدول 2) كما هو موضح أدناه.
    1. استخدم الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لتحديد حجم جزء الحمض النووي. استخدم Agilent2100 وأنظمة تحليل الرحلان الكهربائي الشعري الدقيقة الأخرى للعينات منخفضة المدخلات.
    2. قم بإذابة 1 جرام من الاغاروز في 100 مل من محلول TAE. سخني الخليط في حمام مائي حتى يصبح شفافا. قم بتبريد المحلول إلى حوالي 60 درجة مئوية.
    3. قم بتوصيله بالقطب الموجب (أحمر) على جهاز الرحلان الكهربائي. قم بأداء القطب السالب (الأسود) إلى الجهد 180 فولت ، وقم بالتشغيل لمدة 15 دقيقة21,22.
    4. وفقا لنتائج الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، قم بتصنيف أحجام الأجزاء إلى أربعة مستويات (A-D ؛ الجدول 3) ، وحدد الحمض النووي من المستويات A-C للعمليات اللاحقة.
    5. استخدم قياس الطيف الضوئي للتحقق من النقاء. تأكد من OD260 / OD280 > 1.8 ؛ OD260 / OD230 > 2.0 للإشارة إلى مستويات الملوثات المقبولة23،24.
    6. استخدم مجموعة أدوات الكشف (جدول المواد) بناء على أصباغ الفلورسنت الخاصة بالتسلسل للمقايسة الفلورومترية لقياس تركيز الحمض النووي بدقة.
    7. أضف 1 ميكرولتر من الحمض النووي ليتم اختباره إلى 199 ميكرولتر من محلول العمل ، ثم امزج ، وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة ، وقم بقياس تركيزه باستخدام مقياس الفلور (جدول المواد).

2. إعداد المكتبة ومراقبة الجودة (الشكل 1)

  1. تحضير جزء من الحمض النووي الجيني باستخدام الموجات فوق الصوتية (جدول المواد) كما هو موضح أدناه.
    1. امزج 200 نانوغرام من الحمض النووي الجيني في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المنخفض Tris-EDTA (TE). بعد ذلك ، احتفظ بأنبوب العينة في رف عينة مبرد مسبقا (8 درجات مئوية).
    2. قم بتعيين معلمة الأداة وفقا للجدول 4. ثم ابدأ التجزئة.
    3. استخدم الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للتحقق من تأثير التجزئة. تولد هذه الخطوة شظايا الحمض النووي ذات الأطراف التالفة التي تتطلب إصلاحا نهائيا لتحويلها إلى نهايات حادة للخطوات اللاحقة.
  2. قم بإجراء الإصلاح النهائي وإضافة A عند 3 بوصات كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإصلاح الأطراف التالفة من الحمض النووي FFPE بالإنزيمات لتشكيل نهايات مسطحة ، مما يضمن 3'-OH و 5'-P. أضف A إلى الأطراف المسطحة ذات الشريطة المزدوجة 3 بوصات.
    2. قم بإعداد مزيج ERA عن طريق إضافة 7 ميكرولتر من مخزن الإصلاح النهائي و 3 ميكرولتر من إنزيم الإصلاح النهائي ، والتحريك برفق يدويا 3x-5x ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 1-3 ثوان.
    3. أضف مزيج ERA إلى 50 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المكسورة ، واخلطها برفق ، وجهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان.
    4. ضعه في جهاز PCR وحدد برنامج ERA (20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ؛ 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ؛ 4 درجات مئوية ، غطاء 85 درجة مئوية). قم بإجراء العملية التالية في غضون 2 ساعة.
  3. قم بإجراء ربط المحول كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإعداد مزيج LIG لنظام التفاعل بإضافة 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط ، و 10 ميكرولتر من DNA ligase ، و 10 ميكرولتر من محول DNA. بعد ذلك ، قم بنقر 3x-5x يدويا برفق وجهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان.
    2. أضف 50 ميكرولتر من مزيج LIG إلى منتج 60 ميكرولتر من الخطوة السابقة ، واخلطه برفق ، ثم جهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان.
    3. ضع الخليط في أداة PCR ، ثم حدد برنامج LIG (20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة دون تسخين الغطاء ؛ 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (غطاء التسخين) ؛ 4 درجة مئوية ، غطاء 85 درجة مئوية).
  4. إجراء تنقية الخرزة المغناطيسية.
    1. خذ 1.5 مل من أنبوب الطرد المركزي منخفض الامتزاز وأضف 88 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المتجانسة و 110 ميكرولتر من المنتج المرتبط بالمحول. دوامة واخلطيها جيدا ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. قم على الفور بالطرد المركزي للعينة المحتضنة لمدة 1-3 ثوان وضع أنبوب الطرد المركزي على رف مغناطيسي. انتظر حتى يمسح المحلول (حوالي 3-5 دقائق).
    3. مع تثبيت الأنبوب على المغناطيس ، افتح الغطاء واسحب المادة الطافية التي تم تطهيرها بعناية باستخدام ماصة دون إزعاج حبيبات الخرزة.
    4. احتفظ بالأنبوب على المغناطيس وأضف 300 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 75٪ إلى كل أنبوب.
    5. انتظر لمدة 1 دقيقة للسماح للخرز المغناطيسي بالاستقرار الكامل. قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي ببطء أفقيا مرة واحدة لامتصاص الإيثانول.
    6. كرر الخطوتين 2.4.4 و2.4.5 مرة واحدة، ليصبح المجموع 2x.
    7. قم بإجراء الطرد المركزي الفوري لمدة 1-3 ثوان ، وأعد الأنبوب إلى الرف المغناطيسي وانتظر لمدة 30 ثانية. استخدم ماصة لإزالة أي إيثانول متبقي وحافظ على غطاء الأنبوب مفتوحا.
    8. جفف الخرز المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين حتى يظهر سطح الخرزة غير لامع ولا يظهر أي تشققات.
    9. قم بمسح منتج الربط ب 28 ميكرولتر من مخزن الشطف (EB).
      ملاحظة: يجب أن تكون الخرزات المغناطيسية متوازنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  5. تضخيم وتنقية المكتبة المسبقة كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإعداد الخلط المسبق لنظام التفاعل عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت PCR ، و 10 ميكرولتر من بادئات PCR ، و 1.5 ميكرولتر من مزيج dNTP ، و 1 ميكرولتر من إنزيم PCR. انقر يدويا برفق على 3x-5x وجهاز الطرد المركزي لمدة 1-3 ثوان.
    2. أضف 22.5 ميكرولتر من الخلط المسبق إلى 27.5 ميكرولتر من المنتج المنقى من الخطوة السابقة ، واخلطه برفق ، ثم جهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان.
    3. حدد البرنامج PRE: 98 درجة مئوية 45 ثانية ؛ (98 درجة مئوية 15 ثانية ، 60 درجة مئوية 30 ثانية ، 72 درجة مئوية 30 ثانية) 12 دورة ؛ 72 درجة مئوية 2 دقيقة ؛ 4 درجة مئوية عقد غطاء 105 درجة مئوية.
    4. بعد اكتمال برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء تنقية الخرزة المغناطيسية باستخدام الإيثانول المحضر حديثا بنسبة 75٪. قم بإزالة المنتج ب 18 ميكرولتر من EB.
  6. التقاط الهجين كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإعداد نظام التفاعل A بإضافة 15 ميكرولتر من المكتبة المسبقة و 4 ميكرولتر من مزيج الحاصرات.
    2. ضعه على PCR وقم بتشغيل برنامج PCR HYB (95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ 65 درجة مئوية ، غطاء 105 درجة مئوية).
    3. قم بإعداد مزيج نظام التفاعل B HYB بإضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين ، و 0.5 ميكرولتر من مانع مثبطات RNase ، و 1 ميكرولتر من المسبار. قم بنقر برفق 3x-5x وجهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان.
      ملاحظة: اسم المسبار هو LCOO1 ، وتشمل جينات المسبار EGFR و KRAS و BRAF و ALK وما إلى ذلك.
    4. عندما تنخفض درجة حرارة أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى 65 درجة مئوية ، أضف 11.5 ميكرولتر من مزيج HYB إلى نظام التفاعل A ، واخلطه برفق ، ثم قم بتغطية غطاء أداة PCR واستمر في الحضانة لمدة 16-24 ساعة.
    5. احتضان مخزن الغسيل 2 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع سخان معدني عند 65 درجة مئوية بجرعة 600 ميكرولتر لكل عينة.
    6. استرجع حبات SCB المغناطيسية ، واقلب واخلط 5x ، دوامة لمدة 10 ثوان ، واوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. دوامة لمدة 10 ثوان ، انقل 25 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي منخفض الامتزاز 1.5 مل ، ضعه على رف مغناطيسي لمدة 3 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
    7. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الخرز إلى 25 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي SCB ، دوامة واخلطها لمدة 3 ثوان ، وقم بالطرد المركزي للحظات لمدة 1-3 ثوان ، واتركه على الرف المغناطيسي لمدة 3 دقائق ، وتخلص من الطافية.
    8. كرر الخطوة 2.6.7 2x ، ليصبح المجموع ثلاث مرات.
    9. أضف 200 ميكرولتر من عازلة غسيل الخرز إلى الخرز المغناطيسي ، دوامة واخلطها لمدة 3 ثوان ، وأعد تعليقها لاستخدامها لاحقا.
    10. انقل ما يقرب من 30 ميكرولتر من العينة الهجينة إلى حبات SCB المغناطيسية المعلقة ، والدوامة والمزج ، ووضعها على خلاط دوار ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، وجهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان.
    11. ضع أنبوب الخليط على رف مغناطيسي لمدة 3 دقائق ، ثم استنشق ما يقرب من 230 ميكرولتر من المادة الطافية. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1 ، دوامة لمدة 5 ثوان ، ضعه في خلاط دوار ، ثم احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي فوري لمدة 1-3 ثوان.
    12. ضع أنبوب خليط عينة الخرزة المغناطيسية على رف مغناطيسي واتركه لمدة 3 دقائق. ثم ، استنشق ما يقرب من 500 ميكرولتر من المادة الطافية والسائل المتبقي.
    13. سخني 150 ميكرولتر من مخزن الغسيل من 2 إلى 65 درجة مئوية ، دوامة لمدة 10 ثوان ، ضعيها على خلاط بدرجة حرارة ثابتة ، ورجيها ، واحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بسرعة 600 دورة في الدقيقة. قم بإجراء الطرد المركزي الفوري لمدة 1-3 ثوان ، وضعه على رف مغناطيسي لمدة 3 دقائق ، واستنشق ما يقرب من 150 ميكرولتر من المادة الطافية والسائل المتبقي.
    14. كرر الخطوة 2.6.13 3x ، ليصبح المجموع أربع مرات.
    15. جهاز طرد مركزي فوري لمدة 1-3 ثوان لإزالة أي سائل متبقي من أنبوب العينة. أضف 20 ميكرولتر من EB ، واخلط لأعلى ولأسفل 8x-10x ، واخلطهم جيدا ، وضعيه على الثلج لاستخدامه لاحقا.
  7. إعداد وتنقية المكتبة النهائية.
    1. قم بإعداد مزيج POST لنظام التفاعل بإضافة 25 ميكرولتر من مزيج التضخيم ، و 5 ميكرولتر من الفهرس ، و 20 ميكرولتر من مكتبة الخرزات المغناطيسية. اضغط برفق على 3x-5x وجهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان. امزج برفق ، جهاز طرد مركزي لمدة 1-3 ثوان.
    2. اختر برنامج POST: 98 °C 45 ثانية; (98 درجة مئوية 15 ثانية ، 60 درجة مئوية 30 ثانية ، 72 درجة مئوية 30 ثانية) 12 دورة ؛ 72 درجة مئوية 10 دقائق ؛ 4 درجة مئوية عقد غطاء 105 درجة مئوية.
    3. بعد اكتمال برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء تنقية الخرزة المغناطيسية باستخدام الإيثانول المحضر حديثا بنسبة 75٪. قم بإزالة المكتبة النهائية ب 20 ميكرولتر من EB.

3. إعداد المكتبة المؤتمتة بالكامل (الجدول 5)

  1. اضغط على زر الطاقة لتنشيط النظام وانتظر التهيئة. انتقل إلى إعداد البرنامج وحدد تشغيل البروتوكول، ثم حدد البروتوكول: حرق الصخور HS.
  2. قم بتعيين معلمات مراقبة الجودة aliquot كنوع العينة: الحمض النووي عالي الجودة ؛ كمية المدخلات (نانوغرام): 50 ؛ دورات ما قبل PCR: 12 ؛ دورات ما بعد PCR: 12. انقر فوق تشغيل.
  3. أدخل خرطوشة الكاشف المعبأة مسبقا في الفتحة المخصصة (تتحقق تلقائيا من صحة وضع الكاشف وحالته).
  4. بعد تحميل العينات ، اضغط على ابدأ لجعل النظام يعمل بشكل مستقل. راقب مؤشرات LED لمراقبة التقدم.
  5. بعد انتهاء البرنامج ، انقر فوق موافق وسيقوم البرنامج تلقائيا بنقل المكتبة النهائية إلى أنبوب المكتبة ، وإنهاء إعداد المكتبة.

4. التسلسل ومراقبة الجودة

  1. إجراء القياس الكمي للمكتبة ومراقبة الجودة كما هو موضح أدناه.
    1. قياس تركيز ما قبل المكتبة والتركيز الكلي للمكتبة باستخدام القياس الفلوري.
    2. كشف حجم جزء المكتبة. استخدم مجموعة لتقييم حجم جزء المكتبة ووجود المحولات (جدول المواد).
      ملاحظة: إذا كانت المكتبة النهائية تحتوي على ثنائيات أولية، فيجب إضافة خطوة تنقية إضافية قبل خلط العينات على الماكينة. المعيار المؤهل لإدخال الشظايا هو ≥ 150 نقطة أساس ، وكفاءة الالتقاط المتوقعة ≥ 40٪.
    3. قم بتخفيف مكتبة التسلسل إلى 1.6 pM و 1300 ميكرولتر لعمليات التسلسل.
  2. قم بإجراء مراقبة بيئة التسلسل كما هو موضح أدناه.
    1. تحكم في بيئة التسلسل ، بما في ذلك درجة الحرارة الداخلية (19-25 درجة مئوية) ، والرطوبة الداخلية (20٪ -80٪).
    2. استكمال بيانات إخراج الجهاز QC ، بما في ذلك القاعدة فوق Q30 ، ومرشح تمرير كثافة الكتلة (PF).

5. تسلسل تحليل البيانات ومراقبة الجودة

  1. قم بإجراء معالجة البيانات الأولية والتنميط الجزيئي كما هو موضح أدناه.
    1. استخدم Burrows-Wheeler Aligner (الإصدار 0.7.10) لمحاذاة بيانات التسلسل مع hg19.
    2. قم بإجراء المحاذاة المحلية والتحسين ووضع علامات الازدواجية واستدعاء المتغير باستخدام مجموعة أدوات تحليل الجينوم (الإصدار 3.2) و Vardict (الإصدار 1.5.1).
    3. قم بتصفية المتغيرات باستخدام خط أنابيب fpfilter VarScan (الإصدار 2.4.3) وإزالة المواقع ذات الأعماق الأقل من 50. تصنيف واستبعاد المتغيرات ذات التردد السكاني الذي يزيد عن 0.1٪ في قواعد بيانات ExAC أو 1000 Genomes أو dbSNP أو ESP6500SI-V2 على أنها تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs).
    4. قم بإضافة تعليق توضيحي إلى المتغيرات المتبقية باستخدام SnpEff (الإصدار 3.6).
    5. تحليل المتغيرات الهيكلية (SVs) ، بما في ذلك إعادة الترتيب الجينومية الكبيرة (LGRs) ، باستخدام MarkSV (أداة خوارزمية Burning Rock). تحليل متغيرات رقم النسخ (CNVs) بناء على عمق بيانات التغطية لفترات الالتقاط.
    6. بيانات التغطية الصحيحة لتسلسل التحيزات الناتجة عن محتوى الجوانين السيتوزين وتصميم المسبار.
  2. قم بتقييم جودة العينة ، بما في ذلك متوسط العمق ، ومتوسط العمق ، والعمق الفريد ، وحجم الإدراج ، وتعقيد lib ، والتغطية ، ونسبة Q30 ، ونسبة ارتباط العينة المزدوجة كما هو موضح في25.
  3. لإنشاء التقرير، تحقق من إصدار خط الأنابيب والمعلمات لإكمال مراجعة المعلوماتية الحيوية. استخدم الإرشادات ذات الصلة لتقييم إمراضية الطفرات26،27. إصدار التقرير النهائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام سير عمل تحليل NGS الآلي مع ضوابط جودة صارمة ، أجرى المختبر التنميط الجيني الشامل لعينات NSCLC. حدد سير عمل الكشف الأمثل (الشكل 2) بشكل موثوق العديد من التغيرات الجينومية القابلة للتنفيذ سريريا في عينات الورم التمثيلية (الشكل 3).

أظهرت نتائج التسلسل طفرة خاطئة عالية التردد EGFR p.L858R (AF = 89.25٪) مصحوبة بتضخيم كبير لرقم نسخة جين EGFR (CN = 14.7). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ تض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكمن كل تقرير مؤهل من تقارير NGS وراء عملية صارمة ، والتي لا تزال معقدة وتستغرق وقتا طويلا28. لمعالجة هذه المشكلات ، طور المختبر نظام NGS مؤتمت بالكامل. تقلل هذه العملية بشكل كبير من التدخل اليدوي ، وتقلل من الأخطاء التجريبية ، وتقصر بشكل كبير من وقت الاستجابة. لذلك ، قدم هذا النظام استراتيجية أكثر موثوقية وكفاءة ل NGS ، مما أدى إلى إنشاء فكرة جديدة لجودة البيانات في أبحاث الجينوم.

يتميز النظام المتكامل بأتمتة شاملة عبر سير العمل بأكمل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية في جمهورية الصين الشعبية (7252122) ، ومؤسسة بكين شيسيكي لأبحاث الأورام السريرية في جمهورية الصين الشعبية (Y-HS202402-0021) ، وصندوق أبحاث تعليم التدريب على الإقامة في مستشفى السرطان ، والأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية الطب باتحاد بكين (E2025004) ، وتمويل البحوث السريرية للمستشفى الوطني رفيع المستوى (2025-LYZX-R-B03).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  أجيلينت  مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية  أجيلينت5067-4626للاستخدام مع  نظام التحليل الحيوي Agilent 2100
  مجموعة كواشف Agilent DNA 1000  أجيلينت5067-1504للاستخدام مع  نظام التحليل الحيوي Agilent 2100
المحلل الحيوي Agilent 2100أجيلينتG2939Aقيم حجم شظايا المكتبة ووجود المحولات. 
كونشيرت آلة تنقية الأحماض النووية الأوتوماتيكية بالكاملالحفلMC1002يستخدم لاستخراج الحمض النووي
Equalbit 1× مجموعة اختبار dsDNA HSفازيمEQ121-02-AAللاستخدام مع  فلوروميتر الكيوبت 3.0
مجموعة الكشف المشتركة عن طفرات جينية EGRR/KRAS/BRAF/ALK البشريةصخرة محترقةBR-LC00102بناء المكتبة
ماغنيس BRتقنيات أجيلينتG7595AAالتحضير الآلي لمكتبة NGS
ME220 جهاز الموجات فوق الصوتية المركزكوفاريس500396التصوير فوق الصوتية
نانو دروب ون/ون سيثيرمو فيشرND-ONE-Wالكشف الطيفي البصري المرئي بالأشعة فوق البنفسجية بكامل الطول الموجي
NextSeq 550Dxإلومينا20005715تسلسل
NSQ 500/550 عالي الإخراج KT v2.5 (300CYS)إلومينا20024908للاستخدام مع NextSeq 550Dx
كاشف استخراج الأحماض النوويةالحفلRC1102يستخدم لاستخراج الحمض النووي
فلوروميتر الكيوبت 3.0حياةس33216يستخدم لكشف تركيز الأحماض النووية أو المكتبة
مجموعة اختبار HS الكيوبت dsDNAحياةس32851للاستخدام مع  فلوروميتر الكيوبت 3.0

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
  2. Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 75 (1), 10-45 (2025).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Fukuoka, M., et al. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 41 (6), 1162-1171 (2023).
  5. Kris, M. G., et al. Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: A randomized trial. JAMA. 290 (16), 2149-2158 (2003).
  6. Zhou, C., et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): A multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 12 (8), 735-742 (2011).
  7. Wu, K., House, L., Liu, W., Cho, W. C. Personalized targeted therapy for lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 16 (8), C21-C34 (2013).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogenic shock: Turning an activated kinase against the tumor cell. Cell Cycle. 5 (24), 2878-2880 (2006).
  9. Kumar, S. S., et al. High early growth response 1 (EGR1) expression correlates with resistance to anti-EGFR treatment in vitro and with poorer outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. Clin Transl Oncol. 19 (6), 718-726 (2017).
  10. Li, D., et al. Status of 10 targeted genes of non-small cell lung cancer in Eastern China: A study of 884 patients based on NGS in a single institution. Thorac Cancer. 11 (9), 2580-2589 (2020).
  11. Wen, S., et al. Genomic signature of driver genes identified by target next-generation sequencing in Chinese non-small cell lung cancer. Oncologist. 24 (11), e1070-e1081 (2019).
  12. Tan, N., Li, Y., Ying, J., Chen, W. Histological transformation in lung adenocarcinoma: Insights of mechanisms and therapeutic windows. J Transl Int Med. 12 (5), 452-465 (2024).
  13. Coco, S., et al. Next generation sequencing in non-small cell lung cancer: New avenues toward personalized medicine. Curr Drug Targets. 16 (1), 47-59 (2015).
  14. Yang, X., et al. The molecular and cellular choreography of early mammalian lung development. Med Rev. 4 (3), 192-206 (2024).
  15. Wang, R., Wang, G., Zhang, N., Li, X., Liu, Y. Clinical evaluation and cost-effectiveness analysis of serum tumor markers in lung cancer. Biomed Res Int. 2013, 195692(2013).
  16. McGinn, S., Gut, I. G. DNA sequencing-spanning the generations. Nat Biotechnol. 30 (4), 366-372 (2013).
  17. Larson, N. B., Oberg, A. L., Adjei, A. A., Wang, L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 18 (2), 143-157 (2023).
  18. McCombie, W. R., McPherson, J. D., Mardis, E. R. Next-generation sequencing technologies. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (11), a036798(2019).
  19. Van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  20. Rao, W., et al. Potential unreliability of ALK variant allele frequency in the efficacy prediction of targeted therapy in NSCLC. Front Med. 17 (3), 493-502 (2023).
  21. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 529, 35-45 (2013).
  22. Holmes, D. L., Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in oriented agarose gels. J Biomol Struct Dyn. 7 (2), 311-327 (1989).
  23. Liu, D., et al. Quality control of next-generation sequencing-based in vitro diagnostic test for onco-relevant mutations using multiplex reference materials in plasma. J Cancer. 9 (9), 1680-1688 (2018).
  24. Zhang, C., et al. An improved NGS library construction approach using DNA isolated from human cancer formalin-fixed paraffin-embedded samples. Anat Rec (Hoboken). 302 (6), 941-946 (2019).
  25. Wood, D. E. National comprehensive cancer network (NCCN) clinical practice guidelines for lung cancer screening. Thorac Surg Clin. 25 (2), 185-197 (2015).
  26. Chinese Society of Pathology Quality Control, Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology, China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer, Chinese Thoracic Oncology Group. Guidelines on clinical practice of molecular tests in non-small cell lung cancer in China. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 50 (4), 323-332 (2021).
  27. Rao, W., et al. Developing an effective quality evaluation strategy of next-generation sequencing for accurate detecting non-small cell lung cancer samples with variable characteristics: A real-world clinical practice. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (8), 4889-4897 (2023).
  28. Hutchins, R. J., et al. Practical guidance to implementing quality management systems in public health laboratories performing next-generation sequencing: Personnel, equipment, and process management (Phase 1). J Clin Microbiol. 57 (8), e00261-e00319 (2019).
  29. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), e0178706(2017).
  30. Larguinho, M., et al. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta. 81 (3), 881-886 (2010).
  31. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 340 (2), 284-295 (2013).
  32. Senst, A., Bonsiepe, H., Kron, S., Schulz, I. Application of the Agilent 2100 bioanalyzer instrument as quality control for next-generation sequencing. J Forensic Sci. 69 (6), 2192-2196 (2024).
  33. Li, W., Qiu, T., Ling, Y., Gao, S., Ying, J. Subjecting appropriate lung adenocarcinoma samples to next-generation sequencing-based molecular testing: Challenges and possible solutions. Mol Oncol. 12 (5), 677-689 (2018).
  34. Li, W., et al. Potential unreliability of uncommon ALK, ROS1, and RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 16 (3), 404-418 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة