مقالة منهجية

نظام الكشف الجزيئي المتكامل القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف المتزامن عن أربعة طفيليات معوية حيوانية المنشأ من مصادر متعددة

DOI:

10.3791/69180

⸱

أكتوبر 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن أربعة طفيليات معوية حيوانية المنشأ من مصادر متعددة في وقت واحد بناء على مزيج من نظام الكشف الجزيئي المتكامل القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمراض المعدية هي عوامل حاسمة تؤثر على صحة الإنسان والتنمية الاقتصادية والاستقرار الاجتماعي. من بينها ، أصبحت الأمراض الطفيلية المعوية الحيوانية المنشأ بشكل متزايد محط قلق عالمي مثل الأمراض المعدية الناشئة والمعاودة للظهور ، ولا سيما Cryptosporidium و Enterocytozoon bieneusi و Blastocystis و Giardia. تم نشر عدد قليل فقط من الدراسات حول وبائيات الطفيليات المذكورة أعلاه ، مصحوبة بقضايا مثل أهداف الكشف الفردية ، ومعدلات الكشف المنخفضة ، ومعدلات الكشف المفقودة المرتفعة. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء نظام متكامل للكشف الجزيئي يعتمد على مجموعة من اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف المتزامن عن الطفيليات المعوية الحيوانية المنشأ الأربعة المذكورة أعلاه في عينات تم جمعها من الفئران البرية الأليفة المصاحبة والماشية (الأبقار والأغنام) ، من أجل توفير دعم تقني فعال للكشف الروتيني عن الطفيليات في سيناريوهات متعددة ، بما في ذلك الواجهات بين والبيئة خاصة في مرافق المراقبة المحلية.

في هذه الدراسة ، مع الأخذ في الاعتبار الكشف عن Enterocytozoon bieneusi في البراز من 95 فأرا بريا و 30 قطة (25 من القطط و 5 من) كاختبار أولي ، عندما تم استخدام مجموعتين من البادئات لتضخيم جين ITS ، كانت النتائج الإيجابية لكل تفاعل البوليميراز المتسلسل هي نفسها تماما (5.26٪) ، لكن الجمع بين مجموعتين من اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أدى إلى معدل إيجابي أعلى (6.32٪) ل Enterocytozoon bieneusi. بالنسبة للجيارديا ، تم اكتشاف 9 عينات إيجابية باستخدام جين بيتا جياردين (BG) ، بينما لم يتم اكتشاف أي إيجابيات باستخدام جينات نازعة هيدروجين الغلوتامات (GDH) وثلاثي فوسفات إيزوميراز (TPI). أظهرت النتائج المذكورة أعلاه أن مجموعة من اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل لأجزاء وراثية مستهدفة متعددة عززت القدرة على الكشف عن مسببات الأمراض المحددة ، مقارنة بأي اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الفردي. تم تأكيد التسلسلات المستهدفة من خلال تسلسل سانجر. تم تصميم هذا النظام لتعزيز وتسهيل مراقبة حالة العدوى وتوزيعها وتطور النشوء والتطور الوثني للطفيليات المعوية الحيوانية المنشأ من مصادر متعددة ، مما يوفر أساسا لتحذيرات دقيقة وحساسة في مرحلة مبكرة. يهدف هذا إلى بناء جسر تقني لتحقيق هدف الصحة الواحدة عبر واجهات الإنسان والبيئة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر Cryptosporidium و Enterocytozoon bieneusi و Blastocystis و Giardia من مسببات الأمراض الأولية الشائعة التي يمكن إهمالها بسهولة مع انتشار عالمي. في السنوات الأخيرة ، نظرا لعوامل مثل الاستصلاح والتطفل على المنافذ البيئية للبؤر الطبيعية ، وشعبية تربية المصاحبة ، وتطوير تربية الماشية والدواجن ، أصبح انتشار الأمراض الطفيلية المعوية الحيوانية المنشأ متعددة المصادر في القوارض المصاحبة (القطط) والماشية (الأبقار والأغنام) محط تركيز الظهور بشكل متزايد ، تفشي الأمراض المعدية وعودة ظهورها في المناطق المحلية والريفية ، مما يعرض صحة الإنسان وأمن الصحة العامة العالمي للخطر بشكل خطير1،2،3،4.

هذه الطفيليات لها أنواع معقدة داخل الجنيسات وقدرة واسعة على التكيف مع المضيف. يمكن أن تصيب ليس فقط القوارض المصاحبة المجترة الحيوانية والدواجن والطيور ، ولكن أيضا الأنواع الحيوانية المنشأ ، والتي يمكن أن تصيب البشر ، مما يسبب أعراضا سريرية مثل آلام البطن والإسهال والقيء. هم معرضون بشكل خاص بين الأطفال وكبار السن والنساء الحوامل والسكان الذين يعانون من نقص المناعة ، ويمكن أن ينتقلوا عن طريق الماء والغذاء والهواء ، مما يشكل مخاطر كبيرة على الصحة العامة الحيوانية المنشأ3،5،6.

حاليا ، يعتمد تحديد الطفيليات الأربعة المذكورة أعلاه بشكل أساسي على التشكل ، والذي يكون عرضة لسوء التحديد بسبب أوجه التشابه المورفولوجية داخل الأجناس والعوامل الذاتية ، لا سيما في التمييز بين الأنواع والأنماط الجينية. تم استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية على نطاق واسع لتحديد الأنواع والأجناس والأنماط الجينية لهذه الطفيليات. بالنسبة إلى Blastocystis و Cryptosporidium ، يركز الكشف بشكل أساسي على الوحدة الفرعية الصغيرة للحمض النووي الريبوزي الريبوزومي (SSU rRNA) الجين3،7،8 ؛ ل Enterocytozoon bieneusi ، الجين 4،9 ، المباعد الداخلي المنسوخ (ITS) ؛ وبالنسبة للجيارديا ، فإن جينات بيتا جياردين (BG) ، ونازعة هيدروجين الغلوتامات (GDH) ، وإيزوميراز فوسفات ثلاثي (TPI)10،11. على الرغم من أن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي المتداخل (PCR) قد حسن بشكل كبير من قدرات التعرف والكتابة لهذه الطفيليات الأربعة ، إلا أنه غير كاف في اكتشاف الحالات الفائتة وتحديد الأنواع أو أشباه الأنواع الجديدة ذات الخصائص الوراثية الهامة. غالبا ما يؤثر هذا على كفاءة التحقيق الوبائي وانتقال العدوى ومكافحة الأمراض لدى البشر والمضيفين الآخرين ، مما يشكل تحديات كبيرة لأمن الصحة العامة لدى البشر والبيئة.

نظرا لأوجه التشابه في الأعراض وطرق الانتقال ونطاق المضيف لهذه الطفيليات الأربعة ، لا يوجد حتى الآن أي نظام جزيئي متكامل للكشف الفعال مع تجنب الاكتشاف المفقود وتحديد الأنواع الجديدة أو أشباه الأنواع بدقة ذات الاختلافات الجينية الكبيرة. أنشأت هذه الدراسة نظاما متكاملا للكشف الجزيئي ناضجا يعتمد على تقنية التسلسل عالية الإنتاجية PCR من خلال مراجعة الأدبيات ، للكشف المتزامن عن الطفيليات المعوية الحيوانية المنشأ الأربعة في عينات متعددة المصادر (الفئران البرية المصاحبة والماشية والأغنام). وبالاقتران مع تحليل المعلوماتية الحيوية، تم تطبيق هذا النظام لتحديد الطفيليات المعوية الحيوانية المنشأ متعددة المصادر، ورصد العوامل الوبائية مثل توزيع العدوى وتطور النشوء والتطور، والإنذار المبكر بالعدوى البشرية والحيوانية والتلوث البيئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الدراسة وأجريتها من قبل لجنة أخلاقيات التابعة لمركز مقاطعة جيانغسو لمكافحة الأمراض والوقاية منها. أجريت هذه الدراسة وفقا لإصدار 2020 من إرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية بشأن القتل الرحيم للحيوانات ، والمبادئ التوجيهية للوائح إدارة التجارب (الأمر رقم 2 الصادر عن لجنة الدولة للعلوم والتكنولوجيا في جمهورية الصين الشعبية ، 1988) ، والمبادئ التوجيهية للمعاملة الإنسانية للحيوانات الصادرة عن وزارة العلوم والتكنولوجيا في جمهورية الصين الشعبية.

1. تحضير البراز الطازج من الفئران البرية المصاحبة والماشية (الأبقار والأغنام)

  1. قم بتخدير الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون من مصدر ثاني أكسيد الكربون المضغوط المعلب في صندوق بلاستيكي شفاف محكم الإغلاق ، بمعدل استبدال 30٪ -70٪ من حجم الحاوية في الدقيقة. بعد التخدير الكامل والغيبوبة ، قم بإجراء خلع عنق الرحم على الفئران.
  2. جمع عينات البراز الطازجة: اجمع عينات البراز من والقطط والماشية والأغنام في غضون ساعة واحدة بعد التغوط ، باستخدام أنبوب واحد لكل براز ، وتجنب التلوث المتبادل.
    1. التقاط القوارض باستخدام أقفاص الطعم مع أجهزة الإطلاق في الموائل البرية المختلفة. ضع الفئران التي تم التقاطها في أكياس الماوس وانقلها على الفور إلى المختبر. تحت عملية معقمة في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتشريح الفئران لجمع المستقيم الذي يحتوي على البراز ، ووضعه في أنبوب تبريد سعة 2 مل ، وتخزينه عند -80 درجة مئوية للكشف عنه لاحقا.
    2. اختر والقطط من متاجر الأليفة في مناطق مختلفة ككائنات بحثية. اجمع البراز الطازج المفرز على الفور ، في أنابيب تبريد سعة 5 مل ، ملصقة بمعلومات عينة كاملة ، وانقلها على الفور إلى المختبر للتخزين عند -80 درجة مئوية.
    3. اختر الماشية والأغنام من مزارع الثروة الحيوانية (المكثفة أو الحرة) كأهداف بحثية. اجمع البراز الطازج على الفور في أنابيب تبريد سعة 50 مل ، مع وضع علامة عليها بمعلومات عينة كاملة ، وانقلها على الفور إلى المختبر لتخزينها عند -80 درجة مئوية.

2. استخراج الحمض النووي الكلي من البراز الطازج للفئران البرية المصاحبة والماشية (الأبقار والأغنام)

  1. المعالجة المسبقة للبراز:
    ملاحظة: تم استخدام مجموعة QIAamp Fast DNA Stool Kit.
    1. تحت التشغيل المعقم في خزانة السلامة الحيوية ، أضف ما يقرب من 200 مجم من البراز من مصادر مختلفة إلى المخزن المؤقت للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، وأضف حبات فولاذية ، وتجانس تماما باستخدام مطحنة الأنسجة.
    2. قم بتسخين هذا عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وجهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية).
    3. أضف 600 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على 25 ميكرولتر من البروتيناز K ، وأضف 600 ميكرولتر من Buffer AL ، والدوامة لمدة 15 ثانية.
    4. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 600 ميكرولتر من الإيثانول اللامائي بنسبة 100٪ إلى المحلل والدوامة للخلط.
  2. أضف بعناية 600 ميكرولتر من المحلل إلى عمود الدوران ، وقم بالطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 1 دقيقة ، ثم ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  3. افتح عمود الدوران بعناية ، وأضف 500 ميكرولتر من Buffer AW1 ، وجهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة ، ثم ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل. افتح عمود الدوران بعناية ، وأضف 500 ميكرولتر من Buffer AW2 ، وقم بتشغيل أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 3 دقائق.
  4. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل (محضر بشكل منفصل) وجهاز طرد مركزي عند 14000 × جم لمدة 3 دقائق. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي جديد مسمى 1.5 مل ، وأضف 100 ميكرولتر من Elution Buffer مباشرة إلى غشاء عمود الدوران.
  5. احتضان في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة ، وجهاز طرد مركزي عند 14000 × جم لمدة 1 دقيقة لإزالة الحمض النووي.
  6. تحديد تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي فائق الدقيقة. استخدم الحمض النووي المستخرج للكشف اللاحق أو قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية للحفاظ عليه على المدى الطويل.
    ملاحظة: يجب أن تكون نسبة A260 / A280 1.8-2.0 لضمان سلامة ونقاء الحمض النووي المستخرج.

3. الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي المتداخل ل Cryptosporidium و Blastocystis الذي يستهدف الحمض النووي الريبوزي الريبوزومي الصغير (SSU rRNA)

ملاحظة: تم استخدام Dream Taq Green PCR Mix لهذه الخطوة.

  1. قم بإعداد نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على الثلج باستخدام PCR Mix: 25 ميكرولتر من 2× Taq buffer ، 2 ميكرولتر من كل من البادئات الأمامية والعكسية ، 16 ميكرولتر من ddH2O ، و 5 ميكرولتر من القالب ، بحجم إجمالي 50 ميكرولتر.
  2. بالنسبة إلى Cryptosporidium ، اتبع الخطوات 3.2.1-3.2.2.
    1. استخدم F1R11 و F-1R1-18،11 كبادئات تفاعل الجولة الأولى. اضبط برنامج التفاعل: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    2. استخدم F2R21 و F-1R2-18،11كبادئات الجولة الثانية ، مع برنامج التفاعل التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 30 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، التلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  3. بالنسبة إلى المتبرعمة الكيسية ، اتبع الخطوات 3.3.1-3.3.4.
    1. استخدم F1R13 و F1-1R-13،12 كبادئات تفاعل الجولة الأولى. اضبط برنامج التفاعل ل F1R1 على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 100 ثانية ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    2. اضبط برنامج التفاعل ل F1-1R-1 على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 30 دورة تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، التلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. استخدم F2R23 و F2-1R-13،12 كبادئات الجولة الثانية. اضبط برنامج التفاعل ل F2R2 على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    4. اضبط برنامج التفاعل ل F2-1R-1 على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
      ملاحظة: يتم عرض تسلسلات التمهيدي في الجدول 11،3،8،11،12.
مسببات الأمراضحجم المنتج المتوقع (نقطة أساس)تسلسلات التمهيدي (5′-3′)مراجع
كريبتوسبوريديوم830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
المتبرعمة الكيسية600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

الجدول 1: تسلسل التمهيدي ل SSU rRNA من Cryptosporidium و Blastocystis.

4. الكشف التقليدي المتداخل عن تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين Enterocytozoon bieneusi ITS ، وجينات Giardia BG و GDH و TPI

ملاحظة: تم استخدام Dream Taq Green PCR Mix لهذه الخطوة.

  1. قم بإعداد نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على الثلج باستخدام مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): 25 ميكرولتر من 2× مخزن مؤقت Taq ، 2 ميكرولتر لكل من البادئات الأمامية والخلفية ، 16 ميكرولتر من ddH2O ، و 5 ميكرولتر من القالب ، بحجم إجمالي 50 ميكرولتر.
  2. بالنسبة إلى Enterocytozoon bieneusi ، اتبع الخطوات 4.2.1-4.2.2.
    1. استخدم F1R19 و F1-1R1-12 كبادئات تفاعل الجولة الأولى. اضبط برنامج التفاعل على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    2. استخدم F2R29 و F2-1R2-12 كبادئات الجولة الثانية ، مع برنامج التفاعل على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 30 دورة تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، التلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  3. بالنسبة إلى Giardia ، اتبع الخطوات 4.3.1-4.3.3.
    1. استخدم BG-F1R1 و GDH-F1R1 و TPI-F1R12،10 كبادئات تفاعل الجولة الأولى للجينات المستهدفة الثلاثة. اضبط برنامج تفاعل الجولة الأولى للجميع على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 50 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    2. اضبط برنامج تفاعل الجولة الثانية ل BG-F2R22،10 و TPI-F2R22،10 على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. اضبط برنامج تفاعل الجولة الثانية ل GDH-F2R22،10 على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 30 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، مع استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
      ملاحظة: يتم عرض تسلسلات التمهيدي في الجدول 22،9،10.
مسببات الأمراضحجم المنتج المتوقع (نقطة أساس)تسلسلات التمهيدي (5′-3′)مراجع
Enterocytozoon bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTCTCTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATGGATTT
الجيارديا511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGAGAC
BG-F2: GAACGAACGAGAGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

الجدول 2: تسلسل التمهيدي ل Enterocytozoon bieneusi ITS الجين ، وجينات Giardia BG و GDH و TPI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفئران Cryptosporidium ، جين Blastocystis SSU rRNA ، جين Enterocytozoon bieneusi ITS ، ونتائج اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني Giardia BG
تم اختبار جميع عينات براز المستقيم البالغ عددها 95 عينة من الفئران بحثا عن جين ITS الخاص ب Enterocytozoon bieneusi باستخدام مجموعتين من البادئات ، مما أدى إلى 5 عينات إيجابية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ال Cryptosporidium و Enterocytozoon bieneusi و Blastocystis و Giardia هي طفيليات معوية حيوانية المنشأ شائعة. تم تصنيف الأولين على أنهما مسببات الأمراض البيولوجية من الفئة ب من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) ، وتم إدراج الأربعة جميعا من قبل منظمة الصحة العالمية (WHO) على أنها 24 من أهم الطفيليات التي تنقلها الأغذية في جميع أنحاء العالم. يمكن أن تصيب البشر وتلوث البيئة ، مما قد يتسبب في تفشي الأمراض ويؤثر بشكل كبير على أمن الصحة العامة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل لجنة الصحة الإقليمية لمقاطعة جيانغسو (رقم المنح. Ym2023024) ، مشروع البحوث الطبية البلدية في Yancheng (رقم المنحة. YK2023085) ، والصندوق المفتوح للمختبر الرئيسي لعلم الأحياء الدقيقة المسببة للأمراض المسببة للأمراض المعدية الناشئة والمستمرة (مركز مقاطعة جيانغسو لمكافحة الأمراض والوقاية منها) (PM202402).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغاروز تشينغكه تكTSJ001
مجموعة استخراج جل QiaquickQiagen 28704مجموعة استخراج جل الحمض النووي
سلم 100 نقطة أساس زائد للحمض النوويTransGen  التكنولوجيا الحيويهBM311سلم الحمض النووي
صبغة 4S Green Plus Nucleic AcidBBIA616696-0500صبغة الحمض النووي
10×؛ مخزن TBEسولاربيولوجياT1051مخزن الرحلان الكهربائي
الكيوبت 4.0الحراريهhttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/صناعي/طيافية-عنصرية
-تحليل نظير/مطيافية جزيئية/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& cid=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		جهاز الفلورة الكمي
ميني سبيس 1000تانونhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
النوع = التفاصيل		كاميرا الجل
  مجموعة صغيرة سريعة لبراز الحمض النووي لاستخراج الحمض النوويكياغين51604مجموعة استخراج الأحماض النووية
قاعدة بروفليكسالحراريهhttps://www.thermofisher.com/
in/en/home/life-science/PCR/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
مزيج دريم تاك الأخضر PCRالحراريهK1082تضخيم PCR  

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Q., et al. Cryptosporidium spp. in large-scale sheep farms in China: prevalence and genetic diversity. Sci Rep. 14 (1), 11218(2024).
  2. Li, F., Wang, R., Guo, Y., Li, N., Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential of Enterocytozoon bieneusi and Giardia duodenalis in horses and donkeys in northern China. Parasitol Res. 119 (3), 1101-1108 (2020).
  3. Jinatham, V., Maxamhud, S., Popluechai, S., Tsaousis, A. D., Gentekaki, E. Blastocystis One Health approach in a rural community of Northern Thailand: prevalence, subtypes and novel transmission routes. Front Microbiol. 12 (1), 746340(2021).
  4. Deng, L., et al. Occurrence and genetic characteristics of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in pet red squirrels (Sciurus vulgaris) in China. Sci Rep. 10 (1), 1026(2020).
  5. Zhao, W., Zhou, H. H., Ma, T. M., Cao, J., Lu, G., Shen, Y. J. PCR-based detection of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in farm-raised and free-ranging geese (Anser anser f. domestica) from Hainan Province of China: natural infection rate and the species or genotype distribution. Front Cell Infect Microbiol. 9 (1), 416(2019).
  6. Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 110-140 (2011).
  7. Zhao, G. H., et al. Genotyping Cryptosporidium andersoni in cattle in Shaanxi Province, Northwestern China. PLoS One. 8 (4), e60112(2013).
  8. Ryan, U., Xiao, L., Read, C., Zhou, L., Lal, A. A., Pavlasek, I. Identification of novel Cryptosporidium genotypes from the Czech Republic. Appl Environ Microbiol. 69 (7), 4302-4307 (2003).
  9. Gui, B. Z., et al. Novel genotypes and multilocus genotypes of Enterocytozoon bieneusi in two wild rat species in China: potential for zoonotic transmission. Parasitol Res. 119 (1), 283-290 (2020).
  10. Ye, J., et al. Occurrence of human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi, Giardia duodenalis and Cryptosporidium genotypes in laboratory macaques in Guangxi, China. Parasitol Int. 63 (1), 132-137 (2014).
  11. Alves, M., Xiao, L., Sulaiman, I., Lal, A. A., Matos, O., Antunes, F. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol. 41 (6), 2744-2747 (2003).
  12. Santín, M., Gómez-Muñoz, M. T., Solano-Aguilar, G., Fayer, R. Development of a new PCR protocol to detect and subtype Blastocystis spp. from humans and animals. Parasitol Res. 109 (1), 205-212 (2011).
  13. Bouwknegt, M., et al. Prioritisation of food-borne parasites in Europe, 2016. Euro Surveill. 23 (9), 17(2018).
  14. Xiao, L., Fayer, R. Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission. Int J Parasitol. 38 (11), 1239-1255 (2008).
  15. Cacciò, S. M., Beck, R., Lalle, M., Marinculic, A., Pozio, E. Multilocus genotyping of Giardia duodenalis reveals striking differences between assemblages A and B. Int J Parasitol. 38 (13), 1523-1531 (2008).
  16. Wawrzyniak, I., et al. Blastocystis, an unrecognized parasite: an overview of pathogenesis and diagnosis. Ther Adv Infect Dis. 1 (5), 167-178 (2013).
  17. Honigsbaum, M. Disease X and other unknowns. Lancet. 393 (10180), 1496-1497 (2019).
  18. A scientific framework for epidemic and pandemic research preparedness. , WHO. At https://cdn.who.int/media/docs/default-source/consultation-rdb/prioritization-pathogens-v6final.pdf?sfvrsn=c98effa7_7&download=true (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة