يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج متقدم للزراعة المشتركة لحاجز الدم والسائل الدماغي الشوكي البشري لتحليل منفصل لضفير المشيمية التشيليم والظهارة الداخلية

429 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69275

⸱

نوفمبر 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

في هذه المقالة

ملخص

تم إنشاء زراعة مشتركة لخلايا الظهارة والبطانة البشرية في الضفيرة المشيمية لتوليد نموذج متقدم في المختبر لحاجز السائل الدموي الدماغي الشوكي. نحن نصف العزل المنفصل للظهارة والبطانة لتحضير الحمض النووي الريبي اللاحق والتحليل النسخي تحت ظروف محددة.

الملخص

الضفيرة المشيمية عالية التروم، الموجودة في الجهاز البطيني للدماغ، تتكون من عدة مكونات هيكلية، بما في ذلك ظهارة مكعبة وبطانة مغلقة بفتحات، وهي موقع الحاجز السائل الدموي الدماغي الشوكي (BCSFB). لدراسة مرض الشلل الدماغي في المختبر، يمكن تصور عدة ترتيبات مختلفة لزراعة الخلايا. تم تأسيس نموذج مرشح لزراعة الخلايا المقلوبة بوظيفة حاجز قوية، يعتمد على خلايا ورم الحليم الظهاري البشري (HIBCPP)، من قبل مختبرنا ويستخدم على نطاق واسع. مؤخرا، تمكنا من توليد خط خلوي بطاني CP بشري مستقر وخالد (iHCPEnC). من خلال دمج كلا الخطين الخلويتين، قمنا بتجميع نموذج وظيفي متقدم من نوع الخلية الذي طور وظيفة حاجز أعلى مقارنة بخلايا HIBCPP وحدها. نظرا لأن هذا النموذج يمثل كل من ظهارة CP وبطانة الدماغ، فإنه يسمح بدراسة التفاعل بين نوعي الخلايا تحت ظروف محددة، مثل العدوى أو الالتهاب أو غيرها. في هذا البروتوكول، نسمع طرقا لإنشاء هذا النموذج ذو الخلية الثنائية مع فصل لاحق بين الخلايا الطهارية والبطانية لإجراء تحليلات نسخية. نحن نصف بادئات PCR الخاصة بالظهارة والبطانة، والتي تساعد في اكتشاف احتمال التلوث المتبادل بين نوعي الخلايا. لدراسة تأثير محتمل لبطانة CP على الظهارة في هذا النموذج تحت ظروف الالتهاب، تم تحليل مستويات التعبير للجينات المختارة في سياق علاج بوليبوبوليسكاريد (LPS) في جزء خلية HIBCPP. يعد نموذج CP المتقدم في المختبر وإمكانية تحليل الاستجابات الظهارية والبطانية بشكل منفصل من أهمية كبيرة للأبحاث حول العمليات الخلوية التي تشمل الوظائف البيولوجية والمرضية للخلط الدماغي.

المقدمة

الضفيرة المشيمية (CP) هي تكتل عالي الأوعية الدموية من مجموعات مختلفة من الخلايا تقع في جميع البطينات الأربعة للدماغ. من بين وظائفه الأخرى، يعمل كحاجز فسيولوجي، يسمى الحاجز السائل الدموي الشوكي (BCSFB)، بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) والدم، مما يمنع الدماغ من، مثل المواد المعدية المنتشرة في الدم. يتكون ال CP من أنواع خلايا مختلفة، بما في ذلك الخلايا الظهارية المستقطبة، التي تحتوي على وصلات محكمة وملتصقة بالإضافة إلى ديسموسومات، وتقع على غشاء قاعدي. يتضخم سطح الخلايا الظهارية بوجود الزغب الدقيق على سطح المضيء. تقع الشعيرات الدموية البطانية المثقفة بالمسنين، المحاطة بأنسجة ضامة مثل الخلايا الليفية والخلايا المناعية، تحت الغشية القاعدية1،2،3. وقد تم الإبلاغ مؤخرا أن خلايا بطانة CP قادرة على تعزيز سلامة BCSFB مع الخلايا الطهارية، وبالتالي قد تلعب دورا في حماية الدماغ أثناء العمليات الالتهابية 4,5.

حتى الآن، يعد الزراعة المقلوبة لخلايا الورم الحليمي الظهاري البشري (HIBCPP) هي النموذج الأكثر استخداما في المختبر لمحاكاة BCSFB البشري ذو قيم عالية من المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ووظيفة حاجز قوية. لفهم أفضل لوظائف الخلايا وتجنب التجارب الحيوانية في نفس الوقت، من المهم استخراج أكبر قدر ممكن من المعلومات من تجارب المختبر. تم تأسيس أول خط خلوي بطاني خلود ومستقر في المختبر الدماغي (iHCPEnC) مؤخرا في مختبرنا 6,7. بمساعدة خلايا HIBCPP وiHCPEnC، نستطيع تجميع نموذج الزراعة المشتركة في المختبرات يحاكي BCSFBبطريقة أكثر تقدما. باستخدام هذا النموذج ذو الخلية، يمكننا إثبات أن الزراعة المشتركة بين خلايا HIBCPP وiHCPEnC تؤدي إلى زيادة قيم TEER مقارنة بخلايا HIBCPP وحدها. من المهم ملاحظة أن iHCPEnC وحده لا يطور TEER 7,8. سيسمح التحضير المنفصل والتحليلات اللاحقة لنوعي الخلايا المستخدمين في هذا النموذج بدراسة تفاعلهما في الظروف الصحية والمريضة.

هنا نصف نهجين مختلفين لتحقيق هذا الهدف. الأساس هو أنه في كلتا الحالتين، يعتمد النهج على نموذج زراعة الخلايا المقلوبة لخلايا HIBCPP (الشكل 1). الطريقة 1، وهي طريقة "الزراعة المباشرة"، تتكون من كلا الخليتين على إدخال مرشح واحد. تزرع خلايا HIBCPP بطريقة معكوسة قبل زرع iHCPEnC بالطريقة القياسية 7,8. الطريقة الثانية، وهي ثقافة "الغشاء في الإدخال"، هنا أضفنا غشاء منفصل بنفس خصائص الغشاء المستخدم في إدخالات الفلتر. يتم وضع هذا الغشاء الإضافي في إدخال مرشح حيث تنمو خلايا HIBCPP بالفعل في الزراعة المقلوبة. يتم زرع iHCPEnC على الغشاء الإضافي بطريقة الزراعة القياسية.

الفصل اللاحق للخلايا لتحليل الحمض النووي الريبي يسمح برؤية حول التفاعل النسخي لظهارة CP والبطانة تحت ظروف محددة. نحن نصف بادئات PCR الخاصة بخلايا HIBCPP وiHCPEnC التي تمكن من تأكيد الفصل الناجح والنظيف لكلا نوعي الخلايا. بعد العلاج بالدهون البوليسكاريدية (LPS)، نستخدم النماذج الموصوفة لدراسة الاستجابات المميزة لظهارة CP في وجود البطانة تحت ظروف التهابية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. خلايا HIBCPP

ملاحظة: فيما يلي، نصف زراعة وصيانة خلايا HIBCPP، بالإضافة إلى تحضير إدخالات مرشحات مقلوبة لزراعة الخلايا باستخدام خلايا HIBCPP. تم تصميم هذا البروتوكول لنمو خلايا HIBCPP على مدخلات مرشح زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا. تم نشر بروتوكول مفصل مع فيديو مرافق لزراعة خلايا HIBCPP على إدخالات مرشح لزراعة الخلايا ذات 24 بئرا سابقافي 9.

  1. أخذ خلايا HIBCPP إلى الزراعة
    1. إذابة قارورة من خلايا HIBCPP في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. أعد تعليق محتوى القارورة مع 10 مل من وسط DMEM/HAMS-F12 يحتوي على 10٪ مصل العجل الجيني (FCS) و5 ميكروغرام إنسولين/مل من وسط مسخن مسبقا (10٪ وسط HIBCPP).
    3. ضع خلايا HIBCPP المعلقة في قارورة زراعة خلايا T75 وحضنتها لمدة 24 ساعة عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    4. غير وسط القارورة لإزالة DMSO بعد 24 ساعة من زرع الخلايا.
    5. زراعة الخلايا حتى 90٪ من التقاء الجسم، وهذه الخطوة تستغرق حوالي أسبوعين. غير الوسيط مرتين في الأسبوع.
  2. الزراعة المستمرة لخلايا HIBCPP
    ملاحظة: للزراعة المستمرة، قسم خلايا HIBCPP بنسبة 1:3 إلى قوارير زراعة خلايا T75 جديدة.
    1. أزل وسيط الزراعة من قارورة T75.
    2. اغسل الخلايا مرة واحدة ب 10 مل من PBS.
    3. أزل PBS.
    4. فصل خلايا HIBCPP بمساعدة 3 مل من 0.25٪ تريبسين-إيدتا. تستغرق هذه الخطوة حوالي 10-20 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. لف القارورة في هذه الأثناء لضمان تغطية طبقة الخلية بالكامل ب Trypsin-EDTA.
    5. أضف 7 مل من وسط HIBCPP وجهاز طرد مركزي بقوة 50 × جرام لمدة 10 دقائق عند RT.
    6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 30 مل من وسط HIBCPP بنسبة 10٪ وانشر إلى 3 قوارير T75 جديدة.
    7. زراعة الخلايا حتى 90٪ من التقاطع؛ ستصل الخلايا إلى التقاء خلال حوالي أسبوع.
    8. غير الوسيط مرتين في الأسبوع.
      ملاحظة: خلايا HIBCPP ليست مثبطة للنمو؛ لذلك، ستتجمع القارورة، وستستمر الخلايا في النمو وتشكل طبقات متعددة.
  3. زرع خلايا HIBCPP في الزراعة المقلوبة
    1. أزل وسيط الزراعة من قارورة T75.
    2. اغسل الخلايا مرة واحدة ب 10 مل من PBS.
    3. أزل PBS.
    4. فصل خلايا HIBCPP بمساعدة 3 مل من 0.25٪ تريبسين-إيدتا. تستغرق هذه الخطوة حوالي 10-20 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. لف القارورة في هذه الأثناء لضمان تغطية طبقة الخلية بالكامل ب Trypsin-EDTA.
    5. في هذه الأثناء، جهز إدخالات الفلتر. حول إدخالات الفلتر ذات 12 بئر في وضع مقلوب إلى لوحة زراعة خلايا ذات 6 آبار بمساعدة الملقط واملأها بوسط HIBCPP مسخن مسبقا بنسبة 10٪. بلل الغشاء مسبقا بقطرة من الوسط فوق كل إدخال فلتر.
    6. أعد تعليق الخلايا المزيفة بالتربسين بسعة 17 مل من وسط HIBCPP بنسبة 10٪.
    7. قم بجهاز الطرد المركزي عند 50 x g لمدة 10 دقائق في RT وضبط خلايا HIBCPP إلى تركيز 1 × 106 خلايا/مل.
      ملاحظة: تميل خلايا HIBCPP إلى تكوين تجمعات صغيرة. ليس من الضروري إذابتها بالكامل قبل الزرع على إدخالات الفلتر. تأكد من أن 90٪ من الخلايا مفردة.
    8. يتم زرع خلايا HIBCPP بذرة بشكل مقلوب على إدخالات مرشح ب 12 بئر بكثافة 4 ×10 5 خلايا/إدخال.
    9. انتظر حتى يتم امتصاص تعليق الخلية بواسطة الغشاء. أغلق غطاء لوحة زراعة الخلايا ذات الستة آبار.
    10. ضع الألواح التي تحتوي على الأجزاء المقلوبة في الحاضنة.
    11. بعد 24 ساعة من البذر، قم بتدوير المضافات بمساعدة الملقط إلى وضعها الصحيح إلى صفيحة زراعة خلايا جديدة ب 12 بئئ. ضع 2 مل من متوسط HIBCPP بنسبة 10٪ في الحجرة السفلية و1 مل في الحجرة العلوية.
    12. اترك الخلايا لمدة 5 إلى 6 أيام دون أي تغيير وسط، وابدأ في تحديد TEER وإعداد الزراعة المشتركة.

2. تحديد TEER

ملاحظة: يتم تحديد قيم TEER بمساعدة جهاز MilliCell ERS2 وقطب عصا الطعام. يتطلب الحساب قياسا فارغا من إدخالات مرشح زراعة الخلايا في وسط بدون خلايا (أومفارغ).

  1. خزن قطب العصا جافا. قبل بدء القياس، ضع القطب في إيثانول بنسبة 80٪ لمدة 10 دقائق للتعقيم.
  2. بعد ذلك، اشطف القطب ب PBS.
  3. بدء القياس: ضع الطرف الطويل من القطب في البئر والطرف القصير للقطب في إدخال المرشح الذي يحتوي على الخلايا المتلقية.
  4. سجل قيمة الأوم لإدخال مرشح زراعة الخلايا ذو 12 بئر (عينة أوم).
  5. احسب مؤشر TEER كما يلي: أوم·سم2 = (عينة أوم -أوم فارغ) × 1.1 سم2.
  6. بعد الانتهاء من القياس، اشطف القطب ب 80٪ إيثانول ثم خزن جافا.
    ملاحظة: بين قياسات الظروف التجريبية المختلفة أو قياسات خطوط الخلايا المختلفة، يجب تعقيم قطب عود الطعام وشطفه ب PBS لمنع التلوث المتبادل.

3. iHCPEnC

  1. إدخال iHCPEnC إلى الثقافة
    1. قم بإذابة قارورة iHCPEnC في RT.
    2. أعد تعليق محتوى القارورة مع 5 مل من وسط بطانة كلاسيك كامل (وسط iHCPEnC) الدافئ مسبقا.
    3. الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة 5 دقائق عند RT.
    4. في هذه الأثناء، قم بتغطية قارورة زراعة خلايا T25 بمقدار 2 مل من عامل التعلق لمدة دقيقة تقريبا. استنشق عامل التعلق واترك القارورة حتى يتم زرع iHCPEnC.
    5. أعد تعليق حبيبة الخلية بسعة 5 مل من وسط iHCPEnC وضعها في قارورة زراعة الخلية T25 المحضرة.
    6. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة أسبوع دون تغيير في الوسط.
  2. الزراعة المستمرة ل iHCPEnC
    ملاحظة: للزراعة المستمرة، قسم iHCPEnC بنسبة 1:4 إلى قوارير جديدة لزراعة خلايا T25.
    1. أزل وسط iHCPEnC واغسل الخلايا مرة واحدة ب 3 مل من PBS. كن حذرا من تجنب فصل الخلايا.
    2. استنشق PBS.
    3. فصل iHCPEnC المتلاقط بمساعدة 1 مل من تريبسين-إيدتا. تستغرق هذه الخطوة حوالي 3-5 دقائق في RT.
    4. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط iHCPEnC.
    5. الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة 5 دقائق عند RT.
    6. في هذه الأثناء، قم بطلاء 4 قوارير T25 جديدة بمقدار 2 مل من عامل التثبيت لكل قارورة.
    7. أعد تعليق حبيبة الخلية باستخدام 20 مل من وسط iHCPEnC.
    8. وزع 5 مل من تعليق الخلية على كل من القوارير الأربع المحضرة.
    9. مرة أخرى، قم بزراعة الخلايا لمدة أسبوع دون تغيير في الوسط. سيصلان إلى التقاءهما خلال أسبوع واحد.
      ملاحظة: خلايا iHCPEnC مثبطة النمو؛ لذلك، ستتجمع القارورة، وستطفو الخلايا المتبقية.

4. التحضيرات لتجارب الزراعة المشتركة

  1. الطريقة 1: في "الزراعة المباشرة" (زراعة الخلايا الظهارية وخلايا البطانة على جانبي إدخالات واحدة)، لا تحضر أي أشياء إضافية.
  2. الطريقة 2: بالنسبة لطريقة "الغشاء في الإدخال"، قم بتنفيذ الخطوات التالية:
    1. قم بإخراج أغشية بحجم مدخل فلتر زراعة الخلايا ب 12 بئر بمساعدة حديد مثقب رقم 11 (يعادل قطره 11 مم) من غشاء منفصل من نوع Din-A-4.
    2. ضع أغشية مثقوبة في طبق بتري.
    3. قم بتعقيم الأغشية المثقبة لمدة 60 دقيقة باستخدام ضوء فوق البنفسجي (UV-C، 254 نانومتر).
      ملاحظة: يمكن تحضير أغشية بحجم إدخال فلتر زراعة الخلايا بحجم 12 بئر ومعقمة مسبقا وتخزينها في ظروف معقمة.

5. إعداد الثقافة المشتركة

ملاحظة: في هذه المرحلة، تكون خلايا HIBCPP جاهزة بالفعل لنموذج الزراعة المختبرية من نوع الخلية. تم زراعة خلايا HIBCPP لمدة 5 إلى 6 أيام (قارن الخطوات 1.3.8-1.3.12). يجب أن تبدأ خلايا HIBCPP في تطوير TEER (حوالي 20 أوم·سم2).

  1. لكل من الطريقتين، الطريقة 1 ("الزراعة المشتركة المباشرة") والطريقة 2 ("الغشاء في الإدخال"), تستبدل وسط HIBCPP بنسبة 10٪ بوسط HIBCPP بنسبة 1٪. لهذا الغرض، ضع 2 مل من وسط HIBCPP بنسبة 1٪ في بئر يحتوي على صفيحة زراعة خلايا مكونة من 12 بئرا.
  2. أفرغ الزراعة المقلوبة التي تحتوي على إدخال الفلتر بمساعدة الماصة والملقط، ووضع إدخال الفلتر في الاتجاه القياسي داخل البئر ال12 المحضر.
  3. للطريقة 2 ("الغشاء في الإدخال"), جهز إدخالات المرشح كما يلي:
    1. ضع الغشاء المثقوب والمعقم في إدخال مرشح محضر ب 12 بئر باستخدام خلايا HIBCPP في زراعة مقلوبة بمساعدة الملقط.
  4. أعد صفائح زراعة الخلايا إلى الحاضنة لتريبسينية iHCPEnC (موضح في الخطوة 6).

6. زراعة وزراعة iHCPEnC في الزراعة المشتركة

ملاحظة: في القسم التالي، يتم وصف إنشاء زراعة مشتركة لخلايا HIBCPP وiHCPEnC على إدخالات مرشح لزراعة الخلايا ذات 12 بئر. تم وصف بروتوكول مفصل للزراعة المشتركة لخلايا HIBCPP وiHCPEnC على إدخالات مرشحات زراعة الخلايا ذات 24 بئراسابقا. قبل فصل iHCPEnC، احسب عدد الخلايا اللازمة لإجراء الزراعة المشتركة. قارورة واحدة من زراعة خلايا T25 المتلاطمة ستوفر كمية تقريبية من 5 × 10إلى 5 خلايا.

  1. قم بإزالة وسط قارورة T25 متصلة تحتوي على iHCPEnC.
  2. اغسل iHCPEnC بسعة 3 مل من PBS. تجنب فصل الخلايا.
  3. أزل PBS.
  4. فصل iHCPEnC المتلاقط بمساعدة 1 مل من تريبسين-إيدتا. تستغرق هذه الخطوة حوالي 3-5 دقائق في RT.
  5. أعد تعليق الخلايا في قارورة 5 مل/T25 باستخدام وسط iHCPEnC.
  6. عد الخلايا في غرفة نيوباور.
  7. الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في RT.
  8. أعد تعليق حبيبات الخلية إلى تركيز نهائي 1 × 10إلى 5 خلايا/مل في وسط iHCPEnC.
  9. كل من الطريقة 1 ("الزراعة المشتركة المباشرة") والطريقة 2 ("الغشاء في الإدخال"): بذور 700 ميكرولتر iHCPEnC (7x105 خلايا) في إدخال مرشح ب 12 بئر.
  10. راقب قيم TEER للزراعة المشتركة وعناصر التحكم (أي خلايا HIBCPP وزراعة iHCPEnC فقط) لأول مرة بعد 24 ساعة من زرع iHCPEnC وبعدها يوميا.

7. علاج LPS

ملاحظة: يجب أن تقدم الزراعة المشتركة قيم TEER أعلى مقارنة بزراعة الخلايا فقط في HIBCPP (العامل المقترح: 1.5 أو أكثر).

  1. قياس وتسجيل قيم TEER لمواد زراعة الخلايا المعدة للتجارب.
  2. تحضير خليط رئيسي يحتوي على 5 ميكروغرام/مل LPS في وسط HIBCPP بنسبة 1٪.
  3. جهز صفائح جديدة ب 12 بئر تحتوي على 2 مل من متوسط HIBCPP بنسبة 1٪ لكل بئر.
  4. أفرغ الإدخال بمساعدة الملقط واستخدام المشاكل.
  5. ضع الشوائب في الآبار المحضرة.
  6. أضف 1 مل من خليط LPS الرئيسي أو 1٪ من وسط HIBCPP على التوالي (التحكم السلبي).
  7. حضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
  8. قم بقياس وتسجيل قيم TEER قبل الانتقال إلى القسم 8.

8. عزل الحمض النووي الريبي عن خلايا HIBCPP وiHCPEnC لإجراء تحليل نسخي لاحق

ملاحظة: لتحقيق جزئين منفصلين من الخلايا وتجنب التلوث المتبادل من الخلايا المزروعة في نموذج الزراعة المشتركة، يتم كشط أجزاء الخلايا بعناية من الإدخال بشكل منفصل. نفذ جميع خطوات عزل الحمض النووي الريبي لكل إدخال مرشح دون انقطاع (لا يسمح للإدخال بأن تجف).

  1. اغسل إدخالات الفلتر مرة واحدة باستخدام PBS. لهذا الغرض، جهز ألواح زراعة خلايا بسعة 12 بئرا تحتوي على 1.5 مل PBS لكل بئر.
  2. أفرغ مدخلات فلتر زراعة الخلايا بمساعدة الماصة والملاقط. ضع الإدخال في لوحة زراعة الخلايا المملوءة ب PBS ب 12 بئرا.
  3. أضف 1 مل من PBS إلى الإدخالات.
  4. لتحضير خلايا iHCPEnC وHIBCPP للطريقة 1 ("الزراعة المباشرة"), قم بتنفيذ الخطوات التالية:
    1. أزل PBS من الإدخال وضعه في لوحة زراعة خلايا فارغة وجافة بسعة 12 بئر.
    2. بمساعدة طرف الماصة وتركيب أنابيب 10-20 ميكرولتر من PBS، يتم فصل iHCPEnC عن الإدخال عن طريق الكشط.
    3. ضع هذا الجزء الخلوي في أنبوب بحجم 1.5 مل يحتوي على 350 ميكرولتر من محلول تحلل RNA. قم بعمل بيبيتي للأعلى والأسفل لخلط الخلايا بشكل صحيح مع مخزن تحليل الحمض النووي الريبي.
    4. بعد الانتهاء من حصاد جزء iHCPEnC، قم بتدوير الإدخال للأعلى إلى غطاء صفيحة زراعة الخلايا.
    5. قم بإزالة خلايا HIBCPP من الغشاء تماما مثل جزء iHCPEnC، وضعها في أنبوب جاهز بسعة 1.5 مل يحتوي على 350 ميكرولتر من RLT-β-ميركابتوإيثانول.
      ملاحظة: إذا تم تجهيز عدة زراعة مشتركة لحالة واحدة، خذ 350 ميكرولتر من محلول تحليل الحمض النووي الريبي لكل إدخال وجزء خلوي. يتم تنقية أجزاء خلية مجهزة واحدة من حالة معينة بشكل متتالي على نفس العمود.
  5. لتحضير خلايا iHCPEnC وHIBCPP للطريقة 2 ("الغشاء في الإدخال"), قم بتنفيذ الخطوات التالية:
    1. أزل الغشاء الإضافي بمساعدة الملقط وضعه في غطاء جاف للوحة زراعة خلايا مكونة من 12 بئر. ماثلة 100 ميكرولتر من محلول تحلل RNA على الغشاء لتحلل iHCPEnC.
    2. ضع هذا الليزات بسعة 100 ميكرولتر في أنبوب بسعة 1.5 مل يحتوي على 250 ميكرولتر من مخزن تحلل الحمض النووي الريبي وامزج جيدا.
    3. أزل PBS من إدخال الفلتر وضعه للأعلى في غطاء لوحة زراعة خلايا ب 12 بئر. أضف 100 ميكرولتر من مخزن تحلل الحمض النووي الريبي إلى غشاء الإدخال وقم بتحليل جزء خلية HIBCPP.
    4. ضع هذا التحلل بسعة 100 ميكرولتر في أنبوب بسعة 1.5 مل يحتوي على 250 ميكرولتر من محلول تحلل RNA.
  6. قم بعزل الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  7. قس كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيفي.
  8. قم بإجراء النسخ العكسي وتحليل qPCR لعينات RNA كما وصفها المصنع.
    ملاحظة: نظرا لأن الزراعة المشتركة تحتوي على كميات أقل من iHCPEnC مقارنة بخلايا HIBCPP، فإن عدة إدخالات مرشح بقيمة 12 بئر مطلوبة لعزل كمية كافية من RNA من iHCPEnC، وذلك حسب التحليل اللاحق. يجب تجميع محللات الحمض النووي الريبي في إدخالات المرشح المختلفة. يمكن إجراء النسخ العكسي وqPCR كما هو موضحسابقا 6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذا البروتوكول، نصف التوليد خطوة بخطوة لنموذج من نوع الخلية الثنائية للشلوغ الدماغي البشري يتكون من الظهارة (خلايا HIBCPP) وبطانة الرحم (iHCPEnC) على إدخالات مرشحات زراعة الخلايا، كما هو موضح بشكل مخطط في الشكل 1. في هذا النظام النموذجي، تزرع خلايا HIBCPP بطريقة مقلوبة على الجانب السفلي من المرشح، بينما تزرع iHCPEnC إما على الجانب العلوي من مرشح الإدخال أو على مرشح ثان موضوع فوق غشاء الإدخال.

قيم TEER لنموذج الخلية الثن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتكون الالتهاب الشللي الدماغي البشري من عدة أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك ظهارة تشكل الحاجز وبطانة الأوعية الممتدة3. على الرغم من أن خلايا البطانة في CP مشمولة، إلا أن الأبحاث الحديثة أظهرت مساهمتها في وظيفة الحاجز عند BCSFB 4,7. لدراسة التفاعلات المعقدة بين البطانة والظهارة في الأعضاء كالشفشف الدماغي، يتطلب الأمر نماذج متقدمة في المختبر تسمح بتحليل كلا نوعي الخلايا2....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنهم لا يواجهون تضارب مصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين-إيدتالايف تكنولوجيز  25200056
12 بئر لوح زراعة خلايا  ستارلابCC7682-7512
12 إدخال مرشح بئر (3 وميكرو؛ M pores)جرينر بيو ون665631
24 بئر لوحة زراعة خلايا ستارلابCC7672-7524
إدراج فلتر 24 بئئر  (0.4 وميكرو؛ M pores)جرينر بيو ون662641
إدخال فلتر 24 بئر (3 وميكرو؛ M pores)جرينر بيو ون662631
6 بئر لوحة زراعة الخلايا  ستارلابCC7682-7506
مجموعة تصنيع cDNA من AffinityScript (تخليق cDNA)أجيلينت600559
عامل التعلقأنظمة الخلايا4ZO-500جزء من مجموعة الوسط البطاني الكلاسيكي الكاملة.
Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (PCR في الوقت الحقيقي)أجيلينت600828
قطب عصا الطعامميليبورMERSSTX01تم إيقاف إنتاج هذا المنتج.
وسط بطانة البطانة الكلاسيكي الكامل (وسط iHCPEnC)أنظمة الخلايا4ZO-500مجموعة تحتوي على وسط، ومكملات وعامل التثبيت للطلاء.
DMEM/F-12 (1:1) مع الفينولريد (متوسط HIBCPP بنسبة 10٪)ثيرمو فيشر31330-038
DMEM/F-12 (1:1) بدون فينولريد (1٪ HIBCPP متوسط)ثيرمو فيشر11039-021
مصل العجل الجنيني (FCS) (متوسط HIBCPP بنسبة 1٪ و10٪)ثيرمو فيشر10270-106
الأنسولين (متوسط HIBCPP بنسبة 1٪ و10٪)سيغماI9278
ليبوبوليسكاريد (LPS)سيغماL3024
ميلي سيل ERS2 ميليبورMERS00002تم إيقاف إنتاج هذا المنتج.
النانو دروب (مقياس الطيف الضوئي)ثيرمو ساينتفيكND1000تم إيقاف إنتاج هذا المنتج.
حديد المثقوب رقم 11Wü رث880223211
PBSلايف تكنولوجيز  14190169
أداة تصميم البرايمرNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primers سيغماVC00021
Qiagen RNeasy microتشياغن74004
RLT+b-ME (جزء من مجموعة Qiagen Rneasy micro)تشياغن74004
قارورة زراعة الخلايا T25سارستيدت إيه جي & القائد83,39,10,002
قارورة زراعة الخلايا T75سارستيدت إيه جي & القائد83,39,11,002
تراكيتش PET 3.0 سي سي (غشاء منفصل)سابيوSK4580
ضوء الأشعة فوق البنفسجيةكارل روثH469.1

المراجع

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiol Rev. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Schwerk, C., Schroten, H. In vitro models of the choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier: advances, applications, and perspectives. Hum Cell. 37 (5), 1235-1242 (2024).
  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
  4. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  5. Carloni, S., Rescigno, M. Unveiling the gut-brain axis:structural and functional analogies between the gut and the choroid plexus vascular and immune barriers. Semin Immunopathol. 44 (6), 869-882 (2022).
  6. Denzer, L., et al. Transcriptome and functional comparison of primary and immortalized endothelial cells of the human choroid plexus at the blood-cerebrospinal fluid barrier. Int J Mol Sci. 26 (4), 1779(2025).
  7. Muranyi, W., et al. Immortalized human choroid plexus endothelial cells enable an advanced endothelial-epithelial two-cell type in vitro model of the choroid plexus. iScience. 25 (6), 104383(2022).
  8. Herold, R., et al. Protocol for the setup and use of a human choroid plexus endothelial-epithelial two-cell-type in vitro model. STAR Protoc. 3 (4), 101816(2022).
  9. Dinner, S., et al. A choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side. J Vis Exp. (111), e54061(2016).
  10. Herold, R., et al. Capsule-dependent impact of MAPK signalling on host cell invasion and immune response during infection of the choroid plexus epithelium by Neisseria meningitidis. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 53(2021).
  11. Bernd, A., et al. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plexus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. 32 (9), 2973-2982 (2015).
  12. Dabbagh, F., Schroten, H., Schwerk, C. In vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier and their applications in the development and research of (neuro)pharmaceuticals. Pharmaceutics. 14 (8), 1729(2022).
  13. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nat Rev Neurosci. 16 (8), 445-457 (2015).
  14. Zhang, W. Y., Liu, Y., Zhang, H. Extracellular matrix: an important regulator of cell functions and skeletal muscle development. Cell Biosci. 11 (1), 65(2021).
  15. Clark, A. J., et al. Functional imaging in microfluidic chambers reveals sensory neuron sensitivity is differentially regulated between neuronal regions. Pain. 159 (7), 1413-1425 (2018).
  16. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  17. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: from descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), eaal2379(2017).
  18. Furtado, A., et al. Circadian rhythmicity of amyloid-beta-related molecules is disrupted in the choroid plexus of a female Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci Res. 101 (4), 524-540 (2023).
  19. Borkowski, J. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving IκBζ in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  20. Wiatr, M., et al. Distinct migratory pattern of naive and effector T cells through the blood-CSF barrier following Echovirus 30 infection. J Neuroinflammation. 16 (1), 232(2019).
  21. Speidel, A., et al. Transmigration of Trypanosoma brucei across an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier. iScience. 25 (4), 104014(2022).
  22. Haas, J., et al. The choroid plexus is permissive for a preactivated antigen-experienced memory B-cell subset in multiple sclerosis. Front Immunol. 11, 618544(2020).
  23. Nishihara, H., et al. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 3(2020).
  24. Erb, U., Schwerk, C., Schroten, H., Karremann, M. Review of functional in vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier in leukaemia research. J Neurosci Methods. 329, 108478(2020).
  25. Ho, K. H., et al. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 27 (1), 106-122 (2025).
  26. Wagenaars, F., et al. Characterization of thyroid hormone transport in a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) as an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier model. Mol Cell Endocrinol. 597, 112449(2025).
  27. Di Tommaso, N., Santopaolo, F., Gasbarrini, A., Ponziani, F. R. The gut-vascular barrier as a new protagonist in intestinal and extraintestinal diseases. Int J Mol Sci. 24 (2), 1470(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

بطانة الضفيرة المشيمائيةخلايا HIBCPPخلايا بطانية مخلدةوظيفة الحاجزنموذج مختبريتحليل التعبير الجينيالمعالجة بليبوبوليسكاريد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.