A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
يخفف هيدروكسيل القرطم الأصفر أ (HSYA) من هشاشة العظام في الركبة عن طريق تعزيز الالتهام الذاتي للخلايا الغضروفية وتكاثرها مع قمع موت الخلايا المبرمج والالتهابات عن طريق تثبيط مسار HIF-1α / BNIP3.
يرتبط الحد من الالتهام الذاتي في أنسجة الغضروف ارتباطا وثيقا بتطور هشاشة العظام في الركبة (KOA) ، ومع ذلك فإن الآليات التي يمارس بها Hydroxyl safflower yellow A (HSYA) تأثيرات وقائية لا تزال غير مفهومة تماما. في هذه الدراسة ، تم عزل الخلايا الغضروفية البشرية KOA وتخصيصها لمجموعات علاجية مختلفة ، بما في ذلك التحكم الطبيعي ، والنموذج الفارغ ، و HSYA ، ومثبط العامل المحفز لنقص الأكسجة -1α (HIF-1α) ، ومحفز الالتهام الذاتي ، و HSYA جنبا إلى جنب مع مثبط HIF-1α ، و HSYA جنبا إلى جنب مع محفز الالتهام الذاتي. تم قياس السيتوكينات المسببة للالتهابات (IL-1β ، TNF-α ، IL-6) بواسطة ELISA ، وتم فحص التعبير البروتيني ل HIF-1α و BNIP3 والعلامات المتعلقة بالالتهام الذاتي بواسطة النشاف الغربي ، وتم تقييم الحويصلات الذاتية في الميتوكوندريا باستخدام تلطيخ monodansylcadaverine والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. بالمقارنة مع العنصر الضابط العادي ، أظهرت مجموعة النماذج الفارغة زيادة ملحوظة في مستويات IL-1β و TNF-α و IL-6 و HIF-1α ، مصحوبة بارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج ، وانخفاض التكاثر ، وتقليل تنظيم البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي (P < 0.05). أدى العلاج ب HSYA أو مثبط HIF-1α أو محفز الالتهام الذاتي إلى تنظيم تعبير البروتين المرتبط بالالتهام الذاتي بشكل كبير وتقليل مستويات السيتوكين الالتهابية. علاوة على ذلك ، أنتج HSYA جنبا إلى جنب مع مثبط HIF-1α أو محفز الالتهام الذاتي التأثيرات الأكثر وضوحا ، مع انخفاض ملحوظ في إطلاق السيتوكين وموت الخلايا المبرمج ، جنبا إلى جنب مع تعزيز تكاثر الخلايا الغضروفية وتكوين الحويصلة الذاتية للميتوكوندريا (P < 0.05). توضح هذه النتائج أن HSYA يمارس تأثيرات وقائية غضروفية في KOA ، على الأقل جزئيا ، من خلال تثبيط مسار HIF-1α / BNIP3 ، وبالتالي تعزيز الالتهام الذاتي وتخفيف الإصابة الالتهابية في الخلايا الغضروفية.
كحالة عظام مزمنة منتشرة ، يؤثر هشاشة العظام في الركبة (KOA) على الأفراد في منتصف العمر وكبار السن ، مما يؤثر بشكل كبير على نوعية حياتهم1،2. على الرغم من حدوثه على نطاق واسع ، إلا أن المسببات الدقيقة والآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء KOA لا تزال غير مفهومة تماما. علاوة على ذلك ، لكل من العلاج الوقائي والعلاجي ، يؤكد الحاجة الملحة لكشف الأسس المرضية المعقدة لهذه الحالة. أحد مجالات الاهتمام الناشئة هو دور الالتهام الذاتي في توازن الغضروف ، مع تراكم الأدلة التي تشير إلى أن انخفاض الالتهام الذاتي داخل أنسجة الغضروف يساهم في تنكسها في KOA3،4.
الالتهام الذاتي ، وهي عملية تحلل خلوي حيوية للحفاظ على التوازن الخلوي ، لها أهمية كبيرة في صيانة الغضروف وإصلاحه. في البيئة المكروية لنقص التأكسج السائدة داخل الغضروف المفصلي ، يظهر مسار إشارات البروتين المتفاعل للبروتين 3 (BNIP3) العامل المحفز لنقص الأكسجة 1α (HIF-1α) / الفيروس الغدي E1B 19 kDa كمنظم محوري للالتهام الذاتي. لوحظ ارتفاع تعبير HIF-1α في مرضى KOA ، مما يشير إلى أن عدم تنظيم هذا المسار قد يساهم في ضعف الالتهام الذاتي وتنكس الغضروف اللاحق5،6،7.
الوخز بالإبر ، والكي ، والأعشاب ، والتدليك هي أربع طرق كلاسيكية للطب الصيني التقليدي لعلاج التهاب المفاصل في الركبة. ثبت أن العلاجات الحالية ، مثل الأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات ، وحقن حمض الهيالورونيك ، وتقويم المفاصل ، مفيدة ولكنها مرتبطة أيضا ببعض الآثار الجانبية8. علاوة على ذلك ، لا يوجد علاج روتيني موصى به لهشاشة العظام في الركبة. بمرور الوقت ، كعلاج تكميلي شائع ل KOA ، طور الطب الصيني التقليدي (TCM) العديد من العلاجات العشبية التي تبشر بالخير في علاج KOA9. من بين هؤلاء ، حظي القرطم الأصفر هيدروكسيل أ باهتمام كبير بسبب خصائصه المضادة للالتهابات والتعديل الذاتي10،11. ومع ذلك ، فإن الآليات الدقيقة التي تمارس بها HSYA تأثيرها العلاجي على هشاشة العظام في الركبة (KOA) ، لا سيما فيما يتعلق بتنظيم الالتهام الذاتي من خلال مسار HIF-1α / BNIP3 ، لا تزال غير مؤكدة. لذلك ، نقوم بالتحقيق في آلية التأثيرات العلاجية ل HSYA في KOA من خلال التركيز على تأثيرها على الالتهام الذاتي للخلايا الغضروفية وتفاعلها مع مسار HIF-1α / BNIP3. نفترض أن HSYA يخفف من هشاشة العظام في الركبة عن طريق تعزيز الالتهام الذاتي للخلايا الغضروفية وتكاثرها مع قمع موت الخلايا المبرمج والالتهابات عن طريق تثبيط مسار HIF-1α / BNIP3.
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات بشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى Zhanjiang المركزي للشعب (رقم الموافقة. KY-YS-2021-09). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المشاركين قبل جمع العينات. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.
1. المرضى وتصميم الدراسة
تم تجنيد ثلاثين مريضا تم تشخيص إصابتهم بهشاشة العظام في الركبة (KOA) وخضعوا لعملية تقويم مفصل الركبة الكامل. تضمنت المجموعة 14 ذكرا و 16 أنثى ، تتراوح أعمارهم بين 52-75 عاما (متوسط ± SD: 64.3 ± 12.6 سنة) ، وجميعهم يستوفون معايير KOA للكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم12. تم استبعاد المرضى إذا تلقوا أدوية غير ستيرويدية مضادة للالتهابات أو منشطات في غضون أسبوعين قبل الجراحة أو الحقن داخل المفصل في غضون شهر واحد.
2. ثقافة الخلايا الغضروفية الأولية
تم جمع الغضروف المفصلي في ظروف معقمة مباشرة بعد الجراحة ووضعه في برنامج تلفزيوني بارد. باستخدام مشارط معقمة ، تم تقطيع الغضروف إلى شظايا ~ 1 مم مكعب على صفيحة زجاجية مثلجة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من 0.25٪ من التربسين EDTA. تم تحضين الأنبوب في حمام مائي اهتزاز 37 درجة مئوية عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة وقلبه برفق كل 5 دقائق لتسهيل عملية الهضم. تم شفط المادة الطافية ، وتم غسل حبيبات الأنسجة مرة واحدة باستخدام PBS وطرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. ثم تم تعليق الحبيبات في 10 مل من 0.02٪ من الكولاجيناز من النوع الثاني وهضمها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع الاهتزاز. تم سحب المعلق لأعلى ولأسفل كل 30 دقيقة لتعزيز التفكك ، وتمريره عبر مصفاة 70 ميكرومتر ، ويتم طرده بالطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. تم تعليق الحبيبات الناتجة في DMEM مع استكمال 10٪ FBS و 100 U / mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين وزرعها في قوارير T25. تم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، وتم استبدال الوسط كل 2-3 أيام ، وتم استخدام الخلايا من الممرات 1-2 للتجارب. تضمنت المجموعات التجريبية التحكم العادي ، والنموذج الفارغ ، و HSYA (100 ميكرولتر / لتر) ، ومثبط HIF-1α YC-1 (10 ميكرولتر / لتر) ، والرابامايسين (10 نانومول / لتر) ، و HSYA + YC-1 ، و HSYA + rapamycin.
3. HIF-lα بوساطة siRNA، BNIP3 ضربة قاضية
تم زرع الخلايا الغضروفية الأولية في صفائح من 6 آبار عند 2-5 × 105 خلايا / بئر وزرعتها عند 37 درجة مئوية حتى وصلت إلى 30٪ -50٪ التقاء لكل بئر ، تم تخفيف 5 ميكرولتر من 20 ميكرومتر siRNA في 250 ميكرولتر من Opti-MEM ، وتم تخفيف 5 ميكرولتر من كاشف تعداء الدهون بشكل منفصل في 250 ميكرولتر من Opti-MEM. تم خلط المحلولين برفق واحتضانهما في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة لتشكيل مجمعات. تم استبدال وسط الاستزراع ب 1.5 مل من DMEM الطازج مع 10٪ FBS ، وتمت إضافة مركب siRNA-lipid (500 ميكرولتر) بالتنقيط على طول جدار البئر مع دوامة لطيفة. تم تحضين الخلايا لمدة 6 ساعات ، وتم استبدال الوسط بوسط كامل ، واستمرت الثقافة لمدة 48-72 ساعة. تم التحقق من كفاءة الضربة القاضية بواسطة qRT-PCR واللطخة الغربية قبل مزيد من العلاجات.
4. إليسا
تم جمع المواد الطافية لزراعة الخلايا ، وطردها بالطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخفيفها 1: 2 في مخزن مؤقت للمقايسة عند الضرورة. تم استخدام مجموعات ELISA ل IL-1β و TNF-α و IL-6 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تشغيل المعايير والفراغات والعينات في ثلاث نسخ. بعد تفاعل الركيزة ، تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة في غضون 15 دقيقة.
5. اختبار MTT
تم زرع الخلايا الغضروفية في صفيحة 96 بئرا عند 5,000 خلية / بئر في 100 ميكرولتر من الوسط الكامل واحتضانها لمدة 0 ساعة أو 24 ساعة أو 48 ساعة أو 72 ساعة. في كل نقطة زمنية ، تمت إضافة 20 ميكرولتر من محلول MTT (5 مجم / مل في PBS) مباشرة إلى كل بئر ، وتم تحضين الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى أصبحت بلورات الفورمازان الأرجواني مرئية في قاع الآبار. تم شفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج البلورات ، وتمت إضافة 150 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر ، وتم وضع الألواح على شاكر عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق لإذابة البلورات تماما. تم قياس الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام قارئ ميكروفيكل. تم اختيار وقت الحضانة القصير لتجنب تشبع الإشارة في الخلايا شديدة النشاط.
6. قياس التدفق الخلوي
تم حصاد الخلايا عن طريق التربسين ، وطردها بالطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. تم تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط عند ~ 1 × 106 خلايا / مل ، و 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و 5 ميكرولتر PI. بعد الخلط اللطيف ، تم تحضين الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم تحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي ، مع جمع ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة (الإثارة 488 نانومتر ، الانبعاث FITC 530/30 نانومتر ، PI > 600 نانومتر). تم قياس الخلايا المبرمج باستخدام البرامج القياسية.
7. النشاف الغربي
تم شطف الخلايا مرتين باستخدام PBS البارد وتحللها في 200 ميكرولتر من RIPA buffer يحتوي على مثبطات البروتياز على الثلج لمدة 30 دقيقة. تم كشط الخلايا باستخدام مكشطة بلاستيكية ، وتم رصها لأعلى ولأسفل لتقليل اللزوجة ، وطردها بالطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم جمع المواد الطافية ، وتم قياس تركيزات البروتين باستخدام مقايسة BCA. تم خلط كميات متساوية من البروتين (30 ميكروغرام) مع 5× محلول تحميل ، وتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وفصلها على 10٪ -12٪ من المواد الهلامية SDS-PAGE. تم تشغيل الرحلان الكهربائي عند 80 فولت للتكديس و 120 فولت للفصل ، وتم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF عند 300 مللي أمبير لمدة 90 دقيقة. تم حظر الأغشية في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية (1: 1،000). بعد ثلاث غسلات باستخدام TBST ، تم تحضين الأغشية بأجسام مضادة ثانوية مترافقة ب HRP (1: 5,000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور نطاقات البروتين باستخدام ركيزة ECL وتصويرها باستخدام نظام الكشف عن التلألؤ الكيميائي مع تعرض 30-120 ثانية. تم قياس شدة النطاق باستخدام ImageJ ، وتم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل.
8. تلطيخ Monodansylcadaverine (MDC)
تم تحضير محلول عمل MDC 50 ميكرومتر من محلول المخزون مباشرة قبل الاستخدام. تم تثبيت الخلايا ب 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وغسلها مرتين باستخدام PBS ، واحتضانها بمحلول عمل MDC 500 ميكرولتر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. بعد غسلتين باستخدام PBS ، تم تركيب الأغطية بوسط تركيب مضاد للبهتان وتمت ملاحظتها تحت مجهر مضان (إثارة 355 نانومتر ، انبعاث 512 نانومتر).
9. المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)
تم حصاد الخلايا وتكويرها بالطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم تثبيتها في 2٪ جلوتارالديهايد عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تم غسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها وبعد تثبيتها في 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية في غطاء الدخان. تم إجراء الجفاف من خلال سلسلة أسيتون متدرجة من 30٪ و 50٪ و 70٪ و 90٪ و 100٪ لمدة 10 دقائق لكل منها. تم تسلل العينات براتنجات الأسيتون / الإيبوكسي 1: 1 لمدة ساعة واحدة ثم بالراتنج النقي بين عشية وضحاها. تم إجراء التضمين في راتنج طازج وبلمرة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تم قطع المقاطع فائقة النحافة من 50-70 نانومتر باستخدام ميكروتوم فائق الميكروتوم ، مثبتة على شبكات نحاسية من 200 شبكة ، ملطخة بخلات 2٪ من أسيتات اليورانيل لمدة 30 دقيقة متبوعة بسترات الرصاص لمدة 15 دقيقة ، وغسلها بالماء المقطر ، وتجفيفها بالهواء ، وفحصها تحت مجهر إلكتروني ناقل الحركة عند 80 كيلو فولت. كملاحظة أمان ، فإن الجلوتارالديهايد ورباعي أكسيد الأوزميوم سامان ومتطايران ويجب التعامل معهما فقط في غطاء دخان مع قفازات ونظارات واقية. يجب التخلص من النفايات في حاويات خطرة مخصصة وفقا لبروتوكولات السلامة المؤسسية.
10. التحليل الإحصائي
تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD. تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار LSD اللاحق ، مع اعتبار P < 0.05 معنوية.
تأثير HSYA على تعبير السيتوكينات المؤيدة للالتهابات الغضروفية (IL-1β ، TNF-α ، IL-6)
بالمقارنة مع المجموعة الضابطة العادية ، أظهرت جميع المجموعات الأخرى مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات (IL-1β و TNF-α و IL-6) (ص < 0.05 ، الجدول 1 ، الشكل 1A-G). أدى العلاج باستخدام HSYA ، أو مثبط HIF-1α ، أو محفز الالتهام الذاتي ، أو مثبط HSYA + HIF-1α ، أو HSYA + محفز الالتهام الذاتي إلى تقليل مستويات السيتوكين بشكل كبير بالنسبة لمجموعة النماذج الفارغة (P < 0.05). من بين هذه العلاجات ، أدت العلاجات المدمجة (مثبط HSYA + HIF-1α أو HSYA + محفز الالتهام الذاتي) إلى تقليل تعبير السيتوكين ، مع انخفاض بنسبة 35٪ -40٪ تقريبا مقارنة بمجموعة النموذج (P < 0.05). في تجارب التداخل الجيني (الشكل 1H-J) ، أدت ضربة قاضية siRNA ل HIF-1α أو BNIP3 إلى تخفيضات ~ 25٪ -30٪ في مستويات السيتوكين مقارنة بالنموذج + المجموعة الفارغة. عزز علاج HSYA هذه التأثيرات. على وجه التحديد ، كانت مستويات السيتوكين في مجموعة siHIF-1α + HSYA أقل بنسبة ~ 20٪ مما كانت عليه في مجموعة siHIF-1α + الفارغة ، وكانت المستويات في مجموعة siBNIP3 + HSYA أقل ~ 22٪ مما كانت عليه في المجموعة الفارغة siBNIP3 + (P < 0.05).
تأثير HSYA على تكاثر الخلايا الغضروفية
أظهرت المجموعة الضابطة العادية نشاط انتشار خط الأساس ، بينما أظهرت مجموعة النماذج الفارغة انخفاضا كبيرا (ص < 0.05 ، الشكل 2 أ). تمت استعادة التكاثر جزئيا بعد العلاج ب HSYA أو مثبط HIF-1α أو محفز الالتهام الذاتي ، وتم تعزيزه بشكل ملحوظ بواسطة مثبط HSYA + HIF-1α أو علاجات HSYA + محفز الالتهام الذاتي (P < 0.05). في تجارب siRNA (الشكل 2 ب) ، عززت ضربة قاضية ل HIF-1α أو BNIP3 الانتشار بنسبة ~ 25٪ مقارنة بمجموعة التحكم النموذجية. عزز علاج HSYA الانتشار بشكل أكبر ، مما أدى إلى انتشار أعلى ~ 40٪ مقارنة بمجموعة النماذج (P < 0.05).
تأثير HSYA على موت الخلايا المبرمج والتعبير عن البروتين المرتبط بالالتهام الذاتي في الخلايا الغضروفية
كشف تحليل اللطخة الغربية عن اختلافات ذات دلالة إحصائية في التعبير عن البروتين بين المجموعات (الجدول 2). أظهرت مجموعة النماذج الفارغة تنظيما ملحوظا ل HIF-1α وانخفاض التعبير عن LC3 و P62 و Beclin1 و BNIP3 مقارنة بالضوابط (ص < 0.05). أدى العلاج باستخدام HSYA أو مثبط HIF-1α أو محفز الالتهام الذاتي إلى زيادة تعبير LC3 و P62 و Beclin1 و BNIP3 وانخفاض مستويات HIF-1α (P < 0.05). أنتجت العلاجات المدمجة مع مثبط HSYA + HIF-1α أو HSYA + محفز الالتهام الذاتي أكبر التغييرات ، حيث تضاعفت مستويات LC3 و Beclin1 تقريبا مقارنة بمجموعة النماذج الفارغة. على الرغم من أن P62 ينخفض عادة عند تنشيط الالتهام الذاتي ، إلا أن مستوياته تزداد هنا بعد علاج HSYA. قد يشير هذا إلى تراكم معزز للبلعمة الذاتية أو التدفق غير المكتمل ، وهي ظاهرة تم الإبلاغ عنها أيضا في الدراسات السابقة للالتهام الذاتي للخلايا الغضروفية.
تأثير HSYA على معدلات موت الخلايا المبرمج في الخلايا الغضروفية
أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن مجموعة النماذج الفارغة أظهرت معدل موت الخلايا المبرمج أعلى بكثير من المجموعة الضابطة العادية (P < 0.05 ، الشكل 3 أ ، ب). قلل كل من HSYA و HIF-1α ومحفز الالتهام الذاتي من موت الخلايا المبرمج ، في حين أن العلاجات المدمجة (مثبط HSYA + HIF-1α أو HSYA + محفز الالتهام الذاتي) أنتجت أقل معدلات موت الخلايا المبرمج ، مع تخفيضات ~ 45٪ -50٪ مقارنة بمجموعة النماذج الفارغة (P < 0.05). في تجارب siRNA ، انخفض موت الخلايا المبرمج أيضا عن طريق ضربة قاضية ل HIF-1α أو BNIP3 ، وتم تقليله بشكل أكبر عن طريق علاج HSYA.
تأثير HSYA على معدلات موت الخلايا المبرمج وتكوين الحويصلة الذاتية في الخلايا الغضروفية
كشف تلطيخ MDC وتصوير TEM عن اختلافات واضحة في تكوين الحويصلة الذاتية عبر المجموعات (الشكل 4A-D). أظهرت مجموعة النماذج الفارغة توزيعا متناثرا للحويصلات ، في حين أن HSYA أو مثبط HIF-1α أو علاجات محفز الالتهام الذاتي زادت من أعداد الحويصلات. أنتجت العلاجات المدمجة (مثبط HSYA + HIF-1α أو HSYA + محفز الالتهام الذاتي) التحسين الأكثر وضوحا ، مع ما يقرب من ضعفين حويصلات لوحظت بواسطة TEM مقارنة بمجموعة النموذج. تمشيا مع هذه النتائج ، كانت معدلات موت الخلايا المبرمج المقاسة بقياس التدفق الخلوي (الشكل 5A-E) أقل في مجموعات العلاج المدمجة.
توافر البيانات:
يتم توفير جميع البيانات التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة في الملف التكميلي 1.
الشكل 1: التعبير عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات الغضروفية (IL-1β ، TNF-α ، IL-6) في كل مجموعة (ن = 3). (أ-ز) تم الكشف عن مستويات التعبير عن البروتين ل IL-1β و TNF-α و IL-6 بواسطة النشاف الغربي (WB). (ه-ج) تم قياس محتويات IL-1β و TNF-α و IL-6 عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) (P < 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة بين نشاط تكاثر الخلايا الغضروفية في كل مجموعة (ن = 3). (أ) المجموعات المعالجة ، و (ب) مجموعات ضربة قاضية HIF-1α و BNIP3 ، P< 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة بين معدل موت الخلايا المبرمج لكل مجموعة (ن = 3). (أ) 1 ، المجموعة العادية ؛ 2 ، مجموعة نموذج. 3 ، مجموعة HSYA. 4 ، مجموعة مثبطات HIF-1α ؛ 5 ، مجموعة الالتهام الذاتي. 6 ، مجموعة مثبطات HSYA + HIF-1α ؛ 7 ، HSYA + مجموعة محفز الالتهام الذاتي. (ب) مجموعات ضربة قاضية للجين HIF-1α و BNIP3. مقارنة بالمجموعة الضابطة العادية ، * P < 0.05. مقارنة بمجموعة النماذج الفارغة ، #P< 0.05. مقارنة بمجموعة مثبطات HSYA + HIF-1α ، &P< 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصوير TEM لتكوين الحويصلة الذاتية في الميتوكوندريا. (أ) نموذج فارغ. (ب) مجموعة HSYA. (ج) مجموعة مثبطات HIF-1α. (د) مجموعة محفز الالتهام الذاتي. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تأثير HSYA على معدلات موت الخلايا المبرمج في كل مجموعة (ن = 3). (أ) نموذج فارغ. (ب) مجموعة HSYA. (ج) مجموعة مثبطات HIF-1α. (د) مجموعة محفز الالتهام الذاتي. (ه) التحليل الكلي لكل مجموعة ، مقارنة بالمجموعة الضابطة العادية ، ** P< 0.01. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المجموعات | IL-1β (نانوغرام/لتر) | IL-6 (ميكروغرام / لتر) | TNF-α (نانوغرام / لتر) |
| التحكم العادي | 17.84±1.52 | 28.43±2.17 | 23.71±2.62 |
| نموذج فارغ | 93.84±8.62* | 324.82±30.81* | 141.61±12.51* |
| إتش إس إيه | 51.47±4.21*# | 173.61±15.25*# | 82.19±7.52 *# |
| مثبط HIF-1α | 53.87±4.02*# | 180.25±17.63*# | 79.03±7.11*# |
| محفز الالتهام الذاتي | 49.37±4.21*# | 175.92±17.61*# | 80.46±7.64*# |
| مثبط HSYA + HIF-1α | 29.62±2.41*#& | 37.62±3.51 *#& | 34.81±3.11*#& |
| HSYA + محفز الالتهام الذاتي | 30.83±2.87*#& | 36.73±3.15*#& | 32.72±3.2 *#& |
الجدول 1: مقارنة مستويات السيتوكين المؤيدة للالتهابات في كل مجموعة. مقارنة بالمجموعة الضابطة العادية ، * P < 0.05. مقارنة بمجموعة النماذج الفارغة ، #P< 0.05. مقارنة بالمجموعات التي عولجت ب HASY ، مثبط HIF-1α ، ومحفز الالتهام الذاتي ، &P< 0.05.
| المجموعات | LC3 | ص 62 | بيكلين 1 | HIF-1α | بي اين آي بي 3 |
| التحكم العادي | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| نموذج فارغ | 0.65±0.23* | 0.71±0.32* | 0.68±0.26* | 1.25±0.37* | 0.73±0.34* |
| إتش إس إيه | 1.19±0.28* | 1.23±0.41* | 1.18±0.26* | 0.81±0.30* | 1.27±0.44* |
| مثبط HIF-1α | 1.20±0.25* | 1.21±0.37* | 1.22±0.27* | 0.79±0.26* | 1.25±0.39* |
| محفز الالتهام الذاتي | 1.17±0.22* | 1.24±0.36* | 1.20±0.28* | 1.03±0.16 | 1.07±0.14 |
| مثبط HSYA + HIF-1α | 1.30±0.32*# | 1.34±0.43*# | 1.29±0.33*# | 0.63±0.22*# | 1.44±0.47*# |
| HSYA + محفز الالتهام الذاتي | 1.32±0.33*# | 1.33±0.41*# | 1.32±0.35*# | 0.65±0.21*# | 1.47±0.48*# |
الجدول 2: مقارنة البروتينات في المجموعات المختلفة. مقارنة بالمجموعة الضابطة العادية ، * P< 0.05. مقارنة بالمجموعات التي عولجت ب HSYA ، مثبط HIF-1α ، ومحفز الالتهام الذاتي ، #P< 0.05.
الملف التكميلي 1: البيانات الأولية التي تم إنشاؤها أثناء الدراسة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
يخفف هيدروكسيل القرطم الأصفر أ (HSYA) من هشاشة العظام في الركبة عن طريق تعزيز الالتهام الذاتي للخلايا الغضروفية وتكاثرها مع قمع موت الخلايا المبرمج والالتهابات عن طريق تثبيط مسار HIF-1α / BNIP3.
تم دعم هذا العمل من قبل مكتب الطب الصيني التقليدي في مقاطعة قوانغدونغ
(المنحة رقم 20221446).
| 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم | علوم المجهر الإلكتروني | 19150 | المزيد من الإصلاحات والتلوين عينات لتحليل TEM |
| 2٪ جلوتارالديهايد | سيغما-ألدرتش | G5882 | يثبت الخلايا لتحضير عينات TEM |
| 4٪ بارافورمالديهيد | سيرفيسبيو | G1101 | يصلح الخلايا لتلوين MDC وتحضير عينات TEM |
| AG1478 | شركة سيليك | S1005 | حقن وريدي 20 ملغ/كغ، مثبط كيناز مستقبلات ErbB في نموذج الفئران |
| مجموعة كشف الاستماتة Annexin V-FITC/PI | المستنقع الحيوي | BS3030 | تصبغ الخلايا المأومة للكشف عن تدفق الخلايا الخلوية |
| محفز الالتهام الذاتي (RAPA) | شركة سيغما | R0395 | راباميسين، محفز الالتهام الذاتي، استخدم عند 10 نانومول/لتر في تجارب الخلايا الغضروفية |
| الأجسام المضادة بيكلين1 | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-48341 | الجسم المضاد الأساسي للكشف عن البروتين المرتبط بالالالتهام الذاتي بيكلين1 |
| الأجسام المضادة BNIP3 | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-517348 | الجسم المضاد الأساسي للكشف عن النقطة الغربية ل BNIP3 |
| حاضنة ثاني أكسيد الكربون | ييهنغ | BPN-150CW | لزراعة الخلايا |
| كبريتات ثنائي الميثيل (DMSO) | سيغما-ألدرتش | D2650 | يذيب بلورات الفورمازان في اختبار MTT |
| DMEM | بيوتايم | C0001 | وسط زراعة الخلايا، مدعوم ب 10٪ FBS لزراعة الخلايا الغضروفية |
| قارئ الميكروبليت ELISA | ثيرمو فيشر العلمي | نادي مولتيسكان لكرة القدم | يقيس قيم OD في اختبارات ELISA وMTT |
| كاشف التوألؤ الكيميائي المعزز (ECL) | ثيرمو فيشر العلمي | 32106 | يتصور أحزمة البروتين في ويسترن بلوت |
| راتنج الإيبوكسي (EPON812) | علوم المجهر الإلكتروني | 14120 | تضمين عينات لتقسيم TEM |
| FBS | بيوتايم | C0205 | مصل البقر الجنيني يضاف إلى DMEM لتغذية الخلايا الغضروفية |
| مقياس التدفق الخلوي | بيكمان (ذكر بسبب الاستماتة المبرمجة) | سايتو فليكس إس | يكتشف معدل موت الخلايا الغضروفية والعلامات الخلوية |
| المجهر الفلوري | أوليمبوس | IX73 | يراقب الحويصلات الذاتية الملونة ب MDC |
| نظام تصوير الجل | بيو-راد | ChemiDoc XRS+ | يلتقط ويقيس أشرطة البروتين من ويسترن بلوت |
| HIF-1α جسم | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-13515 | الجسم المضاد الأساسي للكشف عن البلوت الغربي ل HIF-1&alpha؛ |
| HIF-1α مثبط (YC-1) | شركة سيليك | S1047 | HIF-1α مثبط المسارات، يستخدم عند 10 وميكرو؛ mol/L في تجارب الخلايا |
| الطرد المركزي المبرد عالي السرعة | إبندورف | 5430R | يستخدم لفصل المكونات |
| الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ب HRP | جاكسون إيمينوريسيرش | 115-035-003 | يربط الأجسام المضادة الأولية لتضخيم الإشارة في ويسترن بلوت |
| IL-1 & بيتا؛ مجموعة إليسا | بيولوجيا شينغغونغ | C5236 | يقيس IL-1 وبيتا؛ مستويات في الكائنات الفائقة الخلوية عبر ELISA |
| مجموعة IL-6 إليسا | بيولوجيا شينغغونغ | C5237 | يقوم بقياس مستويات IL-6 في الكائنات الفائقة الخلوية عبر ELISA |
| الجسم المضاد LC3 | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-398822 | الجسم المضاد الأساسي للكشف عن البروتين المرتبط بالالتهام الذاتي LC3 |
| كاشف ليبوفكتامين 3000 | ثيرمو فيشر العلمي | L3000001 | كاشف النقل القائم على الدهون للتانسفيكشن |
| مونودانسيلكادافيرين (MDC) | سيغما-ألدرتش | D4008 | 0.05 مول/لتر، تصبغ الحويصلات الذاتية للمجهر الفلوري |
| واكل MTT | بيوتايم | C0009 | 0.5 ملغ/مل، يستخدم في اختبار MTT لتقييم تكاثر الخلايا الغضروفية |
| نانو دروب 2000 | ثيرمو فيشر العلمي | ND-1000 | تحديد تركيز الحمض النووي الريبي |
| مجموعة إليسا NRG1 | أبكام (المملكة المتحدة) | AB213961 | يقيس تركيز NRG1 في أنسجة القلب عبر ELISA |
| الجسم المضاد P62 | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-28359 | الجسم المضاد الأساسي لاكتشاف البروتين المرتبط بالالتهام الذاتي P62 |
| الأجسام المضادة ErbB4 المفسفرة (p-ErbB4) | تقارب | AF3445 | الجسم المضاد الأساسي للكشف عن البلوت الغربي لفيروس ErbB4 المنشط |
| مجموعة كاشف RT برايم سكريبت | تاكارا | RR047A | النسخ العكسي من خلال الحمض النووي الريبي لتوفير قوالب لتجربة qPCR |
| نظام PCR الكمي في الوقت الحقيقي | بيو-راد | CFX96 | لاكتشاف RT-PCR |
| NRG1 البشري المؤتلف (rh-NRG1) | R& دي سيستمز | 396-HB | حقن وريدي بقوة 5 ملغ/كغ لتفعيل مسار NRG1/ErbB4 في نموذج الفئران |
| مخزن RIPA | ميلونبيو | MA0151 | محلول التحلل مع مثبطات البروتياز/الفوسفاتاز لاستخلاص البروتين |
| زهرة السفلور الأصفر A (HSYA) | شركة تشنغدو مانسيت للتكنولوجيا الحيوية المحدودة. | ضروري-160601 | المكون النشط بيولوجيا من Carthamus tinctorius L.، المستخدم عند 100 ومتر وميكرو؛ mol/L لعلاج الخلايا الغضروفية |
| معدات SDS-PAGE | بيو-راد | تيترا ميني-بروتيان | يفصل البروتينات حسب الوزن الجزيئي في ويسترن بلوت |
| TB Green Premix Ex Taq II | تاكارا | RR820A | لتجربة qPCR |
| TNF-&; مجموعة إليسا | بيولوجيا شينغغونغ | C5238 | يحدد TNF-&; مستويات في الكائنات الفائقة الخلوية عبر ELISA |
| إجمالي الأجسام المضادة ErbB4 | بروتين تك | 19943-1-AP | الجسم المضاد الأساسي للكشف عن البلطات الغربية لإجمالي ErbB4 |
| المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) | هيتاشي (مذكور للحويصلات الاللعمية الذاتية) | H-7650 | يراقب الحويصلات اللعمة الذاتية في الميتوكوندريا على المستوى فوق البنيوي |
| واشاف تريزول | ثيرمو فيشر العلمي | 15596026 | لاستخراج الحمض النووي الريبي |
| تريبسين-إيدتا | جيبكو (ثيرمو فيشر) | 25200056 | يستخدم للهضم الإنزيمي للغضروف المفصلی لعزل الخلايا الغضروفية |
| كولاجناز النوع الثاني (0.02٪) | وورثينغتون بيوكيميكال | CLS-2 | يهضم أنسجة الغضروف لعزل الخلايا الغضروفية |
| الأجسام المضادة &بيتا;-كاتينين | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-7963 | الجسم المضاد المرجعي الداخلي لتطبيع البلوت الغربي |
