يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

حبيبات غانزيرونغ تثبط تكوين الجلوكون الكبدي عبر محور SIRT3-MPC1-PC/PDH في مرضى السكري من النوع الثاني

417 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69500

⸱

ديسمبر 12, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

بحثت هذه الدراسة فيما إذا كانت حبيبات جانزيرونغ تحسن ارتفاع سكر الدم في مرض السكري من النوع الثاني من خلال تثبيط تكون الجلوكونيوجيولوجيا الكبدي عبر محور SIRT3-MPC1-PC/PDH.

الملخص

داء السكري من النوع الثاني (T2DM) هو اضطراب أيضي عالمي يتميز بمقاومة الأنسولين الكبدي وتكوين الجلوكوز بشكل مفرط. أظهرت تركيبة Ganzhirong Granule (GZRG)، وهي وصفة طبية صينية تقليدية، إمكانات في إدارة T2DM، لكن آلياتها الأساسية، خاصة فيما يتعلق بتكوين السكر الكبدي، لا تزال غير واضحة. بحثت هذه الدراسة فيما إذا كان GZRG يحسن ارتفاع سكر الدم من خلال تعديل مسار الإشارات الذي ينظمه SIRT3. تم تقييم التأثيرات المضادة للسكري ل GZRG في فئران T2DM المستحثة من النظام الغذائي عالي الدهون (HFD) وخلايا HepG2 المقاومة للأنسولين الناتجة عن الأحماض الدهنية الحرة (FFA). تم تقييم معايير الأيض، وتحمل الجلوكوز والبيروفيت، وحساسية الأنسولين، وملفات الدهون. تم استكشاف الآليات الجزيئية من خلال فرط التعبير وتقليل SIRT3، مع دراسة تعبير البروتينات الرئيسية (SIRT3، MPC1، PC، PDH-E2، PCK1، وG6Pase) في مسار الجلوكونوجين. أدى علاج GZRG إلى تحسين ارتفاع سكر الدم بشكل كبير، وزيادة حساسية الأنسولين، وتحسين أيض الدهون في كل من فئران T2DM وخلايا HepG2 المقاومة للأنسولين (IR). خفف من تعبد الكبد وقمع تكوين الجلوكون. ميكانيكيا، خفضت GZRG تعبير SIRT3، مما أدى إلى انخفاض متزامن في مستويات MPC1 وPC، وزيادة في PDH-E2. هذا التحول في تعبير البروتين أعاد استقلاس البيروفات بعيدا عن تكوين الجلوكون. عكس فرط التعبير عن SIRT3 التأثيرات المثبطة ل GZRG على تكوين الجلوكوز، بينما كان SIRT3 Knockdown يتآزر مع GZRG. يخفف GZRG من T2DM عن طريق تثبيط تكون الجلوكونيوكونا الكبدي عبر محور SIRT3-MPC1-PC/PDH. توضح هذه النتائج آلية جزيئية جديدة ل GZRG وتسلط الضوء على SIRT3 كهدف علاجي محتمل لإدارة T2DM.

المقدمة

برز مرض السكري من النوع الثاني (T2DM) كواحد من أكثر اضطرابات الأيض المزمنة انتشارا وإضعافا في العالم، حيث يشكل عبئا كبيرا على الصحة العامة والاقتصاد 1,2. يتميز مرض T2DM بمقاومة الأنسولين (IR) وخلل تدريجي في وظائف خلايا البنكرياس β، ويكون السبب الرئيسي هو ضعف توازن الجلوكوز والدهون 3,4. من بين الأعضاء المتعددة المشاركة في تنظيم الجلوكوز، يلعب الكبد دورا مركزيا من خلال التحكم في إنتاج الجلوكوز الداخلي من خلال تحلل الجليكوجينوليس وتكوين الجلوكوز5. يعد تكوين السكر الكبدي المفرط سببا رئيسيا في ارتفاع سكر الدم أثناء الصيام، وهو سمة مميزة لفيزيولوجيا مرض السكر من النوع الثاني، ويمثل هدفا علاجيا حيويا لاستعادةتوازن الجلوكوز.

العوامل الحالية التي تسبب انخفاض سكر الدم — بما في ذلك الميتفورمين7، الثيازوليدينيديونات8، منشطات مستقبلات GLP-19، ومثبطات SGLT210 — تحقق التحكم في السكر السكري من خلال آليات مختلفة، ومع ذلك فإن استخدامها طويل الأمد غالبا ما يكون محدودا بسبب الآثار الجانبية أو انخفاض الفعالية أو عدم تحمل العلاج. وبالتالي، هناك اهتمام متزايد بالأساليب العلاجية التكميلية أو البديلة التي يمكنها استهداف مسارات أيضية متعددة بأمان وفعالية. يتميز الطب الصيني التقليدي (TCM)، الذي يتميز بخصائصه الدوائية متعددة المكونات والأهداف، آفاق واعدة لإدارة الأمراض الأيضية المعقدة مثل T2DM 11,12,13,14,15. تم الإبلاغ عن عدة تركيبات كلاسيكية للطب الصيني التقليدي لتحسين مقاومة الأنسولين، وتحسين أيض الدهون، وتقليل تكوين الجلوكوز الكبدي من خلال آليات تنظيمية متكاملة16,17.

حبيبات غانزيرونغ (GZRG) هي تركيبة موحدة للطب الصيني التقليدي لها تاريخ في الاستخدام السريري لإدارة اضطرابات الأيض. GZRG هو تركيبة عشبية تتكون من ثمانية أعشاب طبية. استنادا إلى تحقيقاتنا السابقة في الكيمياء النباتية والدوائية، تم تحديد مجموعة من المركبات النشطة حيويا في GZRG، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: حمض السالفيانوليك B، D-ستاكيوز، بروانثوسيانيدين، حمض الأكساليك البنفسجي، حمض السالفيانوليك A، حمض السالفيانوليك C، كاليكوزين 7 جلوكوزيد، 3′-ميثوكسي بويرارين، 3′-هيدروكسي بويراين، أبيجينين-7-أو-بيتا-دي-بيرانو، إيمودين-8-أو-β-دي-جلوكوز، كريسوفانول-1-أو-جلوكوزيد، كريسوفانول-8-أو-جلوكوزيد، بويرارين، حمض روزمارينيك، كريبتوتانشينون، كاتشين، فورت-نيفلافين، الكاليكوزين، راين، جوانوسين، حمض الأوليك، إيمودين الألوة، الفورمونينتين، حمض البالميتيك، كريسوفانول، دي-تريبتوفان، دانشينسو، حمض الفيروليك، مانيتول، حمض غاليك، وإل-فينيل ألانين. تكمن ميزة أساسية للطب الصيني التقليدي (TCM) في إدارة مرض السكري من النوع الثاني في فعاليته التآزرية متعددة المكونات والأهداف. من المرجح أن تتفاعل العشرات من المكونات النشطة الموجودة في GZRG مع عمليات بيولوجية متعددة - مثل مسارات إشارات الأنسولين، واستقلاب الجليكوجين، والاستجابات الالتهابية - مما ينتج تأثير شبكة متكاملة لا يمكن تكراره بشكل كاف بواسطة أي مركب منقىواحد 18. أظهرت أبحاث سابقة أن GZRG له تأثيرات مفيدة على استقلاب الجلوكوز والدهون في نماذج مرضى السكري19؛ ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية الدقيقة وراء هذه التأثيرات غير واضحة. على وجه الخصوص، لم يتم بعد توضيح ما إذا كان GZRG يمارس فعالياته المضادة للسكري من خلال تعديل الإشارات الجلوكونية الكبدية.

سيرتوين 3 (SIRT3)، وهو ديأسيتيلاز يعتمد على NAD⁺ الميتوكوندري، هو منظم محوري لتوازن طاقة الخلية20. من خلال إزالة الأسيتلة وتنشيط الإنزيمات الأيضية الرئيسية، يؤثر SIRT3 على فسفرة الميتوكوندريا التأكسدية، وأكسدة الأحماض الدهنية، وتكوين الجلوكوز21. تم ربط التعبير الشاذ عن SIRT3 بمسببات مقاومة الإنسولين والكبد الدهني وT2DM 22,23. تشير الأدلة إلى أن فرط التعبير عن SIRT3 الكبدي يعزز تدفق الجلوكونوجينات عن طريق تعديل إنزيمات مثل حامل بيروفات الميتوكوندريا 1 (MPC1)24، وبيروفات كاربوكسيلاز (PC)25، وبيروفات ديهيدروجيناز (PDH)26، وفوسفينولبيروفات كاربوكسيكيناز (PCK1)27، وجلوكوز-6-فوسفاتاز (G6Pase)28. لذا، فإن التحكم الذي يعبر عنه SIRT3 في استقلاب البيروفات يمثل نقطة اتصال حاسمة تربط وظيفة الميتوكوندريا بإنتاج الجلوكوز الكبدي، مما يجعل SIRT3 هدفا جذابا للتدخل العلاجي في مرض السكر من النوع الثاني.

نظرا للتأثيرات الأيضية المعروفة للمكونات النشطة بيولوجيا في GZRG، إلى جانب الدور المركزي ل SIRT3 في توازن الجلوكوز الكبدي، تم افتراض أن GZRG يخفف ارتفاع سكر الدم في T2DM من خلال تعديل مسار الجلوكونيوجين الذي يبوساه SIRT3. لتقييم هذه الفرضية، تم تقييم تأثيرات GZRG على أيض الجلوكوز والدهون في فئران T2DM المستحثة من النظام الغذائي عالي الدهون (HFD) وخلايا HepG2 المقاومة للأنسولين الناتجة عن الأحماض الدهنية الحرة (FFA). فحصت أبحاث إضافية دور محور الإشارة SIRT3-MPC1-PC/PDH في التوسط في التأثير المثبط ل GZRG على تكون السكر الكبدي. تهدف هذه الدراسة إلى توضيح الآليات الجزيئية التي تدعم الفوائد الأيضية ل GZRG وتقديم أدلة تجريبية تدعم إمكاناته العلاجية كمنظم متعدد الأهداف لإدارة T2DM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على بروتوكول دراسة من قبل لجنة العناية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعة تشانغتشون للطب الصيني (رقم الموافقة 2024396). أجريت جميع التجارب على وفقا للإرشادات الوطنية والقوانين الوطنية ذات الصلة بحماية.

الأدوية التجريبية
تم توفير GZRG (رقم الدفعة 26210483) من قبل المستشفى التابع لجامعة تشانغتشون للطب الصيني (جيلين، الصين). تم توصيف المكونات الحيوية النشطة الرئيسية ومعايير مراقبة الجودة ل GZRG في دراسة سابقة18.

الكواشف والأجسام المضادة
تم استخدام مجموعات الفحص التجارية لقياس الجلوكوز، الجليكوجين، الأحماض الدهنية غير المعقمة (NEFAs)، الدهون الثلاثية (TG)، الكوليسترول الكلي (TC)، الكوليسترول عالي الكثافة (HDL)، والكوليسترول منخفض الكثافة (LDL). كما تم الحصول على مجموعات اختبار الحمض النووي المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA) للهيموغلوبين الجليكوزيلي والأنسولين تجاريا. كما تم الحصول على مجموعات ELISA لإنزيم الهيدروجيناز البيروفات (PDH) وكاربوكسيليز البيروفات (PC) تجاريا. لأغراض العمل على RNA وcDNA، تم اقتناء مجموعة أنسجة/خلية RNA، وqPCR PreMix، وgDNA RT SuperMix تجاريا. تم إجراء النقل باستخدام كاشف النقل. الأجسام المضادة الأولية ضد SIRT3 (RRID: AB_2837621)، فوسفينولبيروفات كاربوكسيكيناز 1 (PCK1؛ RRID: AB_2838732)، PDH-E2، جلوكوز-6-فوسفاتاز (G6Pase؛ RRID: AB_2845572)، حامل بيروفات الميتوكوندريا 1 (MPC1؛ RRID: AB_2836209)، PC (RRID: AB_2836732)، وجلسرا ألدهيد-3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH؛ RRID: AB_2833041) تم الحصول عليها من بائع تجاري.

الفئران والعلاجات
تم الحصول على ذكور فئران C57BL/6J (عمرها 5-6 أسابيع) من شركة لياونينغ تشانغشنغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة وتم الحفاظ عليها تحت ظروف قياسية (22 ± 2 درجة مئوية، رطوبة 50٪-60٪، دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة) مع وصول مجاني إلى الطعام والماء. بعد فترة تأقلم لمدة أسبوع، تم تعيين ستة فئران عشوائيا كمجموعة ضابطة (كون) وتم إطعامها نظاما غذائيا قياسيا. أما الفئران المتبقية فقد تلقت نظاما غذائيا عالي الدهون (HFD) لمدة 12 أسبوعا لتحفيز السمنة ومقاومة الأنسولين.

في الأسبوع الثالث عشر، تم تصنيف الفئران التي أظهرت مستوى سكر الدم الصائم (FBG) ≥ 11.1 مل/لتر كنماذج ناجحة لمرض السكري من النوع الثاني (T2DM). تم توزيع هذه الفئران المصابة بالسكري عشوائيا إلى خمس مجموعات تجريبية (n = 6 لكل مجموعة): مجموعة نموذج HFD، جرعة منخفضة GZRG (L-GZRG، 3.2 جم/كغ/يوم)، جرعة متوسطة الجرعة من GZRG (M-GZRG، 6.4 جم/كغ/يوم)، جرعة عالية من GZRG (H-GZRG، 12.8 جم/كغ/يوم)، والميتفورمين (Met، 0.2 جم/كغ/يوم). تم إعطاء GZRG وMet يوميا عن طريق التقاد الفموي لمدة 8 أسابيع. تلقت مجموعتا النماذج Con وHFD كميات مماثلة من المياه المقطرة. عند انتهاء فترة العلاج، تم جمع عينات من أنسجة الدم والكبد من جميع الفئران لتحليلها لاحقا.

اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (IPGTT)، اختبار تحمل البيروفات (PTT)، واختبار تحمل الأنسولين (ITT)
تم إجراء اختبارات تحمل الأيض بين 6 و8 أسابيع بعد بدء العلاجات الدوائية. بالنسبة ل IPGTT وPTT، كانت الفئران تصوم طوال الليل (حوالي 16 ساعة). بالنسبة ل ITT، تم تطبيق فترة صيام أقصر مدتها 4 ساعات. بعد الصيام، تلقت الفئران حقنا داخل الصفاق إما من الجلوكوز (2 جرام/كغ ل IPGTT)، أو بيروفات الصوديوم (2 ج/كغ ل PTT)، أو الإنسولين العادي البشري (1 U/kg ل ITT). تم قياس مستويات الجلوكوز في الدم من عينات دم الأوريد الذيلي عند 0 دقيقة و30 و60 و90 و120 دقيقة بعد الحقن باستخدام جهاز قياس السكر المعاير.

التحليل الكيميائي الحيوي واختبارات نشاط الإنزيمات
تم تحديد مستويات الجلوكوز في الدم الصائم (FBG)، وهيموغلوبين A1c (HbA1c)، والأنسولين (INS) باستخدام مجموعات الفحص التجارية وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. تم حساب تقييم نموذج مقاومة الأنسولين (HOMA-IR) باستخدام الصيغة:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) × INS (μU/mL)] / 22.5

تم قياس مستويات NEFAs المنتشرة، TG، TC، LDL-C، HDL-C، والأنشطة الإنزمية ل PDH وPCها في أنسجة الكبد باستخدام المجموعات التجارية المعنية.

التحليل النسيجي المرضي لأنسجة الكبد
تم تثبيت أنسجة الكبد الطازجة في فورمالين مخزن 10٪ محايد لمدة 24 ساعة، تلاها معالجة قياسية لدمج البارافين. تم قطع وصبغ المقاطع (بسماكة 5 ميكرومتر) بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) للتقييم الشكلية العام. لرؤية الدهون، تم تضمين عينات كبد مختارة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT)، ثم تجميدها بالسرعة، وقطعها بالتجميد، وصبغها بزيت أحمر O.

زراعة الخلايا والعلاج
تم الحصول على سلسلة الخلايا الورمية الكبدية البشرية HepG2 من مجموعة الزراعة النموذجية في الأكاديمية الصينية للعلوم (الصين). تم زراعة الخلايا في وسط أساسي أدنى (MEM) مدعوم بجلوكوز 25 ملليمتر، و10٪ مصل أبقار جنيني (FBS)، و1٪ بنسلين-ستربتوميسين. تم الحفاظ على الزراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لإنشاء نموذج مخبري لمقاومة الأنسولين (IR)، تم معالجة الخلايا عند التقاء بنسبة 70٪-80٪ لمدة 24 ساعة بمزيج من الأحماض الدهنية الحرة (FFA) التي تحتوي على حمض الأوليك وحمض البالميتيك بنسبة مولية 2:1، استنادا إلى طريقة تم الإبلاغ عنها سابقا مع تعديلات طفيفة29. بعد إدخال FFA، تم استبدال وسط الزراعة ب MEM طازج يحتوي على نفس خليط FFA مع تركيزات مختلفة من GZRG لحضانة إضافية لمدة 24 ساعة.

اختبار بقاء الخلايا (CCK-8)
تم حصاد خلايا HepG2 في مرحلة النمو اللوغاريتمي وزرعها في 96 صفيحة بئر بكثافة 1 × 104 خلايا لكل بئر. تم ملء الآبار الطرفية ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مع فوسفات (PBS) لتقليل التبخر. بعد الحضانة الليلية لضمان الالتصاق، عولجت الخلايا وفقا للتصميم التجريبي. بعد المعالجة، أضيف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر، وتم حضن الألواح لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة. تم حساب صلاحية الخلايا على النحو التالي:

[(As - Ab) / (AC - Ab)] x 100٪

حيث A هو امتصاص العينة، وAc هو امتصاص العنصر الضابط (الخلايا غير المعالجة)، وAb هو امتصاص الفراغ (الآبار بدون خلايا).

نقل البلازميدات في خلايا HepG2
تم بناء بلازميد فرط التعبير SIRT3 (OV-SIRT3) وثلاثة بلازميدات RNA صغيرة متداخلة مميزة تستهدف SIRT3 (si-SIRT3-1#، si-SIRT3-2#، si-SIRT3-3#)، إلى جانب siRNA للتحكم السلبي (si-NC)، بواسطة مورد. تم إجراء عمليات النقل باستخدام كاشف النقل عندما تصل الخلايا إلى 50٪-60٪ من التقاء البعض. تم تحضير مركب النقل في ظروف معقمة كما يلي: تم توليد محلول A عن طريق تخفيف 1 ميكروغرام من حمض نووي البلازميدي في 250 ميكرولتر من وسط مصل مختزل مع خلط لطيف. تم إعداد الحل B عن طريق تخفيف 2-3 ميكرولتر من كاشف النقل في 250 ميكرولتر من وسط مصل مختزل، تلاها الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق دون دوامة. تم دمج المحللين، وخلطهما بلطف عبر الماصات، وحضانهما في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتشكيل مركبات من حمض نووي ودهني. للنقل، قبل ساعة من الإجراء، تم استنشاق وسط زراعة الخلايا، وغسل الخلايا ب PBS، وأضيف 1 مل من وسط المصل المختص (خالي من المصل والمضادات الحيوية). ثم أضيف 500 ميكرولتر من مركب النقل بشكل قطري إلى كل بئر، وتم تدوير صفيحة الزراعة بلطف لضمان التجانس. تم حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعات، ثم تم استبدال الوسط بوسط كامل للتخفيف من سمية الخلايا. بعد ذلك، تم زراعة الخلايا لمدة 24-48 ساعة إضافية قبل إجراء المزيد من التحليل. تم تقييم كفاءة النقل بواسطة PCR الكمي (qPCR). تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي، ونسخ عكسيا إلى cDNA، وتضخيمه باستخدام بادئات خاصة ب SIRT3 باستخدام 18S rRNA كعنصر تحكم داخلي. تم تحديد مستويات التعبير النسبي باستخدام طريقة ΔΔCt، وتم اختيار أكثر بناء siRNA فعالية للتجارب اللاحقة بناء على هذه النتائج.

صبغة زيت أحمر O لتراكم الدهون داخل الخلايا
تم زرع خلايا HepG2 في مرحلة النمو اللوغاريتمي في صفيحة بئر 24 بكثافة 2 ×10 5 خلايا لكل بئر وتحفزها بوسط عالي الدهون يحتوي على 250 ميكرومولار حمض الأوليك و250 ميكرومولار حمض البالميتك لمدة 48 ساعة لتأسيس نموذج تراكم الدهون. بعد العلاجات، تم غسل الخلايا ب PBS وتثبيتها ب 10٪ فورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف بالماء المقطر وغمر قصير في 60٪ من الأيزوبروبانول، تم صبغ الخلايا بمحلول عمل Oil Red O طازج (يتم الحصول عليه بخلط المكونات A1 وA2 بنسبة 3:2) لمدة 10-15 دقيقة. تمت إزالة الصبغة الزائدة عن طريق الغسل ب 60٪ من الأيزوبروبانول، تليها بالماء المقطر. تم صبغ النوى بمادة هيماتوكسيلين ماير (1.0 جم/لتر) لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد الغسل النهائي، تم تركيب الخلايا على جيلاتين الجلسرول، وتم التقاط الصور باستخدام مجهر ضوئي بتكبير 200x لتقييم نوعي لقطرات الدهون.

تحفيز مقاومة الأنسولين وقياس كمية الجلوكوز في خلايا HepG2
تم زراعة خلايا HepG2 في صفيحة تحتوي على 24 بئر بكثافة بذور 2 × 10 خلاياوخمس خلايا لكل بئر لإنشاء نموذج في المختبر لمقاومة الأنسولين. بعد 24 ساعة من العلاج، تم جمع المادة الفائقة للزراعة لمزيد من التحليل. لقياس الجلوكوز داخل الخلية، تم طرد الأقراص الخلوية على حرارة 1000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم التخلص من المادة الفائقة، وغسل حبيبة الخلية مرة أو مرتين باستخدام حاجز إيزوتونيك، تلاها الطرد المركزي تحت نفس الظروف. ثم تم توحيد الحبيبة في وسط تجانس بسعة 0.2 إلى 0.3 مل، وخضعت لتشويش فوق صوتي في حمام ماء مثلج باستخدام مسبار بقوة 300 واط، مع نبضات تتراوح بين 3-5 ثوان تليها فواصل زمنية مدتها 30 ثانية، تتكرر 3x-5x. تم اختبار التجانس الناتج مباشرة دون الحاجة إلى طرد مركزي إضافي. تم قياس مستويات الجلوكوز في كل من المادة الفوقية للزراعة والخلية المتجانسة باستخدام مجموعة اختبار الجلوكوز الموحدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لضمان تقييم دقيق وقابل للتكرار للاستجابات الأيضية.

قياس محتوى الدهون الثلاثية في الخلايا
تم جمع خلايا HepG2 عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 10 دقائق، وتم التخلص من المادة الفائقة. تم غسل حبيبة الخلية مرة واحدة أو مرتين باستخدام عازل فوسفات متساوي التوتر (0.1 م، رقم الهيدروجينات 7.0-7.4)، تلاها الطرد المركزي تحت نفس الظروف. بعد إزالة السوبرناتينت، تم إعادة تعليق الحبيبة وتجانسها ب 0.2-0.3 مل من الإيثانول المطلق. تعرض العنصر المتجانس لاضطراب فوق صوتي على الجليد (300 واط، 3-5 ثوان لكل انفجار، 30 ثانية، تكرر 3-5 مرات). تم استخدام التجانس الناتج مباشرة للتحليل اللاحق دون الحاجة إلى طرد مركزي إضافي. تم إعداد لوحة بسعة 96 بئر مع آبار فارغة وقياسية وعينات. بعد الخلط الشامل، تم حضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتم قياس الامتصاص عند 500 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة. تم حساب محتوى الدهون الثلاثية في عينات الخلايا بناء على منحنى معياري مشتق من التخفيف التسلسلي لمعايير الجلسرول.

قياس محتوى الكوليسترول الكلي
تم تحلل خلايا HepG2 (5 × 106) في 1 مل من حاجز الاستخلاص بواسطة اضطراب فوق صوتي على الجليد. تم تطرد المادة المتجانسة بقوة 10,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم جمع المادة الفائقة للتحليل الفوري. تم تحضير محلول قياسي للكوليسترول (50 ميكرومول/مل) وتخفيفه بشكل تسلسلي لتوليد منحنى قياسي (0.3125 إلى 10 ميكرومول/مل). تم تحضير محلول كروموجيني يعمل عن طريق خلط الكواشف واحد واثنان وثلاثة المتوفرة في مجموعة اختبار الكوليسترول، وتم تدفئته مسبقا إلى 37 درجة مئوية. تم خلط العينات أو المعايير مع محلول العمل، وحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتم قياس الامتصاص عند 500 نانومتر. تم حساب محتوى الكوليسترول بناء على المنحنى القياسي.

التلوين بالفلورة المناعية
تم شطف الخلايا التي نمت على أغطية الغطاء ب PBS البارد جدا وتثبيتها ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسلات PBS، تم نفاذ الخلايا بنسبة 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقائق وتم حجبها ب 5٪ BSA عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ثم تم حضن الخلايا بجسم مضاد أولي مضاد SIRT3 (تخفيف 1:500) عند 4 درجات مئوية خلال الليل. بعد غسلات PBS، تم حضن الخلايا بجسم مضاد ثانوي مترابط بالفلورة (تخفيف 1:2000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم صبغ النوى بمادة DAPI (0.5 ميكروغرام/مل) لمدة 10 دقائق. تم تركيب الغطاءات على شرائح زجاجية باستخدام وسط تثبيت مضاد للتلاشي وعرضها تحت مجهر فلوري.

استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل المباير الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام مجموعة أنسجة/خلايا RNA. تمت إزالة الحمض النووي الجيني، وتم تصنيع cDNA باستخدام مجموعة gDNA RT. تم إجراء PCR الكمي باستخدام مجموعة qPCR على نظام كشف PCR في الوقت الحقيقي. تم توفير تسلسلات البادئية الخاصة بالجينات في الجدول 1.

تحليل البقع الغربية
لاستخراج البروتين من أنسجة الكبد، تم وزن حوالي 50-200 ملغ من الأنسجة، وتقطيعه في طبق بتري، ونقله إلى مجانس. تمت إضافة محلول تحلل مبرد مسبقا (RIPA buffer) مدعوم بمثبطات للبروتياز والفوسفاتاز لمنع تحلل البروتين. تم إجراء التجانس بشكل كامل على الجليد لضمان تعطيل كامل للأنسجة، وتم نقل التجانس إلى أنبوب طرد مركزي وحضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة لتسهيل ذوبان البروتين. بعد ذلك، تم طرد الطبقة المتجانسة عند 4 درجات مئوية عند 12,000 × جرام لمدة 10-30 دقيقة، وتم جمع المادة الفائقة بعناية كمستخلص البروتين الكامل، لتجنب التلوث من الحبيبة. لاستخلاص البروتين الخلوي، أضيف إلى الخلايا محلول تحلل مبرد مسبقا (مخزن RIPA يحتوي على 1٪ ترايتون X-100 ومثبطات بروتياز) إلى الخلايا، تليها الحضانة على الثلج لمدة 15-30 دقيقة لتحقيق التحلل الكامل. تم ضمان تعطيل الخلية من خلال الكشط المتكرر باستخدام مكشطة الخلايا أو التوصيل بقوة بالماصات. تم نقل الليزات إلى أنبوب طرد مركزي وتم طرده المركزي عند 4 درجات مئوية عند 14,000 × جرام لمدة 30 دقيقة، وتم جمع المادة الفائقة كمستخلص البروتين الكلي. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA، وتم تخزين الأليكوات عند -80 درجة مئوية لتحليل ويسترن بلوت المستقبلي أو استخدامها مباشرة لتحضير العينة. تم تفكيك عينات البروتين في مخزن Laemmli عند درجة حرارة 100 °C لمدة 10 دقائق، مفصولة بواسطة SDS-PAGE، ونقلها إلى أغشية PVDF. تم حجب الأغشية بحليب خالي من الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، ثم تم حضانها بأجسام مضادة أولية محددة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسل، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ب HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور أشرطة البروتين باستخدام ركيزة الإضاءة الكيميائية المعززة (ECL). تم التقاط إشارات الإضاءة الكيميائية، وتم قياس شدة النطاق بواسطة تحليل الكثافة القياسية باستخدام برنامج ImageJ. البقع الغربية الخام متوفرة في الملف التكميلي 1.

التحليل الإحصائي
جميع البيانات تعبر عنها كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). تم إجراء مقارنات إحصائية بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن. للمقارنات بين ثلاث مجموعات أو أكثر، تم تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، تلاه اختبار توكي بعد الوقوع للمقارنات المتعددة. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 9.5.0). تم اعتبار قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

حسن GZRG مقاومة الأنسولين وتكوين الجلوكون في الفئران المسببة ل HfD T2DM
نموذج الفأر الناجم عن مرض السكري من النوع الثاني (T2DM) الناتج عن HFD، والذي يتميز بمقاومة الأنسولين، وارتفاع سكر الدم، وخسر الدهون، يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في مسببات الأمراض وتقييم التدخلات العلاجية30. في هذه الدراسة، تم إنشاء نموذج T2DM المحفز ب HFD في فئران C57BL/6J لتقييم فعالية وآليات GZRG.

مقارنة بمجموعة الضابطة، أظهرت الفئران التي تغذت على HFD زيادات كبيرة في وزن الجس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر الدراسة الحالية أن GZRG يمارس تأثيرات كبيرة لمضادات ارتفاع السكر في الدم وتحسس الأنسولين في كل من نماذج T2DM في الجسم الحي والمختبري ، وذلك بشكل رئيسي من خلال تثبيط تكون الجلوكونيود الكبدي عبر تعديل محور SIRT3-MPC1-PC/PDH. تشير البيانات التجريبية إلى أن إعطاء GZRG خفف من ارتفاع سكر الدم الصائم، وحسن تحمل الجلوكوز والأنسولين، وأعاد توازن الدهون الدهونية، وقلل من انقطاع الكبد في الفئران المصابة بالسكري الناتج عن HFD. بالتوازي، عزز العلاج ب GZRG استخدام الجلوكوز، وزاد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح جميع المؤلفين بأنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية قد تكون أثرت على العمل المبلغ عنه في هذه الورقة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل خطة تطوير العلوم والتكنولوجيا لمقاطعة جيلين، رقم المنحة 20210101199JC، YDZJ202301ZYTS454.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فاست كينج gDNA يبطل RT SuperMix      شركة تيانجن للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين). KR118-02
الأجسام المضادة جلوكوز-6-فوسفاتاز (G6Pase)شركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-D-12610
الأجسام المضادة لإنزيم الهيدروجيناز الجلسرالي ألديهايد-3-فوسفات (GAPDH)شركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-T-0004
مجموعات ELISA للهيموغلوبين الجليكوزيل;    شركة جيانغسو ميميان الصناعية المحدودة (الصين).MM-0159M2
GZRGالمستشفى التابع لجامعة تشانغتشون للطب الصيني (جيلين، الصين)26210483
مجموعات اختبار الكوليسترول عالي الكثافة (HDL)معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية (الصين)A112-1-1
مجموعات ELISA للإنسولينشركة جيانغسو ميميان الصناعية المحدودة (الصين).MM-0579M2
ليبوفكتامين2000 إنفيتروجين، الولايات المتحدة الأمريكية11668-019
مجموعات اختبار الكوليسترول منخفضة الكثافة لبروتين الدهون (LDL)معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية (الصين)A113-1-1
مجموعات قياس اختبار الجلوكوزمعهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية (الصين)F006-1-1
حامل بيروفات الميتوكوندريا 1 (MPC1) الأجسام المضادةشركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-D-3852
مجموعات الفحص للأحماض الدهنية غير المعمرة (NEFAs)معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية (الصين)A042-2-1
الأجسام المضادة للكمبيوترشركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-D-4364
الأجسام المضادة PDH-E2شركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-D-14046
فوسفينولبيروفات كاربوكسي كيناز 1 (PCK1) الجسم المضادشركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-D-6770
مجموعات ELISA من بيروفات كاربوكسيلاز (PC)شركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-160408H
مجموعات ديهيدروجيناز البيروفات (PDH)ELISA   شركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-160300H
مجموعة الأنسجة/الخلايا السريعة للRNA    شركة تيانجن للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين). DP451
الأجسام المضادة SIRT3شركة ووهان لينغجيسي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين)LJS-A-5135
المواهب SYBR Green qPCR PreMix شركة تيانجن للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين). FP209-02
مجموعات اختبار الكوليسترول الكلي (TC)معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية (الصين)A110-1-1
مجموعات اختبار ثلاثي الغليسريدات (TG)معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية (الصين)A111-1-1

المراجع

  1. Ahmad, E., Lim, S., Lamptey, R., Webb, D. R., Davies, M. J. Type 2 diabetes. Lancet (London, England). 400, 1803-1820 (2022).
  2. Singh, A., Shadangi, S., Gupta, P. K., Rana, S. Type 2 Diabetes Mellitus: A Comprehensive Review of Pathophysiology, Comorbidities, and Emerging Therapies. Comp Physiol. 15, e70003(2025).
  3. Lu, X., et al. Type 2 diabetes mellitus in adults: pathogenesis, prevention and therapy. Signal Transduct Target Ther. 9, 262(2024).
  4. Yang, W., Jiang, W., Guo, S. Regulation of Macronutrients in Insulin Resistance and Glucose Homeostasis during Type 2 Diabetes Mellitus. Nutrients. 15 (21), 4671(2023).
  5. Petersen, M. C., Vatner, D. F., Shulman, G. I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol. 13 (10), 572-587 (2017).
  6. Barroso, E., Jurado-Aguilar, J., Wahli, W., Palomer, X., Vázquez-Carrera, M. Increased hepatic gluconeogenesis and type 2 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab. 35 (12), 1062-1077 (2024).
  7. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  8. Lebovitz, H. E. Thiazolidinediones: the Forgotten Diabetes Medications. Curr Diab Rep. 19 (12), 151(2019).
  9. Yao, H., et al. Comparative effectiveness of GLP-1 receptor agonists on glycaemic control, body weight, and lipid profile for type 2 diabetes: systematic review and network meta-analysis. BMJ. 384, e076410(2024).
  10. Vallon, V., Verma, S. Effects of SGLT2 Inhibitors on Kidney and Cardiovascular Function. Annu Rev Physiol. 83, 503-528 (2021).
  11. Dou, Z., et al. Syndrome Differentiation and Treatment Regularity in Traditional Chinese Medicine for Type 2 Diabetes: A Text Mining Analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 728032(2021).
  12. Ni, Y., et al. Evidence of traditional Chinese medicine for treating type 2 diabetes mellitus: from molecular mechanisms to clinical efficacy. Pharm Biol. 62 (1), 592-606 (2024).
  13. Wang, J., et al. Effects of three Huanglian-derived polysaccharides on the gut microbiome and fecal metabolome of high-fat diet/streptozocin-induced type 2 diabetes mice. Int J Biol Macromol. 273 (Pt 1), 133060(2024).
  14. Qi, L., et al. Structural characterization of red yeast rice-derived polysaccharide and its promotion of lipid metabolism and gut function in high-fat diet-induced mice. Int J Biol Macromol. 282 (Pt 1), 136744(2024).
  15. Liu, Y., et al. Flavonoid-Rich mulberry leaf extract modulate lipid metabolism, antioxidant capacity, and gut microbiota in high-fat diet-induced obesity: potential roles of FGF21 and SOCS2. Food Med Homol. 1, 9420016(2024).
  16. Wu, H., et al. Efficacy and safety assessment of traditional Chinese medicine for metabolic syndrome. BMJ Open Diabetes Res Care. 8 (1), e001181(2020).
  17. Jin, Z., Wang, X. Traditional Chinese medicine and plant-derived natural products in regulating triglyceride metabolism: Mechanisms and therapeutic potential. Pharmacol Res. 208, 107387(2024).
  18. Chen, S., et al. Screening and identification of active compounds of GanZhiRong granule based on liquid chromatography-mass spectrometry and biomolecular networks. Chinese J Anal Chem. 51, 100294(2023).
  19. Yu, Y., Liu, T., Yang, Y., Wang, H., Liu, Y. Effects of Liver Fat Soluble Granule Comnined and Metformin on Blood Glucose in Diabetic Rats. Jilin J Trad Chinese Med. 39, 654-656 (2019).
  20. Ji, Z., Liu, G. H., Qu, J. Mitochondrial sirtuins, metabolism, and aging. J Genet Genomics. 49 (4), 287-298 (2022).
  21. Zhang, J., et al. Mitochondrial Sirtuin 3: New emerging biological function and therapeutic target. Theranostics. 10 (18), 8315-8342 (2020).
  22. Chen, J., et al. The role of sirtuins in the regulatin of oxidative stress during the progress and therapy of type 2 diabetes mellitus. Life Sci. 333, 122187(2023).
  23. Weng, S., et al. Chaperonin counteracts diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by aiding sirtuin 3 in the control of fatty acid oxidation. Diabetologia. 66 (5), 913-930 (2023).
  24. Liang, L., Li, Q., Huang, L., Li, D., Li, X. Sirt3 binds to and deacetylates mitochondrial pyruvate carrier 1 to enhance its activity. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 807-812 (2015).
  25. Guo, X., et al. The Role of Palmitoleic Acid in Regulating Hepatic Gluconeogenesis through SIRT3 in Obese Mice. Nutrients. 14 (7), 1482(2022).
  26. Han, Y., et al. Bawei Chenxiang Wan ameliorates right ventricular hypertrophy in rats with high altitude heart disease by SIRT3-HIF1α-PDK/PDH signaling pathway improving fatty acid and glucose metabolism. BMC Complement Med Ther. 24 (1), 190(2024).
  27. Wei, X., et al. Both prolonged high-fat diet consumption and calorie restriction boost hepatic NAD+ metabolism in mice. J Nutr Biochem. 115, 109296(2023).
  28. Kavanaugh, J. W. Skeletal Muscle Acetylation in Response to an Acute and Chronic High-Fat Diet [Doctoral Dissertations]. , Virginia Tech. (2017).
  29. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. Attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  30. Qu, X., et al. Riligustilide alleviates hepatic insulin resistance and gluconeogenesis in T2DM mice through multitarget actions. Phytother Res. 36 (1), 462-474 (2022).
  31. Rui, L. Energy Metabolism in the Liver. Compr Physiol. 4, 177-197 (2014).
  32. Li, A., et al. Berberine Reduces Pyruvate-driven Hepatic Glucose Production by Limiting Mitochondrial Import of Pyruvate through Mitochondrial Pyruvate Carrier 1. EBioMedicine. 34, 243-255 (2018).
  33. Tavoulari, S., Sichrovsky, M., Kunji, E. R. S. Fifty years of the mitochondrial pyruvate carrier: New insights into its structure, function, and inhibition. Acta Physiol (Oxford, England). 238 (4), e14016(2023).
  34. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  35. Xu, G., et al. Mitochondrial ACSS1-K635 acetylation knock-in mice exhibit altered metabolism, cell senescence, and nonalcoholic fatty liver disease. Sci Adv. 10 (20), eadj5942(2024).
  36. Jin, L., et al. FGF21-Sirtuin 3 Axis Confers the Protective Effects of Exercise Against Diabetic Cardiomyopathy by Governing Mitochondrial Integrity. Circulation. 146 (20), 1537-1557 (2022).
  37. Ning, Y., et al. SIRT3: A potential therapeutic target for liver fibrosis. Pharmacol Ther. 257, 108639(2024).
  38. Xian, Y., et al. Enhanced SIRT3 expression restores mitochondrial quality control mechanism to reverse osteogenic impairment in type 2 diabetes mellitus. Bone Res. 13 (1), 30(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مسار SIRT3مقاومة الإنسوليناستقلاب البيروفاتخلايا HepG2التعبير البروتينياستقلاب الدهونتحمل الجلوكوز
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.