تقدم هذه المقالة بروتوكولا لتقديم أول تقرير عن محتوى المغذيات والمسارات الأيضية المرتبطة بأوراق C. oleifera عند ثلاث مراحل نمو وتطور، ولتوفير أساس لفهم الآلية الجزيئية لشيخوخة الأوراق.
مقالة بحثية
تقدم هذه المقالة بروتوكولا لتقديم أول تقرير عن محتوى المغذيات والمسارات الأيضية المرتبطة بأوراق C. oleifera عند ثلاث مراحل نمو وتطور، ولتوفير أساس لفهم الآلية الجزيئية لشيخوخة الأوراق.
للدلالة على التغيرات في محتوى المغذيات، والتعبير الجيني المرتبط باستقلاب النيتروجين، واستقلاب النشا والسكروز في C. oleifera في فترات نمو مختلفة، تم جمع أوراق صنف C. oleifera 'Dabieshan 1' في مرحلة اليافعة ( C. oleifera عمرها سنتان)، ومرحلة الإثمار المبكرة ( C. oleifera البالغ من العمر 6 سنوات)، ومرحلة الذروة في الإثمار ( C. oleifera البالغ من العمر 10 سنوات)، والتي تم اختيارها كمواد تجريبية. تم إجراء تحديد محتوى العناصر الغذائية وتحليل تسلسل النسخ النصي على عينات الأوراق في مرحلة الإزهار المبكرة، مع دراسة منهجية محتوى العناصر الغذائية والمسارات الأيضية المرتبطة ب C. oleifera خلال فترات النمو المختلفة. ميزت النتائج 9 جينات متجانسة مرتبطة باستقلاب النيتروجين و24 مرتبطة باستقلاب النشا والسكروز، على التوالي، بعد تعريض أوراق C. oleifera التي جمعت خلال مرحلة اليافعة وذروة الإثمار للمقارنة في قاعدة بيانات KEGG. مع زيادة عمر الشجرة، هناك تغيرات في أيض النيتروجين ومسارات الأيض النشوية والسكروز في أوراق C. oleifera. يعزز C. oleifera مسار الفينيل ألانين الأمونيا-لياز وتخليق السكروز. وقد أدى ذلك في النهاية إلى زيادة مستويات البروتينات والسكريات القابلة للذوبان في أوراق C. oleifera . توفر هذه الدراسة رؤى جديدة حول آليات التغيرات في استقلاب النيتروجين، وأيض النشا والسكروز، ومحتوى العناصر الغذائية أثناء تحول C. oleifera من النمو النباتي إلى النمو التناسلي. يقدم مراجع نظرية لفهم فترة الإثمار واستخدام الأسمدة الورقية للنباتات لتعزيز الإزهار والإثمار.
خلال مرحلة النشأة، عادة ما يمتلك C. oleifera ساقا رئيسية غير مقسمة ويخضع بشكل أساسي للنمو النباتي، ويفتقد القدرة على العمليات التناسلية مثل تمايز براعم الزهور والإزهار1. عند تطعيم شتلات C. oleifera، من الممارسات الشائعة استخدام براعم الربيع التي تدخل مرحلة البالغة كنسل، لأنها تمتلك القدرة على تحفيز الإزهار2،3،4. ومع ذلك، خلال مرحلة الزراعة المبكرة، قد تواجه C. oleifera صعوبة في مرحلة النشأة في تكوين براعم الزهور وتخضع لتمايز براعم الزهور بسبب النمو النباتي القوي، حيث قد تحد الظروف البيئية من تكوين براعم الزهور. ومع ذلك، مع تقدم C. oleifera في مرحلته المبكرة إلى فترة الإثمار الأولية وصولها في النهاية إلى ذروة الإثمار، تطور تدريجيا القدرة على الخضوع لتكوين براعم الزهور والإزهار بشكل طبيعي. تتميز C. Oleifera بشكل معقد، حيث تتزامن الثمار والزهورفي نفس الوقت. في مرحلة الإثمار الأولية، قد تنتج C. oleifera بعض الأزهار، ولكن عندما تدخل مرحلة ذروة الإثمار، تنتج كمية أكبر من الأزهار. في مرحلة ذروة الإثمار لفطر C. oleifera، يصبح النمو التناسلي هو السائد، مصحوبا بزيادة الطلب على الضوء ودرجة الحرارة والماء والمغذيات. من الواضح أن أشجار الفاكهة الخشبية، مثل C. oleifera، لديها فترة نمو نباتية طويلة قبل الإزهار، مما يحد من إمكانية تقصير دورة الزراعة وتحقيق إنتاجية عالية مبكرة6.
النيتروجين مهم جدا لكيفية نمو وتطور النباتات. أنواع النباتات المختلفة تحتوي على كميات مختلفة من النيتروجين، وحتى داخل نفس النوع، توجد فروق كبيرة في محتوى النيتروجين في فترات نمو مختلفة. مع انتقال النباتات إلى مرحلة النمو التناسلي، يتراكم النيتروجين تدريجيا في أعضاء مثل الزهور والفواكه والبذور7. النيتروجين ضروري للإنزيمات والبروتينات والهرمونات المحددة والأحماض النووية وغيرها من المواد الحيوية، مما ينظم الأنشطة الأيضية8. تشكل عملية تمايز براعم الزهور نقطة تحول رئيسية، حيث تنتقل النباتات من مرحلتها الخضرية إلى مرحلة التكاثر، وتتضمن عملية تطور معقدة. يعد تراكم المغذيات أساسا أساسيا لتمييز براعم أزهار النباتات9. الإجماع الحالي يرى أن التمايز الناجح لبراعم الزهور يعتمد على تراكم الكربوهيدرات10. خلال تمايز براعم أزهار أشجار الفاكهة، تؤثر تقلبات محتوى السكر القابل للذوبان بشكل مباشر أو غير مباشر على العملية10. أظهرت الدراسات وجود ارتباط وثيق بين مستويات الكربوهيدرات في أوراق Prunus salicina وتمايز براعم الأزهار، حيث أن مستويات السكر القابل للذوبان تكون أعلى في مرحلة التمايز الفسيولوجي لبراعم الأزهار مقارنة بفترة التمايز الشكلي للبراعم الزهرية، حيث شهدت P. salicina استنفادا سريعا من الكربوهيدرات أثناء تمايز براعم الأزهار11. ومع ذلك، هناك تقارير تشير إلى أنه لا يوجد تقلب كبير في محتوى النشا القابل للذوبان في الفيكوس كاريكا خلال تمايز براعم الأزهار12. تتراكم النباتات دائمة الخضرة النشا داخل المبيض خلال فترة الربيع من تمايز براعم الأزهار، بينما تخزن النباتات المتساقطة الأوراق النشا خلال فترة سكون البرعم13. استنادا إلى المعلومات أعلاه، يمكننا الاستنتاج بوجود اختلافات في مسارات تغيرات محتوى الكربوهيدرات بين الأنواع المختلفة أثناء تمايز براعم الأزهار. حلل يينغ وآخرون أنماط التعبير لجينات الإنزيمات الرئيسية المتورطة في عمليات المسارات الجوية الأساسية، مثل استقلاب النيتروجين، وأيض السكروز والنشا، في مرحلتين مختلفتين من تمايز براعم الزهور في Vernicia fordii. تم دمج هذا التحليل مع التغيرات الديناميكية في المؤشرات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية لبراعم زهرة شجرة التنغ، مما وفر توضيحا تفصيليا لتراكم واستخدام ونقل وتوزيع العناصر الغذائية خلال تمايز براعم زهر شجرةالتونغ 8,14. وجدت أبحاث لي تشنغتشون وآخرون أن إزالة ورقتين يمكن أن تعدل الجينات المعبر عنها مثل السكروز فوسفات سينثاز (SPS)، الإنفرتاز المحايد (NI)، إنفيرتاز جدار الخلية (CWI)، و α-الأميلاز (AMY)، مما يعزز تخليق السكر والتراكم اللاحق للنشا، مما يوفر الإطار الغذائي الأساسي اللازم لنضج الثمار، وإنبات البراعم، والإزهار13,15.
ومع ذلك، نادرا ما تم الإبلاغ عن الأبحاث حول التغيرات في محتوى العناصر الغذائية، واستقلاب النيتروجين، واستقلاب النشا والسكروز في C. oleifera في مراحل مختلفة. ركزت معظم الدراسات على بناء خرائط تعدد أشكال النيوكليوتيد الأحادي (SNP)، وتطوير علامات SSR، وتحليل الاستجابات الفسيولوجية والجزيئية ل C. oleifera تحت ظروف درجات حرارة منخفضة أو عالية 16,17,18,19,20. لذلك، في هذه الدراسة، تم اختيار الصنف الشائع من C. oleifera "دابيشان 1"، وتم جمع عينات أوراق من براعم الربيع في فترات نمو مختلفة (مرحلة اليافعة، مرحلة الإثمار الأولية، وذروة الإثمار) من C. oleifera لتحليل المغذيات وتسلسل النسخ النصي. كان الهدف هو تحديد الفروقات في محتوى المغذيات، واستقلاب النيتروجين، واستقلاب تعبير جينات السكروز والنشا عبر المراحل المختلفة خلال عمليات النمو والتطور التي لوحظت في أوراق C. oleifera. توضيح مسارات أيض النيتروجين، السكروز، والنشا، وعلاقاتها بالعناصر الغذائية ذات الصلة يمكن أن يضع الأساس لدراسة آلية تمايز براعم زهرة C. oleifera وتسلط الضوء على الآليات الجزيئية الكامنة وراء تزهار C. oleifera.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. المواد التجريبية
C. oleifera تم جمع أوراق 'دابيشان 1' في ثلاث مراحل رئيسية من التطور: مرحلة النشأة، في حوالي عمر سنتين؛ يتطور الموضوع إلى مرحلة الإثمار المبكرة عند عمر حوالي 6 سنوات، ويصل في النهاية إلى ذروة فترة الإثمار عندما يبلغ حوالي 10 سنوات. جميع نباتات C. oleifera في المراحل الثلاث السابقة تم زراعتها باستخدام شتلات مزروعة في الحاويات بنفس مواصفات C. oleifera 'دابيشان 1'. تم عرض الخصائص الفيزيائية والكيميائية للتربة في غابات C. oleifera في الجدول 1.
2. نظرة عامة على موقع المجموعة
تم جمع المواد التجريبية من مدينة هيبينغ الواقعة في قلب مقاطعة أنهوي. تقع مقاطعة شوتشنغ ضمن المنطقة الوسطى من المقاطعة، وتنتمي إلى المنطقة المحيطة بجبال دابي. الإحداثيات هي 31°11′ شمالا، 116°47 ′ شرقا، مع متوسط ارتفاع 90 مترا. تصنف التربة كتربة صفراء بنية. تتمتع المنطقة بنمط مناخي موسمي شبه استوائي رطب، حيث يحافظ متوسط درجة الحرارة السنوية 15.6 درجة مئوية ويشهد عادة حوالي 1,100 ملم من الأمطار سنويا، وتتمتع بحوالي 1,969 ساعة من أشعة الشمس سنويا، وتتمتع بفترة خالية من الصقيع تستمر 224 يوما.
3. جمع العينات والمعالجة المبدئية
تم اختيار العينات خلال فترة ما قبل الإزهار (أواخر سبتمبر). لكل مرحلة تطور، تم اختيار نباتات C. oleifera ذات النمو المماثل والمتسق والقوي. من كل نبات، تمت إزالة الورقة الثالثة من الأعلى إلى الأسفل، والتي كانت براعم الربيع تنمو بشكل معتدل من الاتجاهات الشرقية والغربية والجنوبية والشمالية للجزء الخارجي من تاج C. oleifera . تم تمييز العينات بحروف وأرقام تسلسلية: YAT1، YAS2، وYAT3 لأوراق C. oleifera في مرحلة اليافعة، حيث يتقدم الموضوع إلى مرحلة الإثمار المبكرة، وفترة الذروة على التوالي. تم جمع هذه النيتروجين وتخزينها في النيتروجين السائل. تم اختيار خمس أشجار عينات عشوائية من كل مرحلة كنسخة بيولوجية واحدة، وتم إعداد ثلاث نسخ بيولوجية في جميع المراحل. تم إحضار العينات المختارة في نفس اليوم إلى المختبر وحفظها عند -80 درجة مئوية.
4. تحديد المؤشر الفسيولوجي
تم تحديد محتوى السكر القابل للذوبان باستخدام طريقة الأنثرون اللونية21. تم تحديد محتوى الكربون العضوي بواسطة طريقة تعرير أكسدة ثنائي كرومات البوتاسيوم - طريقة تعرير الكبريتات الحديدية22. تم الحصول على محتوى البروتين القابل للذوبان باستخدام طريقة كوماسي براليانت بلورقم 23. تم قياس تركيز النيتروجين الكلي بطريقة كيلدال22.
5. تم إجراء عزل للحمض النووي الريبي الكامل، تلاها بناء مكتبة DNA مكملة (cDNA) ثم تسلسل لاحق
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أوراق C. oleifera في مراحل مختلفة باستخدام مجموعة استخراج RNA النباتية. تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي الكلي بواسطة مطياف فوق بنفسجي مرئي كامل الطيف. تم تحديد سلامة ووضوح الحمض النووي الريبي بواسطة محلل بيولوجي. بعد بناء والتحقق من مكتبة cDNA، تم إجراء تسلسل النسخ باستخدام منصة تسلسل بتسلسل عالي الإنتاجية. أنتجت عملية التسلسل قراءات فردية، كل منها تغطي 100 زوج قواعد24، 25، 26. خضعت نتائج محاذاة عملية التسلسل لتحليل إحصائي باستخدام برنامج RSEM27. تم تحديد جينات التعبير التفاضلي (DEGs) في مراحل تطورية مختلفة من C. oleifera باستخدام برنامج التحليل التفريقي DESeq28,29.
6. تجميع جديد وتعليق UniGene
تم استخدام SeqPrep http://github.com/jstjohn/SeqPrep) وSickle (http://github.com/najoshi/sickle) لتصفية البيانات الخام، بما في ذلك إزالة التسلسلات منخفضة الجودة والمحولات الملوثة. ثم تم تجميع القراءات النظيفة التي تم الحصول عليها من كل عينة باستخدام برنامج ترينيتي30,31. تم تعريض جميع النسخ المجمعة لمحاذاة BLASTX مع Swiss-Prot، ومجموعات المجموعات المتحامية للجينومات الكاملة في حقيقيات النواة، وقواعد بيانات KEGG بترتيب تسلسلي. تم تعيين قيمة E النموذجية (قيمة E <10−5) لاسترجاع تعليقات الدوال. تم تطبيق KEGG لتحليل المسارات الأيضية ذات الصلة32.
7. التعليق الوظيفي للجينات وتحليل الجينات المعبر عنها بشكل مختلف
تم تحليل وفرة الجينات والأشكال النظيرية إحصائيا باستخدام برنامج RSEM27. تم تعيين حد (P < 0.05، FDR < 0.01، |log2FC|>1) لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs). يعد العدد المتوقع للأجزاء لكل كيلوبايت من النسخ لكل مليون شظية مأخوذة (FPKM) هو الطريقة الأكثر استخداما حاليا لتقدير مستويات التعبير الجيني28. تم حساب قيم FPKM لجميع الجينات من ثلاث مراحل نمو وتطور مختلفة (YAT1، YAS2، وYAT3). تم إجراء تحليل التجميع الهرمي لفحص مستويات التعبير الجيني المختلفة. وفي الوقت نفسه، تم إعداد مسار KEGG لتحديد DEGs التي تم إثراؤها بشكل كبير في المسارات الأيضية عند P المصحح ببونفيروني ≤ 0.05 مقارنة بالنسخ الكامل باستخدام KOBAS29.
8. الطرق التحليلية
تم تقديم البيانات باستخدام إكسل لحساب القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية. تم استخدام تحليل التباين (ANOVA) للتحليل الإحصائي بواسطة برنامج SPSS، واستخدم اختبار النطاقات المتعددة لدانكان لتقييم الفروق الإحصائية في محتوى العناصر الغذائية بين المراحل الثلاث. ثم تم تحديد الفروق ذات الدلالة بين المجموعات باستخدام مقارنات متعددة بعد الحدث باستخدام طريقة الفرق الأقل دلالة (LSD). تم إنشاء الرسوم البيانية والمخططات باستخدام برنامج Origin لعرض النتائج التجريبية والتحليلية. لم يتم الإشارة إلى دلالة إحصائية ب 'ns' (P > 0.05). تم الإشارة إلى الفروق ذات دلالة إحصائية ب '*' (P < 0.05)، '**' (P < 0.01)، '***' (P < 0.001)، و'****' (P < 0.0001) على التوالي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
مقارنة محتوى المركبات النيتروجينية في أوراق C. oleifera في فترات نمو مختلفة
كان النيتروجين أساسيا في تسهيل نمو وتطور النباتات، حيث كان له تأثير عميق على عمليات تكاثرها. وبالتالي، فإن فهم المحتوى الكلي للنيتروجين في النباتات يحمل أهمية كبيرة للبحث العلمي. أظهر محتوى النيتروجين الكلي في أوراق C. oleifera انخفاضا تدريجيا مع نضوج النبات من مرحلة النشأة حتى بداية الإثمار ثم ذروة الإثمار، مع قياس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تعمل السكريات القابلة للذوبان كمصادر طاقة أساسية ومكونات هيكلية في النباتات، وتغذي أنشطة فسيولوجية مختلفة وعمليات تخليقية حيوية10. تؤثر التغيرات في محتوى السكر القابل للذوبان بشكل مباشر أو غير مباشر على عملية تحويل البراعم الخضراء إلى براعم أزهار في أشجار الفاكهة10. وجدت بعض الأبحاث أن الحاجة إلى وفرة السكريات القابلة للذوبان كانت لتمييز براعم أزهار أشجار الفاكهة33. تلعب البروتينات القابلة للذوبان دورا حيويا في تخليق...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وقد دعم هذا العمل مؤسسة العلوم الطبيعية الإقليمية لأنهوي للعلماء الشباب (2008085QC135)، ومشروع محطة أبحاث ما بعد الدكتوراه في كلية وانشي (WXBSH2020003)، وبرنامج البحث العلمي ما بعد الدكتوراه في مقاطعة أنهوي (2024A767)، وبرنامج تأليف مؤسسي لأعضاء هيئة التدريس في أنهوي للعلوم التقنية (2024jsqygz79)، ومشروع أبحاث وابتكار الغابات في مقاطعة أنهوي، الوثيقة رقم 4 [2024].
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المحلل الحيوي 2100 | شركة أجيلنت تكنولوجيز، إنك. (الولايات المتحدة الأمريكية) | — | يستخدم لتقييم سلامة ووضوح الحمض النووي الريبي |
| برمجيات DESeq | الشيفرة المصدرية | 3.2 | يستخدم في تحليل التعبيرات التفاضلية |
| مجموعة EASYspin Plus (عزل RNA كلي) | شركة إيدلاب للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين) | RN 28 (مختبر أيديلاب) | يستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من أوراق C. oleifera |
| منصة التسلسل HiSeq 2000 | إلومينا (الصين) | — | يستخدم لتسلسل النسخ النصي، وطول القراءة 100 بيس |
| Kjeldahl method/Kjeltec 2300 | فوس تيكاتور (السويد) | — | للحصول على تركيز إجمالي للنيتروجين (باو 2007) |
| طريقة تحديد البروتين القابل للذوبان | حمض الكبريتيك المركز | 6104-58-1 (علاء الدين) | الطريقة التي طورها تشن جيانشون (تشين وآخرون 2015) |
| طريقة تحديد السكر القابل للذوبان | العرش | 90-44-8 (ماكلين) | تشانغ تشيلانغ طريقة s (تشانغ وآخرون 2003) |
| أكسدة ثنائي كرومات البوتاسيوم - طريقة تعرية الكبريتات الحديدية | ثنائي كرومات البوتاسيوم الحديدية | NA (علاء الدين) 7782-63-0 (علاء الدين) | لتحديد الكربون العضوي (باو 2007) |
| برنامج RSEM | الشيفرة المصدرية | 1.2.3 | يستخدم في التحليل الإحصائي لمحاذاة التسلسلات |
| مطياف الفوتومتر السينتمي الثانوي 2000C | ABI(الولايات المتحدة الأمريكية) | — | يستخدم لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن