Method Article

تحضير العينات الآلي للتحليل متعدد الخلية لتعديلات ما بعد الترجمة على الهيستون أحادي الخلية (sc-hPTM2)

DOI:

10.3791/69588

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein College of Medicine, 2SCIENION, 3Department of Chemical, Life and Environmental Sustainability Sciences, University of Parma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا لأتمتة تحليل التعديل بعد الترجمة للهيستون أحادي الخلية باستخدام استراتيجية وسم ثنائي النظائر وهضم ArgC. يتيح هذا السير من التحليل الكمي والقابل للتكرار وعالي الحساسية لتغاير الكروماتين والاستجابات فوق الجينية بدقة خلية واحدة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد تعديلات الهيستون بعد الترجمة (hPTMs) هي المنظمين المركزيين لتنظيم الكروماتين وتعبيره عن الجينات. اضطراب تنظيمها مرتبط بالتطور، والسرطان، والشيخوخة. بينما يعد مطيافية الكتلة الطريقة المفضلة لدراسة hPTMs، فإن معظم البروتوكولات مصممة للعينات الضخمة ولا يمكنها حل التباين بين الخلية. لذلك، فإن توسيع تحليل PTM الهيستوني إلى مستوى الخلية المفردة أمر ضروري لكنه يمثل تحديا تقنيا، حيث أن الهيستونات منخفضة الوفرة، وغنية بالليسين، ومعدلة بشكل كبير.

هنا، نصف سير عمل آلي للبروتيوميات أحادية الخلية لتحليل PTM الهيستون باستخدام التعامل مع السوائل النانوية. يتيح النظام معالجة الخلايا الفردية على نطاق نانولتر مع معالجة بسيطة وقابلية تكرار عالية. يشمل سير العمل الهضم باستخدام بروتيز ArgC Ultra، الذي يقطع بقايا الأرجينين ويتجنب الحاجة إلى خطوات اشتقاق حجب الليسين التي عادة ما تكون مطلوبة في بروتيوميات الهيستون. لتمكين المقارنة الكمية بين الحالات، نطبق استراتيجية وسم ثنائي الطبقات مع الأنهيدريد البروبيوني ونظيره الديوتر، أنهيدريد البروبيوني-d10. هذا المزيج من تحضير العينات الآلي، والتعدد النظيري، وهضم ArgC Ultra يؤدي إلى بروتوكول مبسط وحساس لتحليل PTM للهيستون أحادي الخلية.

تسمح هذه الطريقة بدراسة تباين الكروماتين وتأثيرات الاضطرابات فوق الجينية عند دقة خلية واحدة. لتوضيح سير العمل، قمنا بتوليد كرويدات من خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2/C3A وعالجناها ببيوتيرات الصوديوم، وهو مثبط لديأسيتيلاز الهيستون يحفز فرط الأسيتيل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهيستونات هي مكونات البروتين في النيوكليوسومات، وهي الوحدات المتكررة للكروماتين. ذيولها ذات الطرف N غنية ببقايا الليسين والأرجينين، ويتم تنظيمها بشكل كبير بواسطة تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs)، مثل الأسيتلة، والمثيلة، والفسفرة. تؤثر هذه التعديلات على الوصول إلى الحمض النووي وبالتالي التحكم في العمليات بما في ذلك النسخ والتكرار والإصلاح. أنماط PTM المتغيرة في الهيستون مرتبطة ارتباطا وثيقا بحالات المرض، من السرطان إلى التنكس العصبي والشيخوخة 1,2. لهذا السبب، أصبح تحليل PTM بالهيستون محل اهتمام كبير في أبحاث علم التخلق والبروتيوميات. توفر مطيافية الكتلة (MS) تحليلا موقعيا وكميا لتعديلات الهستون، لكن الهستونات تطرح تحديات تحليلية فريدة. تركيبها للأحماض الأمينية، ومواقع التعديل المتعددة، والأنماط التوافقية المعقدة تجعل تحليلها أكثر صعوبة من البروتينات التقليدية. تعتمد البروتوكولات المعتمدة على الاشتقاق الكيميائي لحجب بقايا الليسين قبل الهضم، مما يحسن استعادة الببتيدات والأداء الكروماتوغرافي3. على الرغم من فعاليتها في التحليلات الجماعية، يمكن أن تسبب هذه بروتوكولات الاشتقاق متعددة الخطوات خسائر تشكل إشكالية للمدخلات ذات الخلية الواحدة. يزداد أهمية تحليل الخلايا الأحادية لأن الأنظمة البيولوجية بطبيعتها غير متجانسة. تحليل الهيستون الضخم يحلل الإشارات المتوسطة عبر العديد من الخلايا وبالتالي يفشل في التقاط هذا التباين. قد تختلف مجموعات الخلايا الفرعية في حالات الكروماتين، ويمكن لهذه الفروقات أن تدفع التطور أو إعادة برمجة الخلايا أو استجابات الأدوية4،5.

هنا، نقدم طريقة تحضير عينة آلية لتحليل PTM الهيستوني أحادي الخلية متعدد الإرسال (sc-hPTM2). تعتمد هذه الطريقة على نظام CellenONE، الذي يسمح بتوزيع الخلايا الفردية والكواشف على مقياس النانولتر بدقة بطريقة آلية. هذه الطريقة هي تعديل على طريقة تحضير عينات النانو بروتيومية (nPOP)، التي أدخلت لأول مرة استخدام تحضير القطرات على شريحةزجاجية 6. تتميز منصة nPOP ببروتيوميات آلية متقدمة لخلية واحدة، ومع ذلك فإن بروتوكول الهضم التريبتيكي القياسي أقل كفاءة للهيستونات بسبب محتواها العالي من الليسين وكثافة التعديل الواسعة فيها. هنا، قمنا بتكييف نظام CellenONE لدمج اشتقاق الهيستون القياسي الذهبي مع أنهيدريد البروبيوني، وقدمنا وضع علامات نظيرية، مما أتاح قياسا دقيقا وشاملا لتعديلات الهيستون بعد الترجمة بدقة خلية واحدة. على وجه التحديد، نبسط البروتوكول باستخدام بروتياز ArgC Ultra لهضم البروتين. على عكس التريبسين، ينقسم ArgC فقط عند بقايا الأرجينين ولا يتطلب حجب الليسين. هذا يلغي الحاجة إلى استراتيجية اشتقاق من خطوتين، مما يبسط البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن الطريقة نظام وسم نظائر ثنائية الأبعاد باستخدام الأنهيدريد البروبيوني وأنهيدريد بروبيوني-d10، مما يسمح بتحليل خليتين في نفس الوقت 7,3. بعد الهضم والوسم، يتم استرجاع عينات الخلايا المفردة وتحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة (LC-MS)/MS باستخدام الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA). في أيدينا، أظهرت هذه الطريقة زيادة في الحساسية وقابلية التكرار لقياس كميات PTM الهيستونية مقارنة بالنسخة السابقة من هذه الطريقة8.

لتوضيح الطريقة، قمنا بتحليل ديناميكيات PTM للهيستون أحادي الخلية في الكرويدات المستمدة من خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2/C3A. عالجنا هذه الكرات ببيوتيرات الصوديوم، وهو مثبط هيستون دي أسيتيلاز مميز جيدا يزيد من أسيتلة الهيستون ويعد معيارا لتنظيم الكروماتين 9,10. من خلال مقارنة العينات الضابطة والكروية المعالجة ببيوتيرات الصوديوم بدقة خلية واحدة، نظهر إثبات مبدأ للنتائج التمثيلية، مبرزة الإمكانات لتطبيقات أوسع في بيولوجيا الكروماتين وعلم التخلق فوق الوراثي للسرطان. ومن الجدير بالذكر أنه بالنسبة للبروتوكول، نشير إلى منشور سابق يصف نمو ومعالجة الكرويداتثلاثية الأبعاد 10، واكتساب ببتيدات الهيستون في مطيافية الكتلة11، وتحليل البيانات باستخدام برنامج EpiProfile12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المخازن والكواشف

  1. وسائط نمو الخلايا لخلايا HepG2/C3A: حضر وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM، 4.5g/لتر جلوكوز) الذي يحتوي على 10٪ مصل البقر الجيني (FBS)، الأحماض الأمينية غير الأساسية (1٪ v/v)، L-جلوتامين (1٪ v/v)، وبنسلين/ستربتوميسين (0.5٪ v/v). يتم تخزين وسط النمو عند 4 درجات مئوية.
  2. الخليط الرئيسي: تحضير ArgC Ultra 60 ng/μL، HEPES 6 mM، n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) 0.03٪، ديثيوثريتول (DTT) 10 ملليمول في مياه بدرجة LC-MS.
  3. محلول HA: حضر 1٪ (v/v) هيدروكسي أمين في مياه بدرجة LC-MS.
  4. محلول الغسيل: حضر 10 مل من خليط أسيتونيتريل وماء بنسبة 50:50 يحتوي على 0.1٪ (بوزن ويض) حمض الفورميك (جميعه من درجة LC-MS).
  5. المرحلة المتنقلة A (MPA) - حمض الفورميك 0.1٪: أضف 1 مل من حمض الفورميك المركز إلى 999 مل من ماء عالي الكثافة العالي (HPLC) وامزج جيدا.
  6. المرحلة المتنقلة B (MPB) - 80٪ أسيتونيتريل بدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك: أضف 800 مل من الأسيتونيتريل بدرجة HPLC إلى 199 مل من مياه الدرجة HPLC. بعد ذلك، أضف 1 مل من حمض الفورميك المركز إلى هذا المحلول وامزج.

2. تحضير الكرويدات

  1. لتحضير الكرويدات، راجع سترانسكي س وآخرون 11.
  2. زراعة خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2/C3A في مفاعل حيوي ثلاثي الأبعاد دوار لمدة 5-7 أيام لتعزيز تكوين كروي منتظم حتى يصل قطر ~400-600 ميكرومتر. استخدم DMEM مع 10٪ FBS، 1٪ أحماض أمينية غير ضرورية، 1٪ L-جلوتامين، و0.5٪ بنسلين/ستربتوميسين. حافظ على الكرويدات عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربونحتى العلاج.
    ملاحظة: الشكل 1A يمثل المعدات المستخدمة لتحضير الكرويدات في ورقة المرجع.

3. زراعة الخلايا والعلاج

  1. ضع ~10 كرويدات في صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 بئر تحتوي على 2 مل من وسط النمو.
  2. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2.
  3. عالج الكرويدات لمدة 24 ساعة ب 5 ملليمولار بيوتيرات الصوديوم أو أضف نفس حجم الماء للتحكم (الشكل 1B).

4. عزل الخلايا وتحضير التعليق أحادي الخلية

  1. بعد 24 ساعة من العلاج، حضانة الخلايا ب 1 مل من تريبليل على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
  2. استخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل حتى يتفتت الكرة وتحصل على خلايا مفردة.
  3. اجمع الخلايا في أنبوب بسعة 15 مل واغسل، مخففا حتى 10 مل باستخدام 1x PBS بارد جدا، وجهاز طرد مركزي بحرارة 500 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم استنشق السوبرناتان.
  4. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS بارد كالثلج وأضف صبغة Sytox الخضراء الميتة بتركيز نهائي 1 ميكرومول.
  5. حضن الخلية باستخدام Sytox Green لمدة 20 دقيقة على الجليد في بيئة مظلمة.
  6. اغسل الخلية ب 10 مل من البارد المثلج 1x PBS، وجهاز طرد مركزي بحرارة 500 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم استنشق السوبرناتان.
  7. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS البارد جدا وأضف بارافورمالديهايد (PFA) بتركيز نهائي 0.5٪.
  8. حضن الخلية ب PFA لمدة 15 دقيقة على الثلج.
    ملاحظة: بينما لا يتوافق Sytox green عادة مع التثبيت بسبب نفاذية الغشاء، بالنسبة للخلايا، تبقى نسبة خلايا Sytox Green كما هي حتى 8 ساعات بعد التثبيت دون علامات تسرب بروتين الهيستون.
  9. اغسل الخلية ب 10 مل من البارد المثلج 1x PBS، وجهاز طرد مركزي بحرارة 500 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم استنشق السوبرناتان.
  10. إعادة تكوين الخلايا بتركيز نهائي يتراوح بين 200-500 خلية/ميكرولتر.
    ملاحظة: بالنسبة للخلايا الصغيرة التي لا تميل إلى الترسيب، يوصى بتركيز 500 خلية/ميكرولتر، بينما للخلايا الكبيرة التي تميل إلى الترسيب، يوصى بتركيز 200 خلية/ميكرولتر. إذا كان تعليق الخلية عرضة للتجمع، قم بتمريره عبر مصفاة بقوة 40 ميكرومتر قبل الشفط لتجنب انسداد الفوهة. إذا كانت الخلايا التي يزيد حجمها عن 40 ميكرومتر محل اهتمام وربما موجودة في العينة، يمكن استخدام مصفاة بحجم 70 ميكرومتر بدلا من ذلك لإزالة التجمعات الكبيرة جدا.
  11. تخزين الخلايا على الثلج حتى يتم تحميلها في الجهاز للفرز.

5. الاتصال البرمجي وتهيئة النظام

  1. قم بتشغيل نظام cellenONE (الشكل 2A)، وتشغيل جهاز التحكم، وتشغيل البرنامج، وفتح مساحة عمل المستخدم v2.0-nPOP2 ؛ جميع ملفات الحقول المطلوبة وقوالب التشغيل ل nPOP محملة مسبقا هناك.
  2. تأكد من تشغيل مبرد الآلة، ثم اضبط قيمة نقطة الندى وفقا لدرجة الحرارة الداخلية التي يبلغ عنها الجهاز حاليا.
  3. جهز النظام بفوهات توزيع PDC-70 من النوع 2 (الشكل 2B) المثبتة في الفتحات 1 و3، وفقا للتعليمات الظاهرة على الشاشة.
  4. قم بضبط عرض نبضة كل فوهة وجهد المحرك على القيم المحددة على عبوة الشركة المصنعة.
    ملاحظة: استخدام فوهتين منفصلتين يحافظ على اتساق التوزيع: إحداهما توفر تعليق الخلية، والأخرى المواد الكيميائية، لذا فإن أي حطام يلتصق بالفوهة لن يؤثر على السقوط اللاحق. استخدام كلا الفوهتين خلال خطوة الجمع النهائية يسرع أيضا من استعادة العينات.
    1. (خطوة حرجة) للحصول على أقصى كفاءة في التقاط الجهاز، يجب أن يختلف انحراف z بين الفوهتين بمقدار <50 ميكرومتر. حدد ذلك بتحديد موضع الاتصال الأمثل لكل فوهة ومقارنة قراءات ارتفاع Z في تبويب إعداد الفوهة.
  5. املأ خزان المرطب بمياه منزوعة الأيونات حتى خط التعبئة المحدد.

6. إعداد التشغيل المسبق على معالج السائل

  1. اختر عدد شرائح الزجاج (الشكل 2C) الذي سيتم تحضيره. هذا الخيار يحدد مباشرة العدد الإجمالي للخلايا المخطط تحليلها.
  2. لنظام تعدد ثنائي (الشكل 3A)، قم بتحميل شريحة واحدة تحتوي على 320 خلية.

7. توزيع خندق ثنائي ميثيل كبريتسي (DMSO) حول حواف الانزلاق

ملاحظة: يمثل الشكل 3B خطوات تحضير العينات في cellenONE بدءا من خندق DMSO. كإجراء إضافي للوقاية من تبخر القطرات، يتم توزيع DMSO على حواف الشرائح.

  1. في تبويب الرئيسي، اختر الركض إلى 0_Dispense_DMSO_Moat.
  2. اذهب إلى تبويب Target Setup ، وحمل ملف DMSO_Moat.fld من مجلد المخطط المناسب، وقم بتعيين Number of Fields على Y، مطابقا لعدد الشرائح المخطط لها للمعالجة.
  3. أليكوت 150 ميكرولتر من DMSO بدرجة LC-MS في أنبوب PCR جديد ووضعه في الموضع 2 من محطة CellenWASH مع غطاء الأنبوب المواجه لباب العدادات.
  4. افتح تبويب الجري واضغط على بدء التشغيل. سيسحب النظام 10 ميكرولتر من DMSO ويتوقف مؤقتا لتأكيد المستخدم لاستقرار القطرة. أطلق ثلاث قطرات اختبار تلقائية (الشكل 4A); إذا كانت الثلاثة متشكلة بشكل مثالي، اضغط على استمرار التشغيل.
  5. بعد التوزيع، تتسطن الفوهات تلقائيا، ويلتقط الجهاز صورا عبر جميع الشرائح للتحكم في الجودة. راجع الصور للتحقق من وجود قطرة DMSO متجانسة على كل شريحة وللتحقق من وجود قطرات مفقودة أو خارج الهدف (الشكل 4B).

8. توزيع DMSO

  1. في التبويب الرئيسي ، اختر الركض إلى 1_Dispense_DMSO.
  2. افتح تبويب إعداد الهدف ، واستورد ملف الحقول DMSO.fld (الشكل 4C) من مجلد المخطط المناسب، وقم بتعيين عدد الحقول إلى Y، مطابقا عدد الشرائح التي تنوي معالجتها.
  3. أليكوت 150 ميكرولتر من DMSO بدرجة LC-MS في أنبوب PCR جديد ووضعه في الموضع 2 من محطة CellenWASH مع غطاء الأنبوب المواجه لباب العدادات.
  4. افتح تبويب الجري واضغط على بدء التشغيل. سيسحب النظام 10 ميكرولتر من DMSO ويتوقف مؤقتا لتأكيد المستخدم لاستقرار القطرة. أطلق ثلاث قطرات اختبار تلقائية للسقط؛ إذا كانت الثلاثة متشكلة بشكل مثالي، اضغط على استمرار التشغيل.
  5. عند توزيع التشطيبات، يقوم البرنامج تلقائيا بتنظيف الفوهات ويلتقط الصور عبر كل شريحة لضمان الجودة. راجع الصور للتحقق من وجود قطرة DMSO موحدة في كل شريحة وللتحقق من وجود قطرات مفقودة أو غير مستهدفة.

9. توزيع الخلايا

  1. في تبويب الرئيسي ، اختر الركض إلى 2_Dispense_Cells.
  2. في تبويب إعداد المستهدف ، افتح المجلد الفرعي لملفات حقل الخلايا في مجلد مخطط التعدد المختار.
  3. نظرا لأن التجربة تتضمن شرطين، اختر ملف الحقل الذي يطابق العينة التي على وشك الفرز—إما CellType_A.fld أو CellType_B.fld.
  4. بعد تحميل الملف، اضبط عدد الحقول إلى Y، بحيث يساوي إجمالي عدد الشرائح في هذه الجولة.
  5. قم بإزالة غاز تعليق الخلية من الخطوة 4.11 باستخدام مضخة تفريغ لمدة 10 دقائق على الثلج.
  6. انقل 150 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضر إلى جهاز CellenVIAL نظيف، ثم ضع القارورة في الفتحة 1 من دوامة CellenWASH مع توجيه غطاء الغطاء نحو باب الأجهزة.
  7. اذهب إلى تبويب إعداد الفوهة > قم بالمهمة ونفذ Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 لسحب العينة من القارورة.
  8. بالبقاء في تبويب إعداد الفوهة ، شغل عارض توزيع الخلايا (الشكل 5A) وشغل روتين التعيين لتحديد منطقة القذف وأجسام البوابة بناء على الحجم والاستمرار. معايير عزل الخلية الواحدة المعروضة في الشكل 5A تتوافق مع الإعدادات الدقيقة المستخدمة لصرف خلايا HepG2/C3A المفككة عن الكرويدات.
  9. ثم قم بتفعيل وضع الفلورة باختيار T > F. اضبط وضع الاختيار على سالب. زيادة نطاق معاملات العزل من حيث الحجم والشدة من الحد الأدنى إلى الأقصى لضمان عدم عزل أي خلايا ميتة.
  10. تحقق من خلال معلمات التعيين، افتح تبويب Run ، واضغط على Start Run، ثم اتبع تعليمات البرنامج. عند انتهاء التوزيع، يقوم الجهاز تلقائيا بتنظيف الفوهات والتقاط صور شرائح لمراجعة توزيع القطرات وتجانسها.
    ملاحظة: أثناء فرز الخلايا، يتم التقاط صور لكل خلية منفصلة يتم عزلها أثناء التشغيل (الشكل 5B).
  11. بعد انتهاء فرز الزنزانة، أغلق نافذة الصرف.
  12. احتفظ بأي تعليق خلية متبقية على الثلج حتى ينتهي القسم 9؛ يمكن استخدام الفائض لاحقا في العينات الجماعية، أو بناء مكتبات تجريبية، أو دراسات تحقق إضافية.

10. توزيع خليط الهضم الرئيسي

  1. في تبويب الرئيسي ، اختر الركض إلى 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
  2. افتح تبويب Target Setup ، وحمل Digest.fld من مجلد مخطط التعدد المناسب، وقم بتعيين عدد الحقول إلى Y بحيث يساوي عدد الشرائح لهذا التشغيل.
  3. جهز خليط رئيسي جديد للهضم وقم بإزالة الغاز من المحلول بمضخة تفريغ لمدة 10 دقائق على الثلج (خليط رئيسي: ArgC Ultra 60 ng/μL، HEPES 6 mM، DDM 0.03٪، DTT 10 ملليمول في مياه بدرجة LC-MS).
  4. قم بعمل 20 ميكرولتر من الخليط الرئيسي في صفيحة بحجم 384 بئر وضع اللوحة داخل نظام X1.
  5. في تبويب الجري ، اضغط على بدء التشغيل واتبع التعليمات. بعد أن يستنشق النظام الكاشف، تأكد من استقرار القطرات عند طلب ذلك.
  6. عند توزيع التشطيبات، يقوم الجهاز تلقائيا بسحب الفوهات ويصور كل شريحة؛ راجع الصور للتأكد من أن كل قطرة تلقت خليط الهضم بشكل متساو.
  7. حضن الزلاجات طوال الليل للهضم، مع الحفاظ على الرطوبة المحددة ونقاط الندى. كل قطرة تحتوي على ~13.5 نانولتر من خليط الهضم. قم بالهضم طوال الليل عند ~75٪ رطوبة نسبية، مع الحفاظ على نقطة الندى تحت درجة حرارة الحجرة بمقدار 1-2 درجة مئوية لمنع تبخر القطرات.

11. الحضانة طوال الليل

  1. في التبويب الرئيسي ، اختر الركض إلى 4_Incubation_16h.
  2. انتقل إلى تبويب الجري ، ثم اضغط على بدء التشغيل.
    ملاحظة: تقوم الأجهزة بالتقاط صور للشرائح كل 30 دقيقة لمراقبة حالة القطرات. إذا جفت أو انتفخت أثناء الحضانة، قم بتعديل وضع نقطة الندى حسب الحاجة.
  3. عند انتهاء الحضانة، ستظهر رسالة تفيد بأن الحضانة اكتملت.
    ملاحظة: قد يكون الهضم السريع (≤4 ساعات) ممكنا مع ظروف إنزيم إلى ركيزة أكثر فعالية؛ لم يتم تقييم ذلك هنا، لذا يبقى الشرط المعتمد 16 ساعة.

12. التبخر

ملاحظة: قبل الانتقال إلى خطوة وضع العلامات، ينصح بفحص حالة القطرات للتأكد من أنها ليست منتفخة جدا بسبب الماء، حيث قد يؤثر الماء على كفاءة وضع العلامات. لهذا الغرض، يوصى بمرحلة التبخر.

  1. في علامة التبويب الرئيسية ، اختر الركض إلى 5_Evaporation.
  2. اذهب إلى ملف وحدة التبريد، وتحت نقطة التحكم في الندى اضبط درجة حرارة التحكم الثابتة عند 23 درجة مئوية.
  3. انتقل إلى تبويب الجري ، ثم اضغط على بدء التشغيل. سيستمر التجفيف لمدة 5 دقائق، وستلتقط الآلات تلقائيا صورا للشرائح بعد التجفيف.
  4. افحص الصور؛ إذا كانت القطرات جافة بما فيه الكفاية، أوقف الجري. إذا لم يكن كذلك، اضغط على الاستمرار وجفف لمدة 5 دقائق أخرى (الشكل 6A).
  5. في نهاية الجولة، عد إلى نظام التحكم السابق لنقطة الندى.

13. توزيع الملصقات

  1. في علامة التبويب الرئيسية ، اختر الركض إلى 6_Dispense_PA_Labels.
  2. اذهب إلى تبويب إعداد الهدف ، وحمل ملف Labels.fld من مجلد المخطط المناسب، وقم بتعيين رقم الحقول إلى Y، مطابقا عدد الشرائح المخطط لها للمعالجة.
  3. أليكوت 150 ميكرولتر من DMSO بدرجة LC-MS في الفتحة 2 من محطة CellenWASH.
  4. جهز محلول مخزوني لمخزوني المعلم لاشتقاق الهيستون متعدد الإرسال: 25٪ (v/v) أنهيدريد بروبيوني في DMSO و25٪ (v/v) بروسيون-أنهيدريد d10 في DMSO.
    ملاحظة: قم بإزالة الغاز من كلا المحلولين قبل نقلهما إلى اللوح لتقليل تكون الفقاعات.
  5. قم بتوزيع 20 ميكرولتر من كل مادة وسم في الآبار المخصصة للوحة بئر 384 ووضع الصفيحة داخل نظام X1. كل قطرة تحصل ~10 نانولتر من مادة الوسم (25٪ أنهيدريد بروبيوني أو 25٪ أنهيدريد بروبيوني-d10 في DMSO).
  6. انتقل إلى تبويب الجري ، ثم اضغط على بدء الجري، واتبع التعليمات.
  7. دع الملصقات تتفاعل أثناء الانزلاق لمدة ساعة واحدة.
  8. بعد التوزيع، يقوم الجهاز تلقائيا بسحب الفوهات ويصور كل شريحة. راجع الصور لتأكيد التوزيع المتساوي ووضع القطرات الصحيح عبر جميع الشرائح.

14. توزيع HA

  1. جهز محلول الهيدروجين وأزل الغازات قبل الاستخدام.
  2. حمل القارورة. قم بإدخال 150 ميكرولتر من محلول HA في أنبوب PCR نظيف، وضعه في فتحة CellenWASH رقم 2، ووجه الغطاء نحو باب العدادات.
  3. اختر ملف تعريف الجري. في التبويب الرئيسي ، اختر 7_Dispense_Quench.
  4. قم بتكوين ملف الحقل. افتح تبويب إعداد الهدف ، وحمل HA.fld من مجلد مخطط التعدد المناسب، واضبط عدد الحقول إلى Y ليصبح يساوي إجمالي عدد الشرائح.
  5. ابدأ الجري. انتقل إلى الركض، اضغط على بدء الجري، واتبع التعليمات الظاهرة على الشاشة.
  6. حضن. دع المساعد يتفاعل على الشرائح لمدة 30 دقيقة.
  7. تحقق من طريقة الصرف الدوائي. بعد الانتهاء، يقوم النظام بتنظيف الفوهات ويلتقط صورا لكل شريحة - يراجع هذه الصور للتأكد من توزيع القطرات والحجم المتساو.

15. التقاط عينة

  1. جهز محلول الغسيل في WashTray XL.
  2. جهز لوحة التجميع. قم بتوزيع 2 ميكرولتر من 0.01٪ (بطول وضح) DDM في مياه بدرجة LC-MS في كل بئر من صفيحة جديدة ببئر 384 وضع اللوح داخل معالج السائل.
  3. اختر رحلة التقاط. في التبويب الرئيسي ، اختر ملف 8_Pickup_2plex.
  4. قم بتحميل ملف الحقل. افتح تبويب Target Setup ، واستورد Pick-up.fld من مجلد مخطط التعدد الصحيح، وضبط عدد الحقول على Y ليطابق عدد الشرائح.
  5. نفذ الجولة. انتقل إلى تبويب الجري ، ثم اضغط على بدء الجري، واتبع التعليمات. سيجمع الجهاز كل قطرة، ويغسل الفوهات، ويصور الشرائح للمراجعة للتأكد من أن كل عينة قد تم استرجاعها.

16. معالجة ما بعد الاستلام

  1. أغلق صفيحة 384 بئر بورق لاصق وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجلب القطرات إلى قاع الآبار.
  2. أزل ورق الألمنيوم وجفف العينات على حرارة منخفضة في جهاز تركيز تفريغ.
  3. أغلق اللوح بورق لاصق واحتفظ بالطبق المجفف عند -80 درجة مئوية حتى يكون جاهزا لتحليل LC-MS/MS.

17. تحضير العينات السائبة

  1. باستخدام التعليق المتبقي من القسم 9، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها في 1x PBS للحصول على تركيز 2000 خلية/ميكرولتر. يجب أن يتم ذلك بعد الانتهاء من القسم 10.
  2. التحلل الحراري: تجميد التعليق المتبقي عند -80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم صدمة حرارية عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. دع الأنبوب يبرد مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. انقل 25 ميكرولتر من الليزات إلى أنبوب PCR وأضف 5 ميكرولتر من خليط الهضم المعد مسبقا.
  5. حضن الحوض طوال الليل (≈ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية في جهاز دورة حرارية.
  6. اشتقاق مسمية الضوء: أضف 5 ميكرولتر من ملصق ضوء جديد بنسبة 25٪ (v/v) في الأسيتونيتريل وحضن لمدة ساعة واحدة.
  7. تبريد التفاعل: أضف 5 ميكرولتر من محلول هيدروكسي أمين (HA) بنسبة 1٪ (باللون العريض) وحضانه لمدة 30 دقيقة.
  8. جفف العينة في مركز فراغ مضبوط على حرارة منخفضة، ثم خزن عند -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة ل LC-MS/MS.

18. إعداد LC/MS وجمع البيانات

ملاحظة: لجمع البيانات لهذه المخطوطة، تم إعداد نظام LC-MS\MS بعمود تحليلي لبصريات الأيونات بحجم 75 ميكرومتر × 25 سم × 1.7 ميكرومتر.

  1. جهز المراحل المتنقلة للعمل على HPLC:
    المرحلة المتنقلة A (MPA): 0.1٪ حمض الفورميك في مياه من درجة HPLC
    المرحلة المتنقلة ب (MPB): حمض الفورميك 0.1٪ في أسيتونيتريل من درجة HPLC
  2. برمج طريقة HPLC لتدرج نشط لمدة 30 دقيقة: 5-23٪ MPB في 25.7 دقيقة، 23-35٪ MPB في 2.6 دقيقة، و35-45٪ MPB في 1.7 دقيقة، بمعدل تدفق 200 نانولتر/دقيقة. برمج السامبلر التلقائي ليعلق العينة بنسبة 0.1٪ FA + 0.01٪ DDM للالتقاط 'الجاف'.
  3. إعداد طريقة اكتساب MS لتنفيذ الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA):
    ملاحظة: هذه الإعدادات مخصصة لجهاز Thermo Exploris 480 المزود ب FAIMS Pro Duo وقد تختلف حسب آلتك. يوصى باستخدام تلك الشائعة في بروتيوميات الخلية الأحادية DIA ذات نطاقات m/z مشابهة كما هو موضح أدناه.
    1. اضبط MS ليكون مسحا كاملا من 300-1100 م/z بدقة 120,000، وهدف AGC 300٪، وأقصى وقت حقن 246 مللي ثانية، وFAIMS CV ب-50 فولت.
    2. اضبط MS/MS ليكون مسح DIA من 300-1100 م/z بدقة 60,000، نافذة عزل 50 م/ز، طاقة تصادم HCD 27، الكتلة الأولى 120 م/ز، هدف AGC 1000٪، أقصى زمن حقن 118 مللي ثانية، وذاكرة الرؤية الخلفية FAIMS -50 فولت.
  4. قم بإزالة ختم رقائق الألمنيوم من صفيحة 384 بئر تحتوي على الخلايا الفريدة. إعادة تكوين العينة الكلية عند 100 خلية/ميكرولتر في 0.1٪ FA + 0.01٪ DDM ونقل 10 ميكرولتر إلى بئر فارغ، مثل P24. ثم أغلق اللوح بسجادة مطاطية قابلة للثقب وحملها في جهاز السامبلر التلقائي.
  5. تشغيل القوائم في الطابور: شغل أولا العينات الضخمة ثم مجموعات الخلايا الفردية.

19. تحليل البيانات

  1. شغل البيانات الخام باستخدام EpiProfile2.1 للحصول على نتائج مع وفرة الببتيدوفورم للخلايا الموسومة بأنهيدريد بروبيوني.
    ملاحظة: يجب الحصول على عينات على جهاز حراري لاستخدام EpiProfile 2.1 لمعالجة البيانات. يستخرج هذا البرنامج حوالي 250 بيبتيدوفورم مع نسخته الرسمية، لكنه قابل للتعديل حسب الكائن الحي، والتعديلات الإضافية ذات الاهتمام، والطفرات، وما إلى ذلك.
  2. شغل البيانات الخام مع EpiProfile2.1_D5 للحصول على نتائج مع وفرة الببتيدوفورم للخلايا الموسومة بأنهيريد البروبيوني-d10.
  3. قم بإجراء الربط بين البيانات الوصفية ومخرجات Epiprofile باستخدام برنامج quantQC.
  4. قم بتصفية العينات الفاشلة بالمقارنة مع الفراغات.
  5. قم بتصفية الببتيدوفورم التي ليست موجودة في 50٪ على الأقل من العينات.
  6. قم بتصفية أشكال الببتيدوفورمات التي لا تزيد إشارة شدة الخلية الواحدة عن 150٪ في الفارغ.
  7. احصل على جدول النتائج (الشكل 7A) ومعالجة البيانات بشكل أكبر حسب الحاجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإظهار تطبيق سير عمل بروتيوميكس الهيستوني أحادي الخلية باستخدام نظامنا، قمنا بتحليل الكرويدات لخلايا HepG2/C3A المعالجة ببوتيرات الصوديوم 5 ملليمولار لمدة 24 ساعة. بعد الحصول على LC-MS/MS، تمت معالجة البيانات الخام باستخدام EpiProfile لكل من الوسم الخفيف (أنهيدريد البروبيوني) والثقيل (أنهيدريد البروبيوني-d10)، والحصول على بيانات مطبعة تمثل وفرة الببتيدات وعلامات الهستون. ثم تم استخدام حزمة QuantQC R لربط بيانات الاستحواذ الخاصة بمعالج السائل على مخرجات EpiProfile للحصول على معلومات محتوى الببتيدات والوفرة المرتبطة بها لك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل القدرة على قياس التعديلات بعد الترجمة في الهيستون على مستوى الخلية المفردة خطوة حاسمة نحو فهم التغاير الحقيقي لتنظيم الكروماتين. قدمت الطرق التقليدية بكميات كبيرة رؤى لا تقدر بثمن حول متوسط توزيع hPTMs عبر الأنسجة، لكنها تخفي التغير بين الخلايا الذي أصبح معروفا بشكل متزايد بأنهذو معنى بيولوجي. تسمح مناهج البروتيومية أحادية الخلية الآن بحل هذه الطبقة الخفية من التعقيد، كاشفة عن حالات كروماتين مميزة قد تكون وراء تنظيم جيني تفاضلي، مرونة خلويا، وضعف الأمراض

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ج.س. هو موظف في شركة SCIENION US Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة بيرنيس مورو والدكتورة جيدونغ شان في مركز علم الوراثة الخلوية الجزيئية في كلية ألبرت أينشتاين للطب على صيانتهما جهاز cellenONE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملبيو-راد2239480
1000 وميكرو؛ رؤوس الماصة ذات قطر Lفيشر ساينتيفك14222703
200 وميكرو؛ رؤوس الماصة ذات قطر Lفيشر ساينتيفك14222730
لوحة PCR ببئر 384 بئر Lo Bind إبندورف30129547
متعدد الفراغ ذو 96 بئرميليبورMAVM0960R
الأسيتونيتريل بدرجة Optima LC-MS/MSفيشر ساينتيفكA955-1
رقائق ألواح PCR اللاصقةثيرمو فيشرAB0626
الأسيتونونتريل اللامائيفيشر ساينتيفكAA42311AKالملصقات لحل المخزون للجملة
أرج-سي ألترا، درجة موازية الكتلةبروميغاVA1831
ماء بدرجة زراعة الخلاياكورنينغ25-055-CV
سيلين فيالزسينيون/رقم الكتالوج يأتي مع عرض سعر
DMSO، لامائيةثيرمو فيشرD12345محلول الملصقات
DTTسيغماD0632-5G
وسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM)فيشر ساينتيفكMT17205CV
مصل الأبقار الجنينيفيشر ساينتيفكMT35010CV
حمض الفورميكالترمو28905
حمض الفورميك 98٪– 100٪ ل LC-MS ليتشروبورسيغما5330020050
محلول الملح المتوازن لهانك (HBSS)فيشر ساينتيفكMT21022CV
هيبيس (فائق النقي)ثيرمو فيشر11344041
أسيتونيتريل من درجة HPLCفيشر ساينتيفكA955-4
مياه من درجة HPLCفيشر ساينتيفكW5-4
محلول هيدروكسي أمين 50 wt. ٪ في H2Oسيغما438227-50ML
إل-جلوتامينفيشر ساينتيفكMT25015CI
منظف n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM)فيشر ساينتيفكBN2005
الأحماض الأمينية غير الأساسيةفيشر ساينتيفكMT25025CI
مطياف الكتلة أوربيراب إكسبلوريس 480ثيرمو فيشرBRE725539
بارافورمالديهايد 16٪ محلول مائي درجة كهرومغناطيسيةعلوم المجهر الإلكتروني15710-S
PDC-CM (طلاء النوع 2)سينيون/رقم الكتالوج يأتي مع عرض سعر
البنسلين-ستريبتوميسينفيشر ساينتيفكMT3002CI
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، 10x، pH 7.4، خال من RNaseثيرمو فيشرAM9625
بيرس ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، درجة LC-MSثيرمو فيشر85190
بندقية البيبيتإبندورفZ666467 (ميليبور سيغما)
أنهيدريد بروبيوني ≥ 99%سيغما240311-50G
أنهيدريد بروبيوني-d10 ≥ 98 ذرة ٪ D، ≥ 99٪ (CP)سيغما615692-1G
الطرد المركزي المبردالترمو75-217-420
شرائح زجاجية مطلية ب SciCHIP H1سينيون/رقم الكتالوج يأتي مع عرض سعر
مركز الفراغ SpeedVac (ألواح 96 بئر)الترمو15308325العبقري SPD1010
غطاء محرك معقمالترمو1375
الماصات المصلية المعقمةفيشر ساينتيفك1367549
صبغة SYTOX Green Dead Stain، لقياس تدفق الخلاياثيرمو فيشرS34860
إنزيم TrypLE Express (1X)، بدون فينول أحمرثيرمو فيشر12604013
الدوامةسيغماZ258415
حمام مائيفيشر ساينتيفكFSGPD10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).
  2. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  3. Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis. J Vis Exp. (111), e54112(2016).
  4. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biol. 19 (1), 161(2018).
  5. Slavov, N. Single-cell protein analysis by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).
  6. Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP. Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).
  7. Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond. Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).
  8. Cutler, R., et al. Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity. Nature Communications. , (2025).
  9. Davie, J. R. Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate. J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).
  10. Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model. Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).
  11. Stransky, S., et al. Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures. J Vis Exp. (1), e65086(2023).
  12. Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  13. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell ProteomicsHistone ModificationsAutomated Sample PreparationMultiplex LabelingChromatin HeterogeneityMass SpectrometryArgC Ultra DigestionSpheroid AnalysisHigh Throughput WorkflowEpigenetic Perturbations

Related Articles