مقالة منهجية

توصيف إفراز الحويصلة خارج الخلوية المستخرج من الخلايا الدهنية باستخدام نموذج فأر CD63-GFP في الجسم الحي وفي المختبر

DOI:

10.3791/69670

⸱

ديسمبر 5, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم البروتوكول خط فأر CD63-GFP الخاص بالخلايا الدهنية لرؤية وقياس إفراز الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا الدهنية (EVs) وإثبات امتصاصها من قبل الخلايا السابقة، كاشفا عن مسار باراكرين داخل نسيج دهني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعرف الخلايا الدهنية بشكل متزايد كخلايا نشطة في الغدد الصماء تفرز كميات كبيرة من الخلايا الكيميائية الغنية بالبروتينات والدهون والأحماض النووية. ومع ذلك، فإن الآليات التي تحكم إفراز التيار الكهربائي وديناميكيات إفراز التيار الكهربائي في سياقات بيولوجية مختلفة غير مفهومة بالكامل. لسد هذه الفجوة، أنشأنا خط فأر جديد مخصص لخلايا الدهون، حيث يتم تشغيل تعبير CD63 الموسوم ب GFP بواسطة محفز أديبونكتين، مما يمكن من وضع العلامات الانتقائية والتتبع لأنظمة AdEV في الجسم الحي. باستخدام هذا النموذج التقريري، درسنا إفراز أديEVs وتوصيلها إلى APCs داخل أنسجة الدهون. كشفت التصوير الكونفوكلي وقياس تدفق الخلايا أن ADEVs يتم تبنيها بنشاط من قبل APCs، مما يبرز آلية الاتصال الباراكريني التي لم تكن مقدرة جيدا سابقا داخل بيئة الدهون الدقيقة.

لتكمل دراسات الداخل الحي ، تم إنشاء نظام في المختبر ، يسمح بالمراقبة المباشرة لإفراز الخلايا الدهنية المتمايزة. تم عزل APCs من أنسجة دهنية بيضاء تحت الجلد للفئران المبلغة وحثها على التمايز إلى خلايا دهنية ناضجة. في هذه الخلايا، لوحظت إشارات CD63-GFP كنقاط منفصلة وأصبحت غنية في غشاء البلازما عند تثبيط إفراز EV، مما يتوافق مع تراكم الحويصلات عند الإفراج المحجوب. في ظروف النمو الطبيعية، تم تركيز المركبات الكهربائية التي تفرز في وسط الزراعة ثم تنقيتها باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم، مما أتاح إجراء تحليلات وظيفية وكيميائية حيوية في المراحل اللاحقة.

يمكن تطبيق هذه المنصة على الخلايا الجذرية المترددة المشتقة من مستودعات دهنية أخرى، مثل الأنسجة الدهنية البيضاء والبنية البربخية، أو عن طريق تمييزها إلى خلايا دهنية خاصة بالمستودع، مما يمكن من مقارنة إفراز الخلايا الدهنية بين أنواع مختلفة من الخلايا الدهنية.

معا، تقدم هذه الأساليب أداة جينية قوية ونظام مائي مكمل لتحليل ديناميكيات إفراز واستهداف AdEV. تسلط هذه التطورات الضوء على التواصل الخلوي داخل الدهون ومهدت الطريق لفهم التأثير الأيضي الأوسع لأنظمة AdEVs في الصحة والأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرف نسيج الدهون بشكل متزايد كعضو ديناميكي للغدد الصماء له أدوار رئيسية في توازن الطاقة في الجسم بالكامل 1,2,3,4,5. بعيدا عن وظيفتها الكلاسيكية كمستودع لتخزين الدهون، تنظم الخلايا الدهنية حساسية الأنسولين الجهازية، وترتبط الاضطرابات في كتلة الدهون - سواء كانت زائدة أو ناقصة - بمقاومة الأنسولين ومرض الأيض 6,7,8,9. إحدى الآليات المقترحة للمساهمة في هذه القدرة التنظيمية هي التواصل بين الخلايا عبر العوامل الإفرازية. بينما تعتبر الأديبوكينات إشارات رئيسية للغدد الصماء من الأنسجة الدهنية10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، تطلق الخلايا الدهنية أيضا عددا كبيرا من الحويصلات خارج الخلية (EVs)، وهي جسيمات مرتبطة بالغشاء تحتوي على دهون، بروتينات، أحماض نوية، ومستقلبات. لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت المركبات الكهربائية المفرزة بالخلايا الدهنية (AdEVs) تحمل أيضا الجليكانات، مثل أنواع المركبات الكهربائية الأخرى، 19,20,21,22,23,24. ثبت أن الخلايا الدهنية مصدر رئيسي للخلايا الدهنية الكهربائية، حيث أن حوالي 80٪ من الخلايا الدقيقة الريبية الخارجية المتداولة تنشأ من الخلايا الدهنية في نماذج الفئران، كما أظهر باستخدام فئران Dicer الخاصة بالخلايا الدهنية تحت ظروف25. تم الإبلاغ عن أدوار أديEVs في الأيض، والالتهاب، وحساسية الأنسولين، وتكوين الدهون، لكنها لا تزال غير مفهومة بشكل كامل 26,27,28,29. وظائف محتملة أخرى، خاصة في التوسط بين التواطؤ مع أنواع وأعضاء خلايا أخرى، لا تزال مجهولة إلى حد كبير. تشير وفرة26 من المركبات الكهربائية إلى أنها قد تلعب أدوارا مهمة في الإشارات المحلية والنظامية، لكن الأهمية البيولوجية وآليات عمل الهجمات المضادة للطاقة الكهربائية لم تستكشف إلى حد كبير. تسلط هذه الفجوة في المعرفة الضوء على الحاجة إلى طرق قوية ومتخصصة لدراسة إفراز ووظيفة AdEV.

لسد هذه الفجوة، قمنا بتوليد فئران CD63-GFP خاصة بالخلايا الدهنية (AdipCD63-GFP) عن طريق تهجين فئران أديبونكتين-كري مع فئران Stopfl/fl/CD63-GFP (السلالة#:036865، JAX). تم استخدام رفاقالتوقف fl/fl/CD63-GFP، التي لم تعبر عن CD63-GFP في غياب Cre، كأدوات تحكم. تم استخدام سلالة تقرير CD63-GFP بنجاح لتتبع الخلايا الكهربائية الخاصة بنوع الخلايا في الجسم الحي، بما في ذلك السلالات المشتقة من بطانة الرحم والخلايا العصبية30,31. نظرا لأن الأديبونكتين يعبر عنه فقط في الخلايا الدهنية الناضجة وليس في الخلايا السلفية للخلايا الدهنية (APCs)32,33، وCD63 هو علامة على EVs34، يمكن تحديد GFP+ EVs المكتشفة في الدورة الدموية والأنسجة تحديدا كأديبوتيكات أديبوتيك. وبالتالي، في هذه الدراسة، يتم تفسير GFP+ EVs التي تم اكتشافها داخل الخلايا القابلة للطيور على أنها أديEVs تم امتصاصها من قبل هذه الخلايا المؤسسة. يتيح هذا النظام الطبي المراقبة المباشرة لإفراز الحويصلات والتفاعلات المحتملة للأهداف في الجسم الحي والمختبري، مما يمكن دراسة الخلايا المقاومة للحويصلات داخل أنواع الخلايا الأخرى من أنسجة الدهون. ومن المهم أن أديEVs غنية بالدهون بشكل خاص مقارنة بالمركبات الكهربائية من أنواع الخلايا الأخرى، مما يجعلها أكثر طفو وهشاشة وصعوبة في الاستعادة باستخدام طرق الطرد المركزي الفائق التقليدية 35,36,37. يمكن أن تؤدي القوى الطردية المركزية العالية إلى تلف هذه الحويصلات أو تؤدي إلى فقدان كبير للعينات وتلوثها، مما يعقد التحليل في المراحل التالية. لتجاوز هذه القيود، قمنا بتحسين سير عمل يجمع بين عدة خطوات طرد مركزي منخفضة السرعة مع كروماتوغرافيا بتقنية استبعاد الحجم، مما يقلل من إجهاد القص، ويحافظ على سلامة الحويصلات، ويحسن النقاء والإنتاجية، مما يتيح القياس الدقيق والدراسات الوظيفية. معا، يوفر نظام CD63-GFP وهذا العزل المحسن نهجا سهل الوصول وقابلا للتكرار لدراسة إفراز ووظيفة AdEV في التداخل بين الأنسجة الدهنية وتنظيم الأيض الجهازي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا لإرشادات العناية بالحيوانات واستخدامها في كلية الطب ألبرت أينشتاين، تم توزيع الفئران الذكور على مجموعات عند درجة حرارة 22 درجة مئوية مع رطوبة نسبية تتراوح بين 30-70٪ على دورة ضوء 12 ساعة و12 ساعة ظلام ، وتم توفير وصول مؤقت للطعام والماء، وتم الحفاظ عليها على خلفية C57BL/6J.

1. الكشف في الجسم الحي للمدافع المضادة للطاقة المفرزة من خلال امتصاص ناقلات الجنود الجنود

  1. تحضير المخزن المؤقت
    1. حاجز الهضم: حضر DMEM مخبأ ب HEPES بإضافة 0.5 مل من 1 مليون HEPES و0.5 جرام من ألبومين مصل البقر الفقير بالأحماض الدهنية (BSA) إلى 50 مل من DMEM. اخلط حتى يذوب.
    2. مخزن الغسيل: جهز PBS بحمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك 2.5 مللي مول (EDTA) ومصل البقر الجيني 4٪ (FBS).
    3. جهز مخزون ليبيراز وDNase 1 بتركيز 5 ملغ/مل و5 KU/مل. تخزين عند -20 درجة مئوية. إذابته فور استخدامه فورا.
  2. جمع وعملية هضم أنسجة دهون الأرجيد
    ملاحظة: تم القتل الرحيم الجريء البالغ من العمر أربعة أشهر من AdipCD63-GFP وCD63-GFP عبر استنشاق ثاني أكسيد الكربون.
    1. قم باستئصال الأنسجة الدهنية باستخدام تقنية التعقيم ووضع 1 جرام من النسيج في 0.5 مل من حاجز الهضم، وقم بتقطيع الأنسجة ناعما باستخدام مقص معقم إلى قطع لا يزيد حجمها عن 1 مم.
    2. النسيج المفروم في 10 مل من المحلول المهضوم الذي يحتوي على 0.5 ملغ/مل ليبيراز و50 وحدة سن/مل DNase 1.
    3. حضن عند 37 درجة مئوية على جهاز هزاز مداري (100 دورة في الدقيقة) لمدة 30-60 دقيقة. اخلط الأنسجة بلطف عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات أثناء الحضانة. عندما يبدو المحلول عكما ولا تبقى أي شظايا نسيجية مرئية، يعتبر الهضم مكتملا.
  3. عزل ناقلات الجنود المدرعة
    1. قم بتخفيف التعليق بحجمين من مخزن الهضم وقلب الأنبوب بلطف 3-4 مرات.
    2. مرر عبر فلتر معقم بحجم 100 ميكرومتر لإزالة أي نسيج غير مهضوم.
    3. قم بالطرد المركزي بجهاز الترشيح عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. تخلص من الجزء الفائق للدهن الدهني ووضع علامة على الحبيبة كجزء الأوعية الدموية البثمية (SVF).
    5. حضر محلول تحلل 1× الدم الأحمر الطازج بماء معقم. قم بتحليل خلايا الدم الحمراء في SVF عن طريق الحضانة على الثلج لمدة 5 دقائق، محمية من الضوء.
    6. أضف مجلدين من محلول الغسيل، ثم قم بترشيح الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. اتبع بروتوكول مجموعة عزل السلف للأنسجة الدهنية (الفأر)، وأعد تعليق SVF في حاجز 80 ميكرولتر (PBS، pH 7.2، 0.5٪ BSA، 2 mM EDTA) لكل جرام من النسيج.
    8. أضف 20 ميكرولتر من كوكتيل استنزاف الخلايا غير الدهنية لكل جرام من الأنسجة.
    9. اخلط واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 2-8 درجات مئوية في الظلام.
    10. مرر العينة عبر عمود LS واجمع تدفق المرور.
    11. قم بعمل طرد مركزي للتدفق (سلبي ل CD31، CD45، Ter119) عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على ناقلات الدرع المدرعة للدراسة.
  4. اكتشاف أديEVs المفرزة من خلال امتصاص APC بواسطة المجهر الكونفوكلي
    1. زرع 250 ميكرولتر من APCs المعزولة (1 × 104 خلايا/مل) من فئران AdipCD63-GFP أو CD63-GFP على شرائح 8 آبار مغطاة بالكولاجين وتسمح للخلايا بالالتصاق لمدة تقارب 6 ساعات.
    2. ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهيد لمدة 10 دقائق للحفاظ على الهياكل الخلوية وEV للتصوير.
      ملاحظة: في هذه الاختبارات، تشير إشارات GFP إلى AdEVs، واكتشافها داخل APCs بواسطة المجهر الكونفوكلي يشير إلى امتصاص AdEVs بواسطة هذه الخلايا السابقة.
    3. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS، وركب بوسيط مضاد التلاشي، والتقاط إشارات GFP باستخدام مجهر كونفوكال مزود بهدف غمر زيتي بقطر 63×. احصل على الصور كمكدسات من سلسلة z بحجم خطوة 0.5 ميكرومتر، باستخدام ليزر 488 نانومتر لإثارة GFP واكتشاف الانبعاث عند 500-550 نانومتر.
  5. اكتشاف أديEVs المفرزة من خلال امتصاص APC بواسطة قياس التدفق الخلوي
    1. عد ناقلات الدرع المدرعة وصبغة التخفيف (مثل Zombie) بنسبة 1:1000 في 1X PBS. الخلايا عند 1 × 10إلى 6 لكل 100 ميكرولتر. احتضن الخلايا لمدة 20 دقيقة على الثلج، محميا من الضوء.
    2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول الغسيل. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. تعليق الخلايا في مخزن تلوين براقي عند 1 × 10إلى 6 خلايا لكل 100 ميكرولتر.
    4. امنع الارتباط غير النوع باستخدام كاشف حجب مستقبلات Fc (مثل مضاد CD16/CD32) بمقدار 1:100 على الثلج لمدة 10 دقائق.
    5. قبل الدوران من الأجسام المضادة Sca-1 عند 6,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد Sca-1 إلى أنبوب APC وحضنه لمدة 20 دقيقة على الثلج، مع تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم.
    6. اغسل مرتين باستخدام 1 مل من مخزن الغسيل، ثم استخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. تعليق الخلايا في مخزن الغسيل عند حوالي 1 × 10إلى 6 خلايا لكل 500 ميكرولتر لفرز التدفق الخلوي. جمع بيانات لخلايا Sca1+ وGFP+ على جهاز قياس تدفق طيفي مزود بليزر بنفسجي 405 نانومتر (فلتر 450/50 نانومتر ل Pacific Blue) وليزر أزرق بقطر 488 نانومتر (فلتر 530/30 نانومتر ل GFP). تحليل العينات باستخدام برنامج التشغيل الخاص بالأداة، مع وجود خلايا Sca1+ مقيدة، وتحليل مجموعة GFP+ ضمن هذه المجموعة، كما هو موضح في الشكل 2.

2. الكشف والتحليل للمكبات المضادة للطاقة السريعة المفرزة في المختبر

  1. تمايز الخلايا المدرعة المجنونة إلى الخلايا الدهنية الناضجة
    ملاحظة: جميع المزارع تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية، مع 8٪ ثاني أكسيد الكربون2 ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. اليوم 0: تغطية الصحون ب 0.2٪ جيلاتين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، استنشاق، وبذور APCs المعزولة حديثا في DMEM/F12 + 15٪ FBS + 1٪ بنسلين/ستربتوميسين (P/S) + 0.1٪ بريموسين للوصول إلى 100٪ التقاء قبل التمايز.
    2. اليوم 1-8: استبدلها بوسط تمايز أديبوجيني MesenCult (50 مل إجمالي: 45 مل من القاعدة + 5 مل من المكملات + 0.5 مل من جلوتاماكس + 50 ميكرولتر من بريموسين)، ثم غيرت إلى وسط تمايز جديد في اليوم الرابع.
    3. اليوم التاسع: غسل الخلايا الدهنية مرتين باستخدام PBS، ثم استبدلها بوسط زراعة الخلايا الدهنية الناضجة (DMEM +1٪ BSA + 0.2٪ Primocin) وحافظت عليها لمدة 16 ساعة.
  2. عزل وتنقية AdEV
    1. مرر زراعة الخلايا الدهنية بحجم 15 مل من الدرجة السابقة، أولا عبر مرشح 40 ميكرومتر ثم مرشح 30 ميكرومتر.
    2. قم بالطرد المركزي على 500 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم 2000 × جرام لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا المتبقية والحطام.
    3. مرر المصفى عبر مرشح بحجم 0.8 ميكرومتر، ثم تركيز الوسط من 15 مل إلى 0.5 مل باستخدام وحدة الترشيح الفائق بقدرة 100 كيلو دالتون (حجم عينة 15 مل) عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جرام لمدة 15 دقيقة.
    4. تحميل العينة على أعمدة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) باستخدام جامع الكسور الأوتوماتيكي وجمع الكسور F1-8.
    5. تركيز كسور EV المجمعة باستخدام وحدة ترشيح فائقة بقدرة 100 كيلو دالتون (حجم عينة 4 مل) والمضي قدما للتحقق من محتوى EV لكل جزء بواسطة النقطة الغربية، وجهاز تحليل تتبع الجسيمات النانوية، ومجهر الإلكترون النفاذي (TEM).
  3. التحقق من صحة AdEV، والقياس، وتقييم الحجم/الشكل
    1. تحليل البقعة الغربية لعلامات المركبات الكهربائية
      1. تركيز كل جزء من 400 ميكرولتر إلى 25 ميكرولتر، ثم أضف 50 ميكرولتر من محلول اختبار التقسيس المناعي الإشعاعي (RIPA) مع إضافة مثبطات للبروتياز والفوسفاتاز. قم بإزالة طبيعة العينات بإضافة 2× كبريتات الصوديوم الدودسيل (SDS) وحل البروتينات على جل تريس-جليسين بنسبة 4-12٪.
    2. تحليل حجم المركبات الكهربائية وتركيزها وجودتها باستخدام أداة تحليل تتبع الجسيمات النانوية.
      1. قبل التحليل، يتم تخفيف عينات EV باستخدام PBS معقمة بحجم 0.1 ميكرومتر مفلتر بنسبة 1:1000، لضمان أن تركيز الجسيمات يقع ضمن نطاق الكشف الأمثل (حوالي10 7-10 9 جسيمات/مل). اخلط العينات المخففة بلطف لتجنب تكون الفقاعات.
      2. تحميل العينة في الجهاز المزود بكاميرا علمية عالية الحساسية من نوع الأكسيد-المعدني-أشباه الموصلات (sCMOS)، ووحدة ليزر خضراء بطول 532 نانومتر، وعتبة كشف تبلغ 10 نانومتر (حتى 1,000 نانومتر)/ 106 إلى 109 جسيمات/مل.
      3. قم بإجراء التصوير والقياس باستخدام مجموعة برامج NS Xplorer، التي تطبق خوارزمية تركيز تعتمد على حجم الملاحظة الديناميكية.
    3. فحص شكل EV بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)
      1. أرسل 50 ميكرولتر من المركبات الكهربائية التي جمعت قبل التركيز إلى المنشأة الأساسية للتلوين السلبي للسيارات الكهربائية. طبق السيارات الكهربائية على شبكات نحاسية تحتوي على 400 شبكة تعمل فقط بالكربون والتي تم تنظيفها بالبلازما باستخدام منظف بلازما.
      2. بعد امتصاص قصير، اشطف الشبكات بالماء المقطر، ثم صبغ سلبا بنسبة 1٪ (بدون ضغط) أسيتات اليورانيل، وأزل البقعة الزائدة بورق فلتر قبل التجفيف بالهواء. ثم صور الشبكات باستخدام مجهر إلكتروني ناقل يعمل بقوة 120 كيلو فولت.

3. معلومات السلامة والنفايات

  1. أتعامل مع بارافورمالديهايد وأسيتات اليورانيل في غطاء بخاري مع معدات الحماية الشخصية (PPE)، لأن كلاهما سام. اجمع نفايات أسيتات اليورانيل في حاويات خطرة موسومة.
  2. عامل جميع العينات البيولوجية على أنها قد تكون معدية والتخلص من المواد وفقا لسياسات وبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذا البروتوكول الخاص بالكشف عن AdEVs من خلال امتصاص APC بواسطة المجهر الكونفوكلي، قمنا بعزل APCs من الأنسجة الدهنية الإربية لفئران AdipCD63-GFP وStopfl/fl/CD63-GFP وصبغناها ب DAPI لرؤية النوى. عند فحصها بواسطة المجهر الكونفوكلي، أظهرت APCs من فئران Stopfl/fl/CD63-GFP عدم وجود نقطة GFP قابلة للكشف (الشكل 1A). على النقيض من ذلك، أظهرت ناقلات APC المعزولة من فئران AdipCD63-GFP العديد من نقاط GFP المميزة في جميع أنحاء السيتوبلازم (الشكل 1B

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يملأ البروتوكول الموصوف فجوة منهجية مهمة من خلال توفير نظام قوي وقابل للتكرار لعزل وتوصيف AdEVs واستيعابها بواسطة ناقلات الجدران المدرعة. مقارنة بالمركبات الكهربائية من مصادر أخرى، فإن سيارات AdEV أكثر غناء بالدهون وطفو، مما يجعل تقنيات عزل المركبات الكهربائية الكلاسيكية المعتمدة على الطرد المركزي الفائق أقل كفاءة35. ومع ذلك، لا تزال معظم البروتوكولات المنشورة لتنقية AdEV تعتمد على الطرد المركزي الفائق، الذي يمكن أن يؤثر على شكل الحويصلات، ويؤدي إلى تجمعات EV، ويس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم أي مصلحة مالية ليعلنوا عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز أينشتاين لقياس تدفق الخلايا على نظام FACS، ومرفق التصوير التحليلي على جميع عمليات تحليل الصور. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DK128839 ومنح دعم مراكز السرطان من NCI P30CA013330.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مليون EDTA، الرقم الهيدروجيني 8.0فيشرAM9260Gتخفيف 500x
10 مرات PBSفيشر ساينتيفك70-013-032تخفيف 1000x بالماء
1 م هيبيسجيبكو15630080تخفيف 1000x
مجموعة عزل نسجة الدهون، فأرميلتيني بيوتيك30-106-639جاهز للاستخدام
مرشح أيكون ألترا الطرد المركزي، 100 كيلو دالتون MWCOسيغماUFC9100حجم عينة 15 مل
مرشح أيكون ألترا الطرد المركزي، 100 كيلو دالتون MWCOسيغماUFC9100حجم عينة 4 مل
BSAسيغماA6003جاهز للاستخدام
الأجسام المضادة الكالنيكسينكالنيكسينAB22595تخفيف 1000x
الأجسام المضادة CD63أبكامab217345تخفيف 500x
CD81تقنية إشارات الخلايا10037sتخفيف 500x
كورنينغ  BioCoat  شريحة كولاجين I الثقافيةسيغماCLS354630جاهز للاستخدام
كورنينغ  مصفاة الخلاياسيغماCLS43175040 & mu; حجم المسام
كورنينغ  مصفاة الخلاياسيغماCLS431752100 μ حجم المسام
الأجسام المضادة COX IVتقنية الإشارة الخلوية4844تخفيف 1000x
DMEMجيبكو11965092جاهز للاستخدام
DMEM/F-12، مكمل جلوتاماكسثيرموفيشر10565018جاهز للاستخدام
Dnase 1سيغماD4513المخزون 5 KU/mL عند -20 & درجة؛ C
مكمل جلوتاماكسجيبكو35050061تخفيف 100x
هالت آند تريد؛ كوكتيل مثبط البروتيز والفوسفاتاز (100X)ثيرموفيشر78444جاهز للاستخدام
الأجسام المضادة HSP70أبكامab181606تخفيف 1000x
مخزن تحلل RBC Invitrogen eBioscience 10X (متعدد الأنواع)فيشر ساينتيفك50-112-9743تخفيف الماء بمقدار 10 مرات
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPفيشر ساينتيفكNC2042225جاهز للاستخدام
مجهر لايكا ستيلاريس 8 الكونفوكالمجاهر لايكالا يوجد
درجة بحث ليبريز TMسيغماLIBTM-ROالمخزون 5 ملغ/مل عند -20 ودرجة مئوية؛ C
فلتر حقنة Millex MCEسيغماSLAA0250.8 μ حجم المسام
نانوسايت برومالفرن بلانالياليكاللا يوجد
جل بروتين نوفيكس تريس-جليسين المصغر، 4– 12%,ثيرموفيشرXP04120BOXجاهز للاستخدام
مخزن عينات Novex Tris-Glycine SDS (مرتين)ثيرموفيشرLC2676جاهز للاستخدام
الجسم المضاد للفأر Pacific Blue Ly-6A/E (Sca-1)بيو ليجند108119تخفيف 25x
محلول بارافورمالديهايد (16٪)فيشر ساينتيفك50-980-487تخفيفه إلى 4٪ باستخدام PBS
pluriStrainer S / 30 وميكرو؛ م (مصفاة الخلايا)فيشر ساينتيفكNC092245930 & mu; حجم المسام
حل بونس SسيغماP7170-1Lجاهز للاستخدام
بريموسينإنفيفوجينNC9141851تخفيف 500x
كاشف مضاد التلاشي من ProLong Gold مع DAPIتقنية الإشارة الخلوية8961Sجاهز للاستخدام
الجسم المضاد المضاد للفئران المنقى CD16/32بيو ليجند101301تخفيف 100x
مخزن RIPA  فيشر ساينتيفكPI89900تخفيف الماء بمقدار 10 مرات
جهاز قياس التدفق الطيفي (Aurora 3)سايتك للعلوم الحيويةلا يوجد
الأجسام المضادة لسينتاكسين 4الأنظمة المشبحية110042تخفيف 5000x
تيكناي 20 (المجهر الإلكتروني الناقل)FEIلا يوجد
تيرجيو-إي إمPIE Scientific LLCلا يوجد
الجسم المضاد للفينكولينأبكامab18508تخفيف 5000x

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23, 631-637 (2017).
  5. Sakers, A., De Siqueira, M. K., Seale, P., Villanueva, C. J. Adipose-tissue plasticity in health and disease. Cell. 185 (3), 419-446 (2022).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Czech, M. P. Mechanisms of insulin resistance related to white, beige, and brown adipocytes. Mol Metab. 34, 27-42 (2020).
  8. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840-846 (2006).
  9. Feng, D., et al. SNAP23 regulates BAX-dependent adipocyte programmed cell death independently of canonical macroautophagy. J Clin Invest. 128 (9), 3941-3956 (2018).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, 425-432 (1994).
  12. Scherer, P. E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., Lodish, H. F. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem. 270 (45), 26746-26749 (1995).
  13. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med. 334, 292-295 (1996).
  14. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  15. Steppan, C. M., et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 409, 307-312 (2001).
  16. Yang, Q., et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature. 436, 356-362 (2005).
  17. Tilg, H., et al. Adipokines: Masterminds of metabolic inflammation. Nat Rev Immunol. 25, 250-265 (2025).
  18. Clemente-Suarez, V. J., et al. The role of adipokines in health and disease. Biomedicines. 11 (5), 1290(2023).
  19. Hallal, S., et al. Understanding the extracellular vesicle surface for clinical molecular biology. J Extracell Vesicles. 11 (10), e12260(2022).
  20. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  21. Le Lay, S., Scherer, P. E. Exploring adipose tissue-derived extracellular vesicles in inter-organ crosstalk: Implications for metabolic regulation and adipose tissue function. Cell Rep. 44 (6), 115732(2025).
  22. Shimoda, A., et al. Exosome surface glycans reflect osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: Profiling by an evanescent field fluorescence-assisted lectin array system. Sci Rep. 9, 11497(2019).
  23. Albuquerque, P. C., et al. A Paracoccidioides brasiliensis glycan shares serologic and functional properties with cryptococcal glucuronoxylomannan. Fungal Genet Biol. 49 (11), 943-954 (2012).
  24. Li, Y., Tang, X., Gu, Y., Zhou, G. Adipocyte-derived extracellular vesicles: Small vesicles with big impact. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (7), 149(2023).
  25. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  26. Crewe, C., et al. An endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708.e13 (2018).
  27. Flaherty, S. E. 3rd, et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  28. Clement, E., et al. Adipocyte extracellular vesicles carry enzymes and fatty acids that stimulate mitochondrial metabolism and remodeling in tumor cells. EMBO J. 39, e102525(2020).
  29. Kulaj, K., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles increase insulin secretion through transport of insulinotropic protein cargo. Nat Commun. 14, 709(2023).
  30. McCann, J. V., et al. Reporter mice for isolating and auditing cell type-specific extracellular vesicles in vivo. Genesis. 58 (7), e23369(2020).
  31. Men, Y., et al. Exosome reporter mice reveal the involvement of exosomes in mediating neuron to astroglia communication in the CNS. Nat Commun. 10, 4136(2019).
  32. Jeffery, E., et al. Characterization of Cre recombinase models for the study of adipose tissue. Adipocyte. 3 (3), 206-211 (2014).
  33. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603, 926-933 (2022).
  34. Krylova, S. V., Feng, D. The machinery of exosomes: Biogenesis, release, and uptake. Int J Mol Sci. 24 (2), (2023).
  35. Crewe, C. The challenges of interrogating adipose tissue extracellular vesicle functions in physiology. Commun Biol. 5, 581(2022).
  36. Blandin, A., et al. Lipidomic analysis of adipose-derived extracellular vesicles reveals specific EV lipid sorting informative of the obesity metabolic state. Cell Rep. 42 (3), 112169(2023).
  37. Matilainen, J., et al. Increased secretion of adipocyte-derived extracellular vesicles is associated with adipose tissue inflammation and the mobilization of excess lipid in human obesity. J Transl Med. 22, 623(2024).
  38. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  39. Olson, A. L., Knight, J. B., Pessin, J. E. Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes. Mol Cell Biol. 17 (5), 2425-2435 (1997).
  40. Oh, E., Miller, R. A., Thurmond, D. C. Syntaxin 4 overexpression ameliorates effects of aging and high-fat diet on glucose control and extends lifespan. Cell Metab. 22 (3), 499-507 (2015).
  41. Merz, K. E., et al. Enrichment of the exocytosis protein STX4 in skeletal muscle remediates peripheral insulin resistance and alters mitochondrial dynamics via Drp1. Nat Commun. 13, 424(2022).
  42. Yu, X., et al. Involution of brown adipose tissue through a syntaxin 4 dependent pyroptosis pathway. Nat Commun. 15, 2856(2024).
  43. Verweij, F. J., et al. Quantifying exosome secretion from single cells reveals a modulatory role for GPCR signaling. J Cell Biol. 217 (3), 1129-1142 (2018).
  44. Arora, A., Sharma, V., Gupta, R., Aggarwal, A. Isolation and characterization of extracellular vesicles derived from ex vivo culture of visceral adipose tissue. Bio Protoc. 14 (11), e5011(2024).
  45. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Sci Rep. 7, 15297(2017).
  46. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine. 11 (4), 879-883 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesEV SecretionCD63 GFP ReporterStromal Vascular FractionAdipocyte Progenitor CellsSize Exclusion ChromatographyFlow CytometryConfocal MicroscopyNanoparticle Tracking

مقالات ذات صلة