مقالة بحثية

RNA طويل غير مشفر IRAIN يدفع إعادة برمجة الأيض المناعي في الورم الدبقي عبر محور IGF1R-JAK-STAT-BIRC5

328 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69711

⸱

ديسمبر 12, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

باستخدام التعلم الآلي المتكامل عبر عدة مجموعات، بنينا توقيعا تنبؤيا قويا ل IMRG لمرض الدبقية. يخفف IRAIN بشكل ملحوظ، ويرتبط عكسيا بالدرجة والبقاء، ويثبط إشارات IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5، ويقيد التكاثر، والهجرة، وتكوين الأوعية. تشير النتائج إلى مؤشرات IRAIN وIMRGs كمؤشرات حيوية وأهداف علاجية.

الملخص

الورم الدبقي هو ورم خبيث عدواني مع خيارات علاجية محدودة وتوقعات ضعيفة. يرتبط تقدمه ارتباطا وثيقا بإعادة برمجة الأيض والتهرب المناعي، مما يبرز الحاجة إلى تحديد منظمات جزيئية تدمج هذه العمليات. هنا، أنشأنا توقيعا تنبؤيا قويا لجين مناعي مرتبط بالاستيض المناعي (IMRG) وشرحنا دور RNA طويل غير مشفر IRAIN في تنظيم استقلاب المناعة للورم الدبقي عبر محور IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. تم تحليل البيانات النصية والسريرية من مجموعات TCGA وCGGA (693/325) وGEO (GSE43378). ضمنت الشبكات التي تعتمد على التعبيرات التفاضلية وتحليل شبكات التعبير المشترك للجينات المرجحة (β = 8) الطوبولوجيا الخالية من المقياس، وأنتج إطار عمل التحقق المتقاطع الذي يجمع بين عشرة خوارزميات تعلم آلي 101 نموذج تنبؤي. تم التحقق من صحة توقيع IMRG الأمثل المكون من 17 جينا عبر جميع المجموعات وتوقع بشكل مستقل البقاء الكلي. أظهرت الفحوصات الوظيفية أن فرط التعبير عن IRAIN يثبط IGF1R، ويثبط فسفرة JAK2/STAT3، ويخفض تنظيم BIRC5، مما يعزز الاستماتة المبرمجة ويقلل من تكون الأوعية. ارتبط انخفاض تعبير IRAIN بالتريجات المثبطة للمناعة وبلاعم M2 مع ارتفاع درجات الأورام والبيئة الدقيقة، مما يشير إلى نمط ظاهري مراوغ مناعي. تؤسس هذه النتائج أن IRAIN هو منظم رئيسي لإعادة برمجة الورم الدبقي المناعي وتحقق من توقيع IMRG كأداة تنبؤية موثوقة، مبرزة مسار IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 كجسر ميكانيكي يربط بين اختلال المناعة والأيض في الورم الدبقي ويقدم أهدافا محتملة للعلاج الدقيق.

المقدمة

يمثل الورم الدبقي أكثر الأورام الخبيثة الأولية شيوعا في الجهاز العصبي المركزي ولا يزال من بين أكثر أنواع السرطان فتكا على البشر رغم التقدم في جراحة الأعصاب والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. تتميز الأورام الدبقية عالية الدرجة، وخاصة الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM)، بالتكاثر السريع، والتسرب المنتشر، وتكرار حتمي 1,2. مؤخرا، ظهرت مجموعة من الأساليب العلاجية الفعالة، مثل التدخلات الجراحية، والعلاج المناعي، والعلاج الكيميائي3. يبقى متوسط البقاء حوالي 14-18 شهرا، حتى مع العلاج الأقصى المطلوب، مما يبرز الحاجة إلى استراتيجيات علاجية جديدة ومؤشرات حيوية تنبؤية4.

التفاعل بين بيئة الورم الدقيقة (TME) والخلايا السرطانية يدفع بشكل حاسم النمو العدواني والتباين الجزيئي للأورم الدبقية. تشارك العديد من المكونات المناعية، بما في ذلك الخلايا الدبقية الدقيقة، الخلايا العصبية الأولية، الخلايا الوعائية، والخلايا المناعية التكيفية، بشكل معقد في تشكيل TME 5,6,7. شهدت السنوات الأخيرة تقدما ملحوظا في العلاج المناعي، مما مهد عصرا تحوليا في علم الأورام. ومع ذلك، أظهرت طرق الحصار المناعي (ICB) وغيرها من الطرق المناعية العلاجية نجاحا محدودا فقط في الورم الدبقي8. ينبع فشل العلاج المناعي في هذا السياق من عدة خصائص جوهرية لبيئة الورم الدبقي الدقيقة - وهي انخفاض عبء الطفرات الورمية، وتباين الورم الواضح، وضعف نفاذية حاجز الدم والدماغ، وانخفاض تنظيم جزيئات التوافق النسيجي الرئيسية، وتسلل الخلايا التائيةبشكل متفرق 9,10,11,12.

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن البيئة الدقيقة للورم (TME)، التي تظهر خللا في الأيض، تتميز بحالات حمضية، ونقص المغذيات، وتراكم المستقلبات التي تثبط الاستجابات المناعية. تؤدي هذه الحالة لاحقا إلى خلل في الخلايا المناعية التي تتسلل إلى الأورام وتقلل من فعالية العلاج المناعي13. في الوقت نفسه، تخضع الخلايا المناعية داخل TME لتحولات أيضية تعتمد على السياق تحدد تمايزها ووظائف التأثير. على سبيل المثال، تعتمد الخلايا التائية المنشطة على التحلل السكري للتكاثر السريع، بينما تعتمد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) والبلاعم المرتبطة بالورم (TAMs)، وخاصة النوع الفرعي M2، على الفسفر التأكسدي وأيض الأحماض الدهنية للحفاظعلى نشاطها المثبط للمناعة.

لذلك، يوفر دمج التوقيعات المناعية والأيضية إطارا عقلانيا لتصنيف الأورام الدبقية بشكل أفضل والتنبؤ بتوقعات المرضى. ظهرت الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) مؤخرا كمنظمات متعددة الاستخدامات لبنية الكروماتين، ونسخ الجينات، والتعديل بعد النسخ. تم الإشارة إلى عدة أنواع من ال lncRNA في تكوين أمراض الورم الدبقي، مما أثر على التكاثر والغزو والتعديل المناعي16. من بينها، لفت نسخة IRAIN (RNA غير مشفر بمضاد IGF1R مطبوع بمضاد للحس المضاد) الانتباه لدوره في تنظيم جين مستقبل عامل النمو 1 الشبيه بالأنسولين (IGF1R) من خلال تفاعلات الكروماتين ذات التأثير المعياري (CIS)، والذي ثبت أنه يقلل من السيطرة على المنافسة غير المتحولة، خاصة في الخلايا السرطانية مثل سرطان الثدي وخطوط خلايا اللوكيميا. سرطان الحنجرة، وسرطان الدم النخاعي الحاد، الذي يؤدي مباشرة إلى زيادة تنظيم IGF1R 17,18,19. نظرا لأن إشارات IGF1R تنشط مسارات JAK-STAT وPI3K-AKT في المراحل النهائية — وكلاهما مركزي لنمو الورم وتنظيم المناعة20,21 — قد تؤثر التغيرات في تعبير IRAIN بشكل حرج على استقلاب المناعة في الورم. ومع ذلك، لم يتم بعد توضيح دور IRAIN في الورم الدبقي وتأثيره المحتمل على المشهد المناعي الأيضي. يمكن أن يوفر معالجة هذه الفجوة المعرفية رؤى ميكانيكية حول كيفية تنسيق الحمض النووي الريبي غير المشفر للتكيف الأيضي والتهرب المناعي في الورم الدبقي (glioma).

في هذه الدراسة، جمعنا بين بيانات النسخ متعددة المجموعات مع التحقق التجريبي لاستكشاف التنظيم المناعي الأيضي في الورم الدبقي (glioma). باستخدام أطر تعلم آلي متكاملة عبر مجموعات TCGA وCGGA (693/325) وGEO (GSE43378)، حددنا توقيعا تنبؤيا قويا من 17 جينا مرتبطا بالجين المناعي المستقلب (IMRG) قادر على تصنيف بقاء المرضى عبر مجموعات البيانات. ركزنا لاحقا على IRAIN كمنظم محتمل لهذه الشبكة، نظرا لتفاعله المتوقع مع محور الإشارة IGF1R-JAK-STAT. كشفت الفحوصات الوظيفية أن فرط تعبير IRAIN يثبط تكاثر الأورام الدبقية وتكوين الأوعية الدموية من خلال تثبيط تعبير IGF1R وفسفرة STAT3 في المراحل النهائية، مما يؤدي إلى تقليل تعبير البروتين المضاد للاستماتة BIRC5 (المعروف أيضا باسم سيرفيفين). مجتمعة، تدعم هذه النتائج نموذجا عمليا يعمل فيه IRAIN كجسر ميكانيكي يربط بين تنظيم المناعة وإعادة البرمجة الأيضية في الورم الدبقي (glioma). نفترض أن اضطراب التعبير عن IRAIN يعزز تقدم الورم من خلال اضطراب هذا التوازن، مما يعزز بيئة دقيقة مثبطة للمناعة ويمنح مقاومة للعلاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الإجراءات المتعلقة بالأنسجة البشرية امتثلت للإرشادات المؤسسية وإعلان هلسنكي، وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة فوجيان الطبية (رقم الموافقة 2021KYB089). تم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المشاركين قبل الحصول على الأنسجة.

تعبير الجينات وتحليل البقاء
تم الحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي والمعلومات السريرية المقابلة من عدة قواعد بيانات عامة. 1) مجموعة TCGA: تم تنزيل بيانات RNA-seq (FPKM) ل 175 عينة من الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) و534 عينة من أطلس جينوم السرطان (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) الضوابط الطبيعية: تم تحميل ملفات تعريف التعبير ل 211 نسيج دماغي طبيعي و662 نسيج ورم دبقي من قاعدة بيانات زينا في UCSC (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) التحقق الخارجي: تم الحصول على بيانات من CGGA693 و CGGA325 من أطلس جينوم الورم الدبقي الصيني (http://www.cgga.org.cn); 4) مجموعة بيانات GEO: تم تنزيل مجموعة البيانات GSE43378، التي تحتوي على بيانات التعبير والسريرية ل 50 عينة من الورم الدبقي (50)، من مجموعة التعبير الجيني (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). تم تحويل جميع بيانات العد الخام إلى نسخ لكل مليون (TPM) وتحويل اللوغارتم2. بالنسبة لمجموعات البيانات التي تم تطبيعها بالفعل، تم فحص مصفوفات التعبير لضمان توزيعات قابلة للمقارنة. تم استبعاد الجينات التي تحتوي على قيم TPM < 1 في أكثر من 80٪ من العينات. تمت إزالة المعلومات السريرية المفقودة (العمر، حالة IDH، ترميز 1p/19q، مثيلة MGMT) باستخدام تصفية الحالة الكاملة. تم تعديل تأثيرات الدفعات بين مجموعات البيانات باستخدام خوارزمية ComBat المطبقة في حزمة R sva. تم توحيد قيم التعبير بواسطة تحويل درجة z داخل كل مجموعة بيانات. تم إجراء تحليلات البقاء باستخدام حزم R البقاء وناقش الناجي. تم تقسيم المرضى إلى مجموعات تعبير عالي ومنخفض وفقا لمستوى التعبير الوسيط ل IRAIN. تم توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة من Kaplan-Meier، وتم تقييم الدلالة الإحصائية من خلال اختبار التصنيف اللوغاريتمي. تم تقدير نسب المخاطر (HRs) وفترات الثقة 95٪ باستخدام نماذج Cox النسبية للانحدار للمخاطر.

تعريف مجموعات الجينات المناعية والأيضية
تم الحصول على الجينات المرتبطة بالمناعة (IRGs، n = 2,483) من قاعدة بيانات ImmPort (https://www.immport.org/shared/)، وتم الحصول على جينات مرتبطة بالاستقلاب (MRGs، n = 948) من قاعدة بيانات التواقيع الجزيئية (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). تم تعريف المجموعة المجمعة من هذه الجينات بأنها جينات مرتبطة بالاستيض المناعي (IMRGs). وقد خدمت هذه القوائم الجينية كمراجع للتعبير التفريقي والتحليلات الشبكية اللاحقة.

تحليل شبكات التعبير التفاضلي وتحليل شبكات التعبير المشترك للجينات المرجحة
تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) بين أنسجة الدماغ والورم الدبقي الطبيعية باستخدام حزمة R limma. تم تزويد بيانات التعبير بنموذج خطي تلاه تعديل بايز التجريبي. الجينات التي تتغير طية |log₂| تم اعتبار > 1.5 ومعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) < 0.05 معبرين بشكل مختلف بشكل ملحوظ. تم إجراء تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات المرجحة (WGCNA) باستخدام حزمة R WGCNA. تم استبعاد العينات الشاذة من خلال التجميع الهرمي. تم ضبط قدرة العتبة الناعمة على β = 8 لتحقيق مؤشر ملاءمة للطوبولوجيا خالية من المقياس (R2 ≥ 0.85) مع الحفاظ على متوسط الاتصال الكافي. تم بناء مصفوفات تداخل طوبولوجي (TOM)، وتم تجميع الجينات في وحدات بحجم لا يقل عن 50 باستخدام خوارزمية قطع الشجرة الديناميكية. تم ربط جينات الوحدة الذاتية بالصفات السريرية، وتم اختيار الوحدة الأكثر ارتباطا بالورم الدبقي (r > Pearson's 0.7, P < 1×10-10) لتحديد جين المحور.

بناء نماذج تنبؤية قائم على تعلم الآلة
تم تطبيق إطار عمل شامل للتحقق المتقاطع (LOOCV) يدمج عشرة خوارزميات تعلم آلي لبناء وتقييم نماذج التنبؤ. تم تنفيذ 101 سير عمل تركيبي باستخدام مجموعة TCGA كمجموعة بيانات تدريبية. تم التعرف أولا على الجينات المرتبطة بالتمثيل المناعي (IMRGs) المرتبط بالتوقعات من خلال انحدار كوكس أحادي المتغير (P < 0.05). تم تحديد النموذج الأمثل من خلال تعظيم متوسط مؤشر توافق هاريل (C-index) عبر ثلاث مجموعات بيانات تحقق (CGGA693، CGGA325، و GSE43378). أظهر نموذج RSF-Enet الناتج (α = 0.3) أعلى أداء تنبؤي وحافظ على قابلية تعميم قوية عبر مجموعات مستقلة22.

التوتر المتوسط والتسلل المناعي
لتوصيف المشهد المناعي الوراثي بشكل شامل، استخدمنا نهجا تحليليا متعدد المستويات. أولا، تم قياس مستويات التسلل المناعي والبسكوميالي باستخدام خوارزمية ESTIMATEرقم 23. ثم تم تقييم التعبير التفاضلي لجزيئات نقاط التحقق المناعية الرئيسية، بما في ذلك PDCD1 وCTLA4 وLAG3، من خلال تحليل قائم على ليما، وتم عرض الارتباطات بين جينات نقاط التحقق باستخدام مصفوفات الارتباط. تم استخدام ملفات الطفرات الجسدية من 903 عينة من الورم الدبقي في مجموعة TCGA لحساب درجات عبء الطفرات الورمية (TMB)، وعدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة (MSI)، وضعف واستبعاد المناعة الورمية (TIDE) للتنبؤ بالاستجابات المحتملة للعلاج المناعي. تم تقسيم المرضى لاحقا إلى أربع مجموعات تنبؤية بناء على حالة TMB المجمعة (عالية/منخفضة) ودرجات المخاطر (عالية/منخفضة)، وتمت مقارنة نتائج البقاء على قيد الحياة باستخدام تحليل كابلان-ماير.

تحليل الإثراء الوظيفي
تم إجراء تحليلات إثراء مسار علم الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) باستخدام clusterProfiler في حزمة R. تم اعتبار نتائج الإثراء ذات القيم الثابتة المعدلة < 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم تصور العمليات البيولوجية المبالغ فيها، والمكونات الخلوية، والوظائف الجزيئية باستخدام مخططات نقطية ومخططات شريطية. تم بناء شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI) باستخدام قاعدة بيانات STRING (≥ 0.4) وتم تصورها في Cytoscape. تم تحديد الوحدات الوظيفية داخل شبكة PPI باستخدام خوارزمية MCODE. تم تحليل التفاعل بين الجين والجين وشبكات التعبير المشترك بشكل إضافي باستخدام GeneMANIA (https://string-db.org؛ درجة الثقة ≥ 0.4) وتم تصويرها في Cytoscape. تم تحديد الوحدات الوظيفية داخل شبكة PPI باستخدام خوارزمية MCODE. تم تحليل التفاعل بين الجين والجين وشبكات التعبير المشترك بشكل إضافي باستخدام GeneMANIA (https://genemania.org)، الذي يدمج معلومات عن التفاعلات الفيزيائية والجينية، والمسارات المشتركة، وأنماط التعبير المشتركة لاستنتاج ارتباطات وظيفية محتملة.

العينات السريرية
تم جمع أنسجة الورم الدبقي الطازجة (n = 6) والأنسجة الدماغية غير الورمية المجاورة (n = 6؛ تقع على بعد لا يقل عن 3 سم من هامش الورم وتم تأكيد خلوها نسيجيا) من مرضى يخضعون لاستئصال الأولي للورم الدبقي في مستشفى تشانغتشو التابع لجامعة فوجيان الطبية. لم يتلق أي من المرضى العلاج الكيميائي أو الإشعاعي قبل الجراحة. تم التحقق من جميع التشخيصات المرضية بشكل مستقل من قبل اثنين من أطباء أمراض الأعصاب وفقا لتصنيف منظمة الصحة العالمية لعام 2021 لأورام الجهاز العصبي المركزي. مباشرة بعد الاستئصال الجراحي، تم شطف عينات الأنسجة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) لإزالة الدم المتبقي، ثم تجمد في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية)، وتخزن عند -80 درجة مئوية حتى استخراج RNA.

خطوط الخلايا وزراعة الخلايا
تم الحصول على خطوط الخلايا الورم الدبقي البشري SHG44، U251، A172، وT98G، بالإضافة إلى الخلايا الدبقية البشرية الطبيعية (HEB)، من مستودعات موثقة وتأكد أنها خالية من تلوث الميكوبلازما قبل الاستخدام. تم الحفاظ على الخلايا في وسط النسر المعدل (DMEM، عالي الجلوكوز) من دولبيكو مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS)، 2 ملليمول L-جلوتامين، و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO. كانت الخلايا تمر كل 4-5 أيام عند الوصول إلى التقاء بنسبة 80-90٪. لتحديد خطوط الخلايا التي تفرط في التعبير والتحكم في IRAIN، تم تحويل الخلايا باستخدام ناقلات فيروسيات لينتيفيروس تحمل نسخة IRAIN كاملة الطول أو ناقل فارغ كضابط. تم اختيار نسخ مستقرة باستخدام بوروميسين (2 ميكروغرام/مل) لمدة 14 يوما. تم تأكيد كفاءة التعبيرات الزائدة من خلال اختبار PCR العكسي الكمي (qRT-PCR) قبل إجراء الفحوصات اللاحقة.

3- (4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-إيل)-2,5-ديفينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) لتحليل تكاثر خلايا الفيروس
تم زرع الخلايا في 96 صفيحة بئر بكثافة 1 × 10إلى 4 خلايا لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسط الزراعة الكامل. عند 24 و48 و72 ساعة من البذر، أضيف 20 ميكرولتر من محلول MTT (5 ملغ/مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات) إلى كل بئر وحضنه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. ثم تمت إزالة المادة الفائقة، وأضيف 150 ميكرولتر من كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) لإذابة بلورات الفورمازان. تم تحريك الطبق بلطف لمدة 10 دقائق لضمان الذوبان الكامل. تم قياس الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام مطياف الميكرولوح الفوتوفوتوميتر. تم طرح قراءات الخلفية من آبار فارغة. تم حساب صلاحية الخلايا بالنسبة لمجموعة 24 ساعة أو مجموعة الضابط (تم ضبطها ك 1.0). أجريت جميع التجارب بستة نسخ تقنية وثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة. تعبر البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD)، وتم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t ذو الذيلين.

قياس تدفق الخلايا لموت الخلايا المبرمج (Annexin V - تلوين FIC/PI)
تم زرع الخلايا عند التقاء 60-70٪ وعالجت لمدة 24 ساعة تحت الظروف المشار إليها. تم جمع الخلايا العائمة واللتصقة باستخدام تريبسين خال من EDTA، ودمجها وغسلها مرتين باستخدام PBS البارد جدا. تم إعادة تعليق حبيبات الخلايا في مخزن ربط Annexin V (10 ملليموتر HEPES pH 7.4، 140 ملي مولار NaCl، 2.5 ملي مولار CaCl2) عند 1 × 106 خلايا/مل. لكل عينة، تم حضن 100 ميكرولتر من التعليق مع 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم (PI؛ مخزون 50 ميكروغرام/مل) في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إضافة 400 ميكرولتر من حاجز الربط، تم الاحتفاظ بالعينات على الثلج وتحليلها خلال ساعة واحدة باستخدام جهاز قياس تدفق خلوي (488 نانومتر إثارة؛ 530/30 نانومتر ل FITC و>585 نانومتر ل PI). تم تضمين ضوابط مناسبة ذات صبغة واحدة وفلورية ناقص واحدة للتعويض. تم تسجيل ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة. تم تحليل البيانات بواسطة الشبكات الرباعية: السكان الحي (Annexin V⁻/PI⁻)، الموتمي المبكر (Annexin V⁺/PI⁻)، الموتيت المتأخر (Annexin V⁺/PI⁺)، والنخر (Annexin V⁻/PI⁺). تم الإبلاغ عن نسب الخلايا الموتجة المبكرة + المتأخرة (المتوسط ± SD، n = 3).

PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف حمضي من الفينول-جوانيدينيوم وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم التحقق من نقاء الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1)، وتم تأكيد السلامة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي (رقم سلامة الحمض النووي الريبي ≥ 7). تمت معالجة ميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي ب DNase I وتم نسخها عكسيا في تفاعل بسعة 20 ميكرولتر باستخدام سداسي عشوائي وأوليغو(dT) بادئية. تم تنفيذ التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، و50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم إجراء PCR الكمي في نظام بسعة 10 ميكرولتر يحتوي على 5 ميكرولتر من خليط SYBR Green Master 2×، و0.3 ميكرومولار لكل برايمر، و1 ميكرولتر من cDNA (≈ مكافئ 20 نانوغرام RNA). كانت ظروف الدورة الحرارية 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تلتها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم تحليل منحنى الصهر من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية بزيادات 0.3 درجة مئوية. تم إجراء جميع التفاعلات بثلاث نسخ، مع ضوابط بدون قالب وناقص RT. تم استبعاد قيم Ct > 35 أو نسخة تقنية من SD > 0.5. تم حساب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2⁻ΔΔCt، مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي. تم الإبلاغ عن قيم متوسط ± SD من ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة، وتم تحليل الفروق الجماعية باستخدام اختبار t ذو الذليل.

تحليل البقع الغربية
تم تحلل الخلايا على الجليد في محلول RIPA (50 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 ملم NaCl، 1٪ NP-40، 0.5٪ دي أوكسي كولات الصوديوم، 0.1٪ SDS) مع مكمل لمثبطات البروتياز والفوسفاتاز. تم حضن الليزيات لمدة 30 دقيقة على الجليد مع دوامات متقطعة وتم إزالتها بالطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم قياس تركيزات البروتين بواسطة اختبار BCA، وتم تعديله إلى 1-2 ميكروغرام/ميكرولتر، وخلطه بنسبة 1:3 مع 4× لعازل Laemmli (المخزن النهائي 1× يحتوي على 100 mM DTT). تم تغيير طبيعة العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم حل كميات متساوية من البروتين (50 ميكروغرام) بواسطة 12٪ SDS-PAGE عند 100 فولت لمدة 90 دقيقة، ثم تم نقلها كهربائيا إلى أغشية PVDF عند 250 مللي أمبير لمدة 90 دقيقة. تم حجب الأغشية بحليب خالي من الدهون بنسبة 5٪ في TBST (0.1٪ Tween-20) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (أو 5٪ BSA للفوسفوبروتينات) وحضنتها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد IGF1، IGF1R، JAK2، p-JAK2 (Y1007/1008)، STAT3، p-STAT3 (Y705)، BIRC5، و β-أكتين (التخفيف النموذجي 1:1000، β-أكتين 1:5000). بعد ثلاث غسلات مدة كل منها 10 دقائق في TBST، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ب HRP (1:5000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم غسلت مرة أخرى، وتطورت باستخدام ركيزة كيميائية متوهجة. تم قياس شدة النطاق باستخدام ImageJ، ثم تم تطبيعه إلى β أكتين أو بروتين كلي، وعبر عنه كمتوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة.

الكيمياء المناعية الخلوية
تم شطف الخلايا المزروعة على أغطية زجاجية معقمة مرتين باستخدام PBS وتثبيتها في 4٪ بارافورمالديهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات PBS، تم نفاذ الخلايا بنسبة 0.2٪ من ترايتون X-100 لمدة 10 دقائق، وتم حجبها بألبومين مصل البقري (BSA) بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة، وحضنتها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية لمادة CD31 (تخفيف بنسبة 1:200 في 1٪ BSA). بعد ثلاث غسلات PBS، تم حضن الخلايا بأجسام مضادة ثانوية متقاربة بفلور أليكسا (تخفيف 1:500) لمدة ساعة في الظلام، وصبغت بمادة DAPI (1 ميكروغرام/مل، 5 دقائق)، وتركيبها في وسط مضاد للتلاصف. تم التقاط الصور باستخدام مجهر فلوري تحت نفس إعدادات التعريض والكسب. تم قياس نسبة المساحة الإيجابية ل CD31 في خمسة حقول غير متداخلة مختارة عشوائيا لكل عينة باستخدام برنامج ImageJ. تم إجراء هذا الاختبار في نماذج الخلايا بدلا من مقاطع الأنسجة.

التحليل الإحصائي
تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام الإصدار 4.3.0 من R مع الحزم المرتبطة به. لمقارنة المتغيرات الفئوية، تم استخدام اختبار كاي-تربيع، بينما تم تقييم المتغيرات المستمرة باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتبة أو اختبار T. تم تقييم المتغيرات المستمرة من خلال معامل الارتباط لبيرسون. تم إجراء تحليلات البقاء باستخدام حزمة البقاء، والتي شملت نمذجة المخاطر النسبية لكوكس وتوليد منحنيات كابلان-ماير، مع تحديد عتبات التدرج الأمثل بواسطة حزمة الناجين وصيغة Riskscore = المعادلة 1. تم استخدام حزمة CompareC لتقييم مؤشرات C لمتغيرات مختلفة. تم توليد منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC)، الذي يهدف إلى التنبؤ بالمتغيرات التصنيفية الثنائية، باستخدام حزمة pROC. بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل المنطقة المعتمدة على الزمن تحت منحنى ROC (AUC) لمقاييس البقاء باستخدام حزمة timeROC. تم إجراء جميع الاختبارات الإحصائية بنهج ثنائي الاتجاه. تم اعتبار مستوى دلالة P < 0.05 ذو دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم تقليل تنظيم IRAIN في الورم الدبقي ويرتبط بخصائص سريرية مرضية سلبية
يتم توضيح عملية التحليل في الشكل 1. تم تقييم تعبير IRAIN لأول مرة بواسطة qRT-PCR في الخلايا النجمية الأولية، وأنسجة الورم الدبقي وخطوط خلايا الورم الدبقية. انخفضت مستويات IRAIN بشكل ملحوظ في كل من أنسجة الورم الدبقي منخفضة وعالية الدرجة وفي جميع خطوط الخلايا الدبقية الأربع (SHG44، A172، U251 وT98G) مقارنة بالخلايا النجمية الطبيعية (الشكل 2A). تماشيا مع هذه النتائج، أظهر تح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يظل الورم الدبقي واحدا من أكثر الأورام الخبيثة فتكا في الجهاز العصبي المركزي، ويتميز بتباين عميق داخل الورم ومقاومة للعلاج التقليدي. على الرغم من الاستئصال الجراحي مع العلاج الكيميائي الإشعاعي، إلا أن معدلات التكرار والوفيات لا تزال مرتفعة، وأظهر متوسط بقاء المرضى، خصوصا المصابين بالورم الأرومي الدبقي، تحسنا محدودا خلال العقود الأخيرة 4,24. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن إعادة برمجة الأيض وكبت المناعة داخل بيئة الورم الدقيقة (TME) ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر جميع المشاركين والباحثين المشاركين في مشروع تعبير الجينوم-الأنسجة (GTEx) وقواعد بيانات TCGA وCGGA على مشاركة البيانات المتاحة. وقد دعم هذا العمل مشروع تكنولوجيا الصحة في مقاطعة فوجيان (2024GG01010154) ومشروع تسلق محطات العمل للدكتوراه في مستشفى تشانغتشو (PDA202306). قدم الممول أموالا لأبحاثنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة الاستماتة Annexin V-PI  ساوثرن بيوتكنولوجي، برمنغهام، ألاباما، الولايات المتحدة الأمريكيةNAيستخدم لتقييم موت المبرمج
مجموعة الاستماتة AnnexinV-PIالتكنولوجيا الحيوية الجنوبية10010-02يستخدم لتقييم الاستماتة المبرمجة باستخدام قياس تدفق الخلايا الخلوي.
مضاد IGF1، مضاد IGF1R، مضاد JAK2، مضاد STAT3، مضاد سيرفيفين، مضاد وبيتا؛ أكتينأبكامAB182408، AB108596، AB109085، AB76424، AB8227الأجسام المضادة المستخدمة في تحليل Western Blot لمسارات الإشارات.
BiocManagerكران1.30.25تثبيت وإدارة حزم الموصلات الحيوية في R & ge؛ 3.6.
نظام Bio-Rad Cfx96الموصل الحيوي1.5.1الوصول البرمجي إلى بروتين STRING– تفاعلات البروتين.
كاريتكران0.4تعتمد على الوقت في ROC/AUC لنماذج البقاء.
أطلس جينوم الورم الدبقي الصيني (CGGA)NACGGA693 و CGGA325 يستخدم في تدقيق النماذج والتحقق من صحتها
كلاستبروفيليرالموصل الحيوي2.18.0تحليل ملفات MAF; يحسب عبء الطفرات الورمية (TMB) ومشهد الطفرات.
كوربلوتكران3.5.0رسم الرسم العام (مخططات الصناديق، مخططات الكمان، التفرق، خطوط الاتجاه).
كوكسبوستكران7.3-60stepAIC لاختيار نموذج كوكس خطوة بخطوة
Data.Tableكرانريد آر 2.1.5قراءة سريعة للملفات المحددة؛ تحكم قوي مع UTF-8.
الجرعةالموصل الحيوي3.17.0تعليق الجينات البشرية (Entrez، Ensembl، خرائط الرموز SYMBOL).
القطع الديناميكيكران1.73تحليل شبكات التعبير المشترك للجينات المرجح; اختيار سوفت ثرشولدش، توم، كشف الوحدات.
إيجرالموصل الحيوي3.56.2التعبير التفاضلي (نماذج فوم/خطية)؛ ويلكوكسون/بايز التجريبية؛ مدخلات البركان/خريطة الحرارة.
حبكة إثراءالموصل الحيوي3.26.2إثراء أنطولوجيا المرض ومساعدي GSEA (يستخدم مع clusterProfiler).
فلاشكلاستكران1.63-1قطع الفروع التكيفية لاكتشاف وحدات WGCNA.
GBMكران1.12تم الإشراف على المكونات الرئيسية لتحليل البقاء.
النسخة الشاملة للتعبير الجيني (GEO)NAGSE43378يستخدم في تدقيق النماذج والتحقق من صحتها
GEOqueryالموصل الحيويNAقم بتنزيل وتحليل مجموعات بيانات GEO.
Ggplot2كران1.0.12خرائط حرارية جاهزة للنشر لتوقيعات التعبير.
غلم نتكران3.3.1غابة بقاء عشوائية لنتائج محظورة بشكل صحيح.
الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب الموسومة ببيروكسيداز الفجل الحارأبكامAB6721الأجسام المضادة الثانوية للكشف في ويسترن بلوت.
خطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري (SHG44، U251، A172، T98G)مجموعة زراعة الأنسجة الأمريكيةNAخطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري لأبحاث الورم الدبقي (glioma). تم زراعة الخلايا ب DMEM + 10٪ FBS، و2 ملي مولار L-جلوتامين.
إيغرافكران10.0.1الوصول إلى مجموعات جينات MSigDB (مثل MRGs الأيضية)؛ إطارات مرتبة ومريحة.
برنامج Image J  ميديا سايبرنيتيكس، الولايات المتحدة الأمريكية152يستخدم للتصور
ناقل الفيروسات اللينتي فيروسي المشفر lncRNA-IRAINجينكيم، شنغهاي، الصين  NAتستخدم ناقلات اللينتيفيروس لنقل الخلايا الدبقية وخلايا HEB لإنشاء نسخ مستقرة.
ليماالموصل الحيوي3.48.0تصحيح الدفعة (ComBat) وتحليل المتغيرات البديلة.
مافتولزالموصل الحيوي1.52.0هاريل' وأدوات قياس التوافق (C index) وأدوات مقارنة البقاء.
القداسكران4.1-8نماذج كوكس المعاقبة: الحبل، التلج، والشبكة المرنة.
مسيغدبركران0.0.5طرق دعم الآلات المتجهة لبيانات البقاء.
MTTسيغما-ألدرتشM2128يستخدم في اختبارات تكاثر الخلايا.
الخلايا الدبقية الطبيعية (HEB)مجموعة زراعة الأنسجة الأمريكيةNAخط الخلايا الدبقية البشري الطبيعي للدراسات المقارنة. متلقية في DMEM + 10٪ FBS.
Org.Hs.Eg.Dbالموصل الحيوي4.8.3إثراء GO/KEGG وGSEA؛ يدعم عدة أنواع معرفية.
Pheatmapكران2.0.0قواعد علم البيانات؛ يشمل DPLYR وTidyr وPurrr وggplot2 للتعامل مع التخطيط والدبابة.
بلسركوكسكران1.5تعزيز يعتمد على الاحتمالية لنماذج كوكس.
أغشية PVDFميليبورIPVH00010الأغشية المستخدمة لنقل البروتين بعد SDS-PAGE.
Randomforestsrcكران6.0-94إعادة العينات الموحدة (بما في ذلك LOOCV)، شبكات الضبط، وخطوط أنابيب النماذج.
ريدركرانNAاسترجاع المصفوفات/الأنماط الظاهرية من UCSC Xena (مثل محاور TCGA/GTEx).
جل SDS-Page (12٪)بيو-راد185-5096النظام المستخدم في PCR الكمي.
Stringdbالموصل الحيوي1.20.3التصور لنتائج الإثراء (مخطط نقطي، مخطط cnet، مخطط ريدج).
سوبر بي سيكران1.7.7الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى متكيف مع نماذج كوكس.
سيرفكومبالموصل الحيوي3.42.4يعد التطبيع وتقدير التشتت عند الحاجة (اختياري، مكمل ليما فوم).
البقاءكران1.01-2التجميع الهرمي السريع المستخدم في WGCNA (اختياري).
Survivalsvmكران2.2.2نمذجة الانحدار المعززة المعممة (تعزيز التدرج).
سورفماينركران3.8-3نماذج كوكس للمخاطر النسبية؛ Kaplan– منحنيات ماير.
TCGAbiolinksالموصل الحيويT9039الوصول البرمجي إلى بيانات TCGA؛ قم بتنزيل/تحضير بيانات التعبير والسرير.
برنامج أطلس جينوم السرطان (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga؛ 175 جيجاب إم و534 إل جي جييستخدم في تدقيق النماذج والتحقق من صحتها
عالم التاديكران1.17.6معالجة البيانات عالية الأداء للمصفوف/الجداول الكبيرة.
تايمروككران0.5.0تصور KM وعرض جدول المخاطر.
تريزولإنفيتروجين15596026كاشف لاستخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا.
جامعة كاليفورنيا في إس سي زيناNAhttps://xenabrowser.net/datapages/يستخدم في تدقيق النماذج والتحقق من صحتها
أوكسينا تولزبيو-راد4561044يستخدم لفصل البروتينات في تحليل ويسترن بلوت.
WGCNAكران0.95مصفوفات الارتباط لجينات نقاط التحقق وعلاقات الميزات.

المراجع

  1. Goodenberger, M. L., Jenkins, R. B. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 205 (12), 613-621 (2012).
  2. Cordier, D., Krolicki, L., Morgenstern, A., Merlo, A. Targeted radiolabeled compounds in glioma therapy. Semin Nucl Med. 46 (3), 243-249 (2016).
  3. Jiang, T., et al. Clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas. Cancer Lett. 499, 60-72 (2021).
  4. Huang, X., et al. Immune-Related Gene SERPINE1 Is a Novel Biomarker for Diffuse Lower-Grade Gliomas via Large-Scale Analysis. Front Oncol. 11, 646060(2021).
  5. Cole, A. P., et al. Microglia in the Brain Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 1273, 197-208 (2020).
  6. Vitale, I., Manic, G., Coussens, L. M., Kroemer, G., Galluzzi, L. Macrophages and metabolism in the tumor microenvironment. Cell Metab. 30 (1), 36-50 (2019).
  7. Cheng, W., et al. Bioinformatic profiling identifies an immune-related risk signature for glioblastoma. Neurology. 86 (24), 2226-2234 (2016).
  8. Rodriguez, S. M. B., et al. Glioblastoma and immune checkpoint inhibitors: a glance at available treatment options and future directions. Int J Mol Sci. 25 (19), (2024).
  9. Arrieta, V. A., et al. Immune checkpoint blockade in glioblastoma: from tumor heterogeneity to personalized treatment. J Clin Invest. 133 (2), (2023).
  10. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  11. Wang, Q., et al. Tumor evolution of glioma-intrinsic gene expression subtypes associates with immunological changes in the microenvironment. Cancer Cell. 32 (1), 42-56.e6 (2017).
  12. Jansen, J. A., Omuro, A., Lucca, L. E. T-cell dysfunction in glioblastoma: a barrier and an opportunity for the development of successful immunotherapies. Curr Opin Neurol. 34 (6), 827-833 (2021).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  14. Dong, X., et al. Tumor metabolism-rewriting nanomedicines for cancer immunotherapy. ACS Cent Sci. 9 (10), 1864-1893 (2023).
  15. Kesarwani, P., Prabhu, A., Kant, S., Chinnaiyan, P. Metabolic remodeling contributes towards an immune-suppressive phenotype in glioblastoma. Cancer Immunol Immunother. 68 (7), 1107-1120 (2019).
  16. Xu, X., et al. LncRNA as potential biomarker and therapeutic target in glioma. Mol Biol Rep. 50 (1), 841-851 (2023).
  17. Sun, J., et al. A novel antisense long noncoding RNA within the IGF1R gene locus is imprinted in hematopoietic malignancies. Nucleic Acids Res. 42 (15), 9588-9601 (2014).
  18. Wang, J. Y., Liu, D., Meng, Y. D., Guo, Y. Y., Zhao, M. Aberrant allelic switch of antisense lncRNA IRAIN may be an early diagnostic marker in laryngeal cancer. Oncol Lett. 20 (4), 65(2020).
  19. Pian, L., et al. Targeting the IGF1R pathway in breast cancer using antisense lncRNA-mediated promoter cis-competition. Mol Ther Nucleic Acids. 12, 105-117 (2018).
  20. Salminen, A., Kaarniranta, K., Kauppinen, A. Insulin/IGF-1 signaling promotes immunosuppression via the STAT3 pathway: impact on the aging process and age-related diseases. Inflamm Res. 70 (10-12), 1043-1061 (2021).
  21. Cortés-Ballinas, L., López-Pérez, T. V., Rocha-Zavaleta, L. STAT3 and the STAT3-regulated inhibitor of apoptosis protein survivin as potential therapeutic targets in colorectal cancer (Review). Biomed Rep. 21 (6), 175(2024).
  22. Liu, Z., et al. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun. 13 (1), 816(2022).
  23. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  24. Ostrom, Q. T., et al. The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol. 16 (7), 896-913 (2014).
  25. Weidner, N., Semple, J. P., Welch, W. R., Folkman, J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med. 324 (1), 1-8 (1991).
  26. Perrin, S. L., et al. Glioblastoma heterogeneity and the tumour microenvironment: implications for preclinical research and development of new treatments. Biochem Soc Trans. 47 (2), 625-638 (2019).
  27. Justus, C. R., Sanderlin, E. J., Yang, L. V. Molecular connections between cancer cell metabolism and the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 16 (5), 11055-11086 (2015).
  28. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  29. Bernhard, C., Reita, D., Martin, S., Entz-Werle, N., Dontenwill, M. Glioblastoma metabolism: insights and therapeutic strategies. Int J Mol Sci. 24 (11), 9137(2023).
  30. Kesarwani, P., Kant, S., Prabhu, A., Chinnaiyan, P. The interplay between metabolic remodeling and immune regulation in glioblastoma. Neuro Oncol. 19 (10), 1308-1315 (2017).
  31. Pellegrino, M., et al. Manipulating the tumor immune microenvironment to improve cancer immunotherapy: IGF1R, a promising target. Front Immunol. 15, 1356321(2024).
  32. Zhang, W., et al. Polarization of macrophages in the tumor microenvironment is influenced by EGFR signaling within colon cancer cells. Oncotarget. 7 (46), 75366-75378 (2016).
  33. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17/regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667.e10 (2020).
  34. Pennati, M., Folini, M., Zaffaroni, N. Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions. Carcinogenesis. 28 (6), 1133-1139 (2007).
  35. Sah, N. K., Khan, Z., Khan, G. J., Bisen, P. S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin. Cancer Lett. 244 (2), 164-171 (2006).
  36. Altieri, D. C. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 79, 1327-1333 (1999).
  37. Feng, J., et al. A novel long noncoding RNA IRAIN regulates cell proliferation in non-small cell lung cancer. Int J Clin Exp Pathol. 8 (10), 12268-12275 (2015).
  38. Zhang, H., Zhang, D., Luan, X., Xie, G., Pan, X. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription (STAT) 3 signalling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells. J Int Med Res. 38 (5), 1673-1681 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة