مقالة منهجية

تحسين شاشات CRISPR-Cas9 في خلايا CAR T الآن: طريقة محسنة للتحضير في المكتبات

DOI:

10.3791/69721

⸱

يناير 2, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورنا بروتوكول فحص CRISPR-Cas9 المحسن لخلايا CAR T الأساسية. من خلال تقليل انتقال gDNA عبر الهضم الإنزيمي وسحب كاسيت sgRNA، يقلل هذا النهج من تشوهات PCR، مما يضمن الكشف الدقيق عن sgRNA والتعرف القوي على الأهداف الجينية الوظيفية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت علاجات مستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) فعالية ملحوظة في عدة أورام دموية خبيثة، ومع ذلك لم يتم تكرار نجاحها بالكامل في الأورام الصلبة. علاوة على ذلك، حتى في سرطانات الدم، يستمر الانتكاس بعد حقن خلايا CAR T في الإضرار بالنتائج طويلة الأمد. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة الملحة لتطوير استراتيجيات تعزز فعالية خلايا CAR T واستمرارها وتغلب على المقاومة الورية والبيئة الدقيقة. توفر منصات الفحص المبنية على تكرارات الباليندروميك القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR)-Cas9 نهجا قويا لتحديد الجينات التي تنظم وظيفة خلايا CAR T بشكل منهجي. من خلال ربط الاضطرابات الجينية بالنتائج الظاهرية، تمكن هذه الاختبارات من اكتشاف مسارات تتحكم في التفعيل، والتكاثر، وتكوين الذاكرة، والسمية الخلوية. تشمل سير العمل القياسية نقل أعداد كبيرة من الخلايا بمكتبة RNA موجهة واحدة (sgRNA)، وتحرير Cas9، واختيار الخلايا المعدلة، وتضخيم PCR لأغطية sgRNA من الحمض النووي الجينومي (gDNA) قبل التسلسل. ومع ذلك، فإن تضخيم PCR باستخدام كميات كبيرة من gDNA يشكل تحديات كبيرة وغالبا ما يفشل في تضخيم واسترجاع sgRNA بشكل انتقائي. هنا، نصف بروتوكول فحص CRISPR-Cas9 المحسن، والذي اختبرناه على خلايا CAR T البشرية الأولية. تتضمن الطريقة هنا خطوة وسيطة أثناء تحضير مكتبة sgRNA تقلل من انتقال gDNA عبر الهضم الإنزيمي والسحب الانتقائي لشريط sgRNA، مما يزيد من كفاءة تضخيم PCR الأول. سمح لنا هذا التعديل باسترجاع معلومات sgRNA عبر شاشات خلايا CAR T الخاصة بنا، والتي ظلت بعيدة المنال في محاولاتنا السابقة باستخدام بروتوكولات تضخيم PCR التقليدية ذات الخطوة الواحدة والثانية. في الختام، يسهل هذا السير المحسن تحضير مكتبة فحص كريسبر في العينات الصعبة وتمكين تحديد المحددات الجينية الرئيسية التي يمكن استهدافها لتحسين فعالية العلاج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أحدث العلاج المناعي ثورة في علاج السرطان، مقدما استراتيجيات جديدة لاستغلال وتعديل جهاز المناعة. من بين هذه الأساليب برز علاج الخلايا التائية بمستقبل المستضدات الكيميرية (CAR) كأحد أكثر الأساليب تحولية. يتضمن هذا العلاج الهندسة الوراثية لخلايا T للمريض خارج الجسم الحي باستخدام مستقبل صناعي مصمم للتعرف على مستضد ورم محدد، مما يعزز نشاط مضاد الأورام1. أظهرت خلايا CAR T نجاحا ملحوظا في الأورام الدموية، مع نتائج تتراوح بين هدوء قصير الأمد إلى بقاء طويل الأمد بدون مرض مع سمية قليلة في المرضى الذين يتلقون علاجات CD19 أو BCMA2. حتى الآن، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على سبعة منتجات من خلايا CAR T لعلاج سرطانات الدم3. رغم هذه التقدمات، لا تزال هناك قيود كبيرة. تنشأ التحديات من منتج خلية CAR T نفسها، وغالبا ما تتأثر بعملية التصنيع أو لياقة خلايا T لدى المريض، والتي قد تتأثر بتقدم المرض، أو العلاجات السابقة، أو التقدم في العمر. آليات المقاومة الداخلية للورم، مثل تقليل تنظيم المستضدات، يمكن أن تؤثر أيضا على فعالية4. علاوة على ذلك، تشكل البيئة الدقيقة للورم المثبط للمناعة حاجزا إضافيا يحد بشدة من استمرارية ووظيفة خلايا CAR T ووظائفها، خاصة في المرضى الذين يعانون من ورم صلب5. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتعزيز الفعالية الأولية وطويلة الأمد لعلاجات خلايا CAR التائية.

وقد وفر ظهور تحرير الجينات بتقنية CRISPR-Cas9 أدوات قوية لتحليل وظيفة الجينات من خلال أساليب فحص واسعة النطاق. في هذه الفحوصات، يتم تحويل الخلايا بمكتبة RNA موجهة واحدة (sgRNA)، عادة ما يتم توصيلها عبر ناقلات فيروسات عدسية، مما يضمن وجود sgRNA واحد لكل خلية وتكامل جينوم مستقر. بعد التحرير واختيار الخلايا المحولة بواسطة Cas9، يتم استخراج الحمض النووي الجيني (gDNA)، وتضخيم أشرطة sgRNA بواسطة PCR لتحضير المكتبة. يمكن التسلسل عالي الإنتاجية بعد ذلك من قياس توزيعات sgRNA عبر أنماط ظاهرية مختلفة، وبالتالي تحديد الجينات التي تنظم العملية بشكل إيجابي أو سلبي تحت الدراسة6.

تم تطبيق فحص كريسبر على نطاق واسع لاستكشاف بيولوجيا الخلايا التائية، ومؤخرا لتعزيز أداء خلايا CAR التائية. حددت الشاشات الجينومية على مستوى الجينوم منظمات لعمليات الخلايا التائية الأساسية، بما في ذلك التنشيط، والتكاثر، والتمايز. على سبيل المثال، تم تحديد FAM49B كمنظم لإشارات مستقبلات الخلايا التائية7، بينما أظهرت SOCS1 وTCEB2 وRASA2 وCBLB ضرورية للتكاثر بعد التحفيز8. بعيدا عن هذه المسارات الأساسية، كشف فحص كريسبر أيضا الجينات المشاركة في ذاكرة الخلايا التائية وإنزافها. حددت الدراسات في الجسم الحي Fli1 كمرشح لتعزيز استجابات المؤثر دون تعطيل الذاكرة أو مقدمات الإجهاد9، وأن جهاز إعادة تشكيل الكروماتين Arid1a كمنظم يقلل فقدانه من استنزاف الخلايا التائية10. كما تم توصيف منظمي تمايز مساعد T من النوع 2 (Th2) بهذا النهج11. باستخدام مكتبة sgRNA مخصصة تستهدف 25 كيناز، وجد أن p38 يعزز التوسع وتكوين الذاكرة والحماية من الإجهاد التأكسديوالجينومي 12. وبالمثل، منح اختبار REGNASE-1 الضربة القاضية في خلايا T CD8+ نمطا ظاهريا مؤثرا طويل العمر حسن السيطرة على الأورام في الميلانوما واللوكيميا في نماذج13. حددت شاشات جينوم إضافية على مستوى الجينوم Dhx37 كمنظم لتنشيط الخلايا التائية وسمية الخلايا14، بينما تم التحقق من صحة LTBR وجينات أخرى كمحسنات لوظيفة الخلايا التائية في CAR T وγδ T15. مؤخرا، تم تطبيق فحص كريسبر مباشرة على خلايا CAR T، كاشفا عن أهداف جديدة مثل PRODH2، وهو إنزيم يشارك في استقلاب البرولين يعزز النشاط المضاد للأورام16، وTLE4 وIKZF2، اللذين حسن تعطيلهما فعالية CAR T في النماذج 17 من الورم الأرومي الدبقي17.

خطوة حاسمة في شاشات كريسبر هي بالضبط التضخيم الانتقائي لأشرطة sgRNA من كميات كبيرة جدا من الحمض النووي الجليدي، وهو تحد يصعب تجاوزه نظرا للعدد الهائل من الخلايا المستخدمة في فحوصات كريسبر. تضخيم PCR الناتج عن هذه الكميات الكبيرة من الحمض النووي يطرح عدة تحديات تقنية، بما في ذلك التكدس الجزيئي الذي يحد من انتشار جزيئات الحمض النووي والبوليميراز، والارتباط غير المحددي المؤقتة بين البرايمرات والبوليميراز بخلفية الحمض النووي، والتضخيم خارج الهدف مما يؤدي إلى استنزاف البرايمر، أو احتجاز Mg2+ بواسطة العمود الفقري لفوسفات الحمض النووي، من بين تحديات أخرى18. 19، 20، 21. غالبا ما تؤدي هذه العوامل إلى فشل PCR و/أو التحيز. لتخفيف هذه المشكلات، تم اقتراح استراتيجيات مختلفة، منها فصل تضخيم sgRNA من إضافة المحول إلى خطوتين ل PCR22، واستخدام إثراء الأهداف باستخدام أوليغوات بيوتينيلية والتقاط الخرزات المغناطيسية23,24، أو تصميم بلازميدات بمواقع تقييد تحيط بكاسيت sgRNA لإثراء الشظايا25.

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكول فحص CRISPR-Cas9 المحسن لخلايا CAR T البشرية الأولية. مكتبة كريسبر المستخدمة هي برونيلو كينوم 1، وهي مكتبة تحتوي على 3052 sgRNA فريدة بطول 20 طن طن تستهدف 763 جين كيناز بشري (4 sgRNA لكل هدف). تم عزل الخلايا التائية من خلال اختيار مغناطيسي إيجابي CD4+ وCD8+ من نسبة عينات الدم الغنية بالخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) من متبرعين أصحاء. عند تفعيل الخلايا التائية باستخدام مضاد CD3 ومضاد CD28، تم تصويب الخلايا التائية بمكتبة فحص كريسبر، ثم تم تحويلها إلى فيروس CAR لينتيفيرس. تم توسيع الخلايا ثم تغذيتها على النواة لإدخال بروتين Cas9. تم اختيار الخلايا الحاملة ل كريسبر باستخدام البورومايسين، وتم فرز خلايا T الموجبة ل CAR. بعد الاستخلاص، تم هضم الحمض النووي الجينومي باستخدام إنزيمات التقييد (RE)، وتم سحب الشظايا التي تحتوي على sgRNA بواسطة التقاط البيوتين المجبار-ستربتافيدين. بعد ذلك، تم تضخيم وفهرسة sgRNA بشكل انتقائي عبر مراجعتين متتاليتين للتحليل البدني، وتم تسلسل المكتبات الناتجة. من خلال دمج خطوة وسيطة لتقليل انتقال gDNA، تمكنا من استرجاع وتضخيم sgRNA الخاص بنا بشكل انتقائي، مما يسمح لنا بدراسة دور الكينازات في خلايا CAR التائية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا لإرشادات جامعة نافارا. جميع المشاركين يقدمون موافقة مكتوبة ومستنيرة. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل وتنشيط الخلايا التائية

  1. عزل PBMC
    1. جمع عينات دم من المتبرعين على أنابيب حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA)، نقل عينات الدم إلى أنابيب مخروطية بحجم 50 مل، وتخفيف الدم باستخدام PBS (التخفيف 1:1).
    2. أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى قاع أنبوب مخروطي بحجم 50 مل (الكثافة لأنابيب PBMCs: 1.07). ثم أضف بعناية 25 مل من الدم المخفف فوق طبقة الوسط التدرج للكثافة (أبطأ سرعة لوحدة التحكم في الماصة). جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 800 × جرام بدون فرامل.
    3. اجمع حلقات أو طبقة PBMC مع ماصة باستور في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل وأضف PBS إلى حجم إجمالي 50 مل للغسل. الطرد المركزي عند 650 × جرام لمدة 8 دقائق. تخلص من السوبرناتانت.
      ملاحظة: تحقق من عكارة المادة الفائقة للتأكد من عدم وجود خلايا هناك. إذا كنت في حالة شك، قسم نظام التعليق إلى ضعف عدد الأنابيب المخروطية الأصلية بحجم 50 مل، أضف PBS حتى 50 مل، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى.
    4. أعد تعليق 50 مل من PBS. عد باستخدام يوديد الأكريدين البرتقالي-بروبيديوم (AOPI) في عداد الخلايا. الطرد المركزي عند 650 × جرام لمدة 8 دقائق.
  2. اختيار المغناطيسي CD4 وCD8
    1. تحضير مخزن الفرز الخلوي المنشط بالفلورة (FACS): PBS، EDTA 2.5 ميكروM، BSA 0.5٪ وفلتر عبر 0.2 ميكرومتر.
    2. أعد تعليق PBMCs في 80 ميكرولتر من التعقيم المؤقت FACS لكل 10 ×10 6 خلايا، وأضف 10 ميكرولتر من الحبيبات الدقيقة CD4 و10 ميكرولتر من الحبيبات الدقيقة CD8 لكل 10 ×10 6 خلايا. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    3. أضف 10 مل من مخزن FACS وجهاز الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 650 × جرام. تخلص من السوبرناتانت تماما.
    4. أعد تعليق 500 ميكرولتر لكل 1 × 108 خلايا من مخزن FACS في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
      ملاحظة: يمكن للمسار أن يتسع لمسافة 200 ×10 خلايا بست خلايا.
    5. استخدم برنامج Possel لعزل AutoMac (فرز الخلايا المغناطيسية عالية السرعة).
    6. أضف حتى 10 مل من PBS، والعد باستخدام AOPI في عداد الخلايا الفلورية، واستخدم الطرد المركزي عند 650 × جرام لمدة 8 دقائق.
    7. أعد تعليق الخلايا 1 × 106/مل في وسط نمو الخلايا التائية يحتوي على 3٪ مصل بشري (HS)، 1٪ بنسلين/ستربتوميسين (P/S)، 625 IU/mL إنترلوكين (IL)-7، 85 IU/mL IL-15. أضف 10 ميكرولتر من مادة تحفيز الخلايا التائية لكل 1 مل وامزج جيدا. ضع صفيحة بسعة 2 مل لكل بئر في صفيحة بسعة 24 بئر (p24w) واحتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

2. إنتاج خلايا CAR T وفحص CRISPR

  1. تلوث المكتبة وتحويل CAR
    1. أضف الكمية المقابلة من مكتبة CRISPR الخاصة بفيروس العينتي (مثل مكتبة برونيلو كينومي 1). انظر الجدول التكميلي 1)، الذي تم تحديده باختبار المعايرة، و8 ميكروغرام/ملتر بوليبرين.
    2. قم بالعدوى بالطرد المركزي عند 700 × جرام لمدة ساعة ونصف دقيقة عند 32 درجة مئوية.
    3. استبدل الوسط بوسط نمو خلايا تائية طازج يحتوي على 3٪ HS، 1٪ P/S، 625 IU/mL IL-7، 85 IU/mL IL-15 (الخلية النهائية =10 6 خلايا/مل).
    4. بعد 6 ساعات، أضف الكمية المقابلة من ناقل CAR الفيروسي العدسي إلى مضاعفة العدوى (MOI) بقيمة 3 واحتضن لمدة 4 أيام.
  2. التقميص الكهربائي Cas 9
    1. اجمع خلايا CAR T واغسلها مرة واحدة باستخدام PBS، وعد الخلايا باستخدام AOPI في عداد الخلايا الفلورية.
    2. جهز 4 ميكرومولار Cas9 في مخزن الاختراقية.
    3. أعد تعليق خلايا CAR T في 50 ميكرولتر لكل 5 × 106 خلايا. اخلط وأضف بعناية 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من شريط كوفيت متعدد الآبار دون تكوين فقاعات. ثم، باستخدام رأس الماصة، أزل أي فقاعات محتملة ومرر الطرف على حواف البئر.
      ملاحظة: إذا ترك أي بئر في الكوفيت بدون عينة، أضف نفس حجم مخزن التقشير الكهربائي. هذه خطوة حاسمة: إذا اكتشف الجهاز فقاعة أو فرق في الحجم، فسيعطي خطأ.
    4. استخدم برنامج توسيع خلية T 3 لنووية الخلايا التائية CAR.
    5. اترك الخلايا في الكوفيتات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    6. أعد تعليق الخلايا المكونة من النواة في وسط نمو الخلايا التائية الذي يحتوي على 3٪ HS، 1٪ P/S، 625 وحدة دولية/ملتر IL-7، 85 وحدة دولية/ملتر IL-15 (الخلية النهائية = 106 خلايا/مل) وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  3. اختيار البوروميسين
    1. عد مع AOPI في عداد الخلايا الفلورية.
    2. عدل إلى 1 ×10 6 خلايا/مل مع وسط نمو الخلايا التائية يحتوي على IL7 و IL15.
    3. أضف بوروميسين (2.5 ميكروغرام/مل) إلى الوسط.
    4. عد الخلايا كل يومين لمدة 6 أيام وضبط إلى 1 ×10 6 خلايا/مل مع وسط نمو الخلايا يحتوي على 3٪ HS، 1٪ P/S، 625 IU/mL IL-7، 85 IU/mL IL-15، و2.5 ميكروغرام/مل بورومايسين.
    5. تحقق من نسبة CAR.
  4. فرز مجموعات خلايا CAR T وتخزين العينات (حبيبات الخلايا الجافة) عند -80 درجة مئوية.

3. عزل الحمض النووي الجيكي إن

ملاحظة: تجنب أي فقدان للخلايا أو الحمض النووي الغنوي خلال العملية، لأن ذلك قد يؤثر على تمثيلية sgRNAs. استهدف تغطية sgRNA لا تقل عن 500 مرة.

  1. استخلاص الحمض النووي من العينات باستخدام مجموعة استخراج الخلايا والأنسجة. اخرج مرتين لتعظيم استعادة الحمض النووي الجيني.
    ملاحظة: لا تستخدم أكثر من 4 ×10 6 خلايا/عمود لاستعادة الحمض النووي الكلي بشكل أكثر كفاءة.
  2. قس تركيز gDNA باستخدام مجموعة قياس dsDNA.
    ملاحظة: إذا كان التركيز منخفضا جدا للخطوات التالية في البروتوكول، استخدم كاشف تنظيف قائم على الخرزات الصلبة القابل للعكس (SPRI) لتركيز الحمض النووي.

4. إثراء شريط sgRNA (والقضاء على انتقال gDNA)

  1. هضم إنزيمات التقييد
    1. هضم حد أقصى 5 ميكروغرام gDNA مع 20 وحدة من الإنزيم/ثانية (مثلا، لعمود lentiGuide-puro للعمود الفقري لمكتبة برونيلو كينومي 1 استخدم الجمع بين NdeI وPspXI) في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. قم بتوسيع عدد التفاعلات لتحقيق التمثيل المطلوب ل sgRNA.
      ملاحظة: اختر إنزيمات التقييد التي تقطع في المناطق الجانبية من الكاسيت، لكن ضع في اعتبارك أن بعض sgRNA قد تحتوي على موقع تقييد. هذه ال sgRNA ستضيع في هذه الخطوة، ولن تظهر في التسلسل. غياب هذا الدليل يعمل كوسيلة للتحكم في عملية الهضم. يعرض الجدول التكميلي 1 قائمة ب sgRNA في كينووم 1 التي تم تقسيمها بواسطة PspXI وNdeI.
    2. حضن الغرفة طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية في جهاز دورة حرارية.
    3. قم بتنظيف SPRI مرتين مرتين.
      1. جهز 10 مل من محلول الإزالة (EB) (10 ملليمتر ثلاثي HCl، درجة حموضة 8.0) و50 مل من الإيثانول الطازج بنسبة 70٪.
      2. قم بتدوير الخرزات وإضافة 100 ميكرولتر إلى حاصل الهضم.
      3. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بالماصات واحتضن لمدة 5 دقائق. قم بالمغناطيسية لمدة 5 دقائق أخرى.
      4. أثناء وضع المغناطيس، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ دون إزعاج الحبيبة. انتظر 30 ثانية، ثم تخلص من السوبرناتانت.
      5. كرر الخطوة 4.1.3.3 ليصبح المجموع غسلتين. اترك الخرزات لتجف لمدة دقيقتين.
      6. قم بإزالة القطرات من المغناطيس، وإضافة 40 ميكرولتر من مخزن التسهيل، وإعادة تعليق الخرزات عن طريق التوصيل بالماصات. احتضن لمدة دقيقتين.
      7. قم بالمغنطة لمدة دقيقتين ثم انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد.
        ملاحظة: عند إعداد هذا البروتوكول لأول مرة، تحقق من الهضم من خلال الرحلان الكهربائي (الشعيرية). تأكد من ملاحظة التشويه.
  2. سحب شريط sgRNA للأسفل للسحب.
    1. تحضير خرز مغناطيسي من نوع ستربتافيدين.
      1. تحضير محلول الغسيل/الربط 2x: 10 مللي ميل Tris-HCl pH 7.5، 2 M NaCl، 1 mM EDTA. قم بتخفيف نصف الحجم ب H2 O إلى 1x.
      2. قم بتدوير الخرزات لمدة دقيقة واحدة.
      3. انقل حجم الخرزات المطلوب إلى أنبوب (عادة 1 ملغ يكفي)، أضف حجما مساويا من محلول الغسيل/الربط مرة واحدة، أو على الأقل 1 مل، ثم أعد تعليقه.
      4. ضع الأنبوب على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة وتخلص من السوبرناتانت.
      5. أزل الأنبوب من المغناطيس وأعد تعليق الخرزات المغسولة بنفس حجم حجم الغسيل/الربط 1x كما هو حجم الخرزات المأخوذة من القارورة.
      6. كرر العملية ليصبح المجموع 3 غسولات.
      7. أعد تعليق الخرزات في حاجز غسيل/ربط مرتين.
    2. أضف 5 ميكرولتر من بادئات سحب 10 ميكرومول المدرجة في الجدول 1 إلى الهضم المنقى من الخطوة 4.1.3.6.
    3. حضن في حمام جاف عند 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم أحضره للبرد فورا لمدة 5 دقائق.
    4. أضف 1 ملغ من خرز الستربتافايدين المغناطيسي المغسول مسبقا.
      ملاحظة: ربط البيوتين والستريبتافيدين يعمل بشكل أفضل عند 1 مليون NaCl. تأكد من خلط كميات متساوية من الخرزات والحمض النووي البيوتينيل.
    5. حضن الخليط لمدة 20 دقيقة مع إعادة تعليق الخليط كل 4 دقائق.
    6. قم بالمغناطيسية لمدة 5 دقائق.
    7. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 1× محلول غسيل/ربط واحد.
    8. أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولتر من EB 8.0.
      ملاحظة: أشرطة sgRNA المستخدمة هنا مرتبطة بخرز الستريبتافيدين. لا تتخلص منها.

5. تحضير مكتبة sgRNA

  1. PCR1
    1. جهز خليط PCR1 مع 20 ميكرولتر من هيركولاز 5x buffer، و1 ميكرولتر من dNTP (100 ملليمتر)، و1 ميكرولتر من بوليميراز DNA، و2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومول من البرايمر الأمامية والعكسية PCR1 المدرجة في الجدول 1، و23 ميكرولتر من ماء بدرجة PCR. اخلط البيبيت وأضف خليط PCR1 إلى الخرز من الخطوة 4.2.8.
      ملاحظة: يسرد الجدول 1 بادئات PCR1 المصممة لمكتبة برونيلو كينومي 1.
    2. ضع الأنابيب في جهاز دورة حرارية وشغل برنامج PCR1 الموضح في الجدول 2.
      ملاحظة: تأكد من أن جهاز التدوير الحراري يمكنه استيعاب تفاعلات بسعة 100 ميكرولتر. وإلا، فأضيف تفاعلات 50 ميكرولتر. قم بالتوسع حسب الحاجة.
    3. اجمع جميع PCR1 من نفس العينات في أنبوب واحد.
    4. تنظيف PCR1 باستخدام 150 ميكرولتر (1.5x) من الخرزات (اتبع الخطوات 4.1.3.3-4.1.3.7). أعد تعليق كل تفاعل PCR في 100 ميكرولتر من EB 8.0.
      ملاحظة: إذا قمت بإعداد هذا البروتوكول لأول مرة، تحقق من حجم وجودة منتج PCR بتشغيل 2 ميكرولتر من منتج PCR ب 30 دورة في نظام الرحلان الكهربائي الشعري (مثل أنظمة TapeStation من Agilent).
  2. PCR2
    1. تحضير خليط PCR2 مع 10 ميكرولتر من ناتج PCR1، و10 ميكرولتر من محلول 5X، و0.5 ميكرولتر من dNTP (100 ملليمتر)، و1 ميكرولتر من بوليميراز DNA، و1.25 ميكرولتر من بادئات PCR2 بقوة 10 ميكرومولار للأمام والخلف المدرجة في الجدول 1 (استخدم تركيبة مختلفة من rP7-i7-BC وP5-i5-BC لكل عينة)، و26 ميكرولتر من ماء بدرجة PCR ليصبح الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: للحفاظ على تمثيل المكتبة، قم بإجراء تفاعل PCR2 واحد لكل 104 تراكيب في المكتبة.
    2. ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري وشغل برنامج PCR2 الموضح في الجدول 2.
    3. تنظيف PCR2 باستخدام 75 ميكرولتر (1.5x) من الخرزات (اتبع الخطوات 4.1.3.3-4.1.3.7). أعد تعليق كل تفاعل PCR في 50 ميكرولتر من EB 8.0.
  3. قم بقياس PCR2 (أي مكتبة sgRNA) باستخدام مجموعة قياس dsDNA والتحقق من حجم المضخمات بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري (مثل أنظمة TapeStation). جمع العينات.
  4. تسلسل على آلة إلومينا.
    ملاحظة: بالنسبة لمكتبة 3052 sgRNA Brunello Kinome 1 هنا، عادة ما يكون عمق التسلسل بين 100-200 مليون قراءة لكل عينة كافيا.

6. التحليل

  1. عينات Demultiplex باستخدام bcl2fastq.
  2. تحقق من جودة ملفات fastq التي يتم إنشاؤها بواسطة FastQC.
  3. استخرج تسلسل sgRNA باستخدام تسلسل الكاسيت الذي يحيط ب sgRNA كنمط معين، بالإضافة إلى طول الدليل (20 nt).
  4. قم بمحاذاة التسلسل المستخرج مع مرجع المكتبة باستخدام Bowtie2 للتحقق من عدد الأدلة الافتراضية التي هي sgRNA أصلية من المكتبة. استخدم samtools لتحويل ملف SAM الذي يحتوي على معلومات عن المحاذاة إلى صيغة BAM وإنشاء ملفات ملخصة.
  5. عد وتطبيع عدد القراءات لكل sgRNA في العينات المعدلة والضابطة باستخدام دالة العد من برنامج MAGecK.
  6. قارن العد مع وظيفة اختبار MAGecK للحصول على درجات RRA وقائمة الجينات المرشحة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو موضح في قسم البروتوكول، تم توليد خلايا T من CAR وفقا للبروتوكول26 الذي تم إثباته. بالنسبة لفحص كريسبر، قمنا بتكييف سير العمل الذي طوره وانغ وآخرون (الشكل 1A). لفترة وجيزة، تم عزل الخلايا التائية من متبرعين مستقلين وتفعيلها لمدة 24 ساعة قبل النقل المتتالي باستخدام كل من مكتبة CRISPR sgRNA وناقل CAR، ليصل إلى 67 و72٪ خلية إيجابية ل CAR في اليوم الخامس. تم تجميع جزء من الخلايا ببروتين Cas9 لتحفيز الإغلاق، بينما كانت الخلايا المتبقية تشكل نقطة أساس لتمثيل sgRNA. تم اختيار الخلايا المحولة مع المضادات الحيوية، وتم فرز مجموعات سكانية مميزة لاحقا وفقا للأنماط الظاهرية قيد الدراسة. تمت مراقبة تكاثر خلايا CAR T عبر الشاشة باستخدام عد الخلايا المعتمد على AOPI وعبر عنه كتغير في الطية (الشكل 1B). بعد مكملات بوروميسين في الأيام 8 و10 و12، أكدنا نجاح إثراء خلايا CAR T المحولة بمكتبة كريسبر في كلا المتبرعين، كما يتضح من استمرار البقاء والتكاثر. تم استخدام خلايا T غير المحولة (UTD) وخلايا CAR T التي تفتقر إلى تحويل مكتبة كريسبر كضوابط لاختيار المضادات الحيوية.

بعد استخراج الحمض النووي الجيني، تم إعداد مكتبات sgRNA عبر تضخيم PCR. لتجاوز المشاكل الناتجة عن نقل مفرط ل gDNA، طبقنا بروتوكولا يتضمن هضم إنزيمات التقييد وسحب البيوتين-ستربتافيدين لشريط sgRNA (الشكل 2A,B). تم هضم gDNA باستخدام إنزيمات تقييد NdeI وPspXI تستهدف مواقع استهداف شريط sgRNA (الشكل 2C). تم استخدام أوليغو البيوتينيلي، المصممة للارتباط في أعلى مواقع تلدين برايمر PCR1، لالتقاط شظايا كاسيت sgRNA، ثم سحبها بواسطة خرزات الستربتافيدين للقضاء على gDNA المنتقل. ثم تم تضخيم الشظايا التي تحتوي على sgRNA بشكل انتقائي (الشكل 2D) وتم فهرستها عبر جهازين متتاليين PCR.

تم تسلسل المكتبات من كل عينة باستخدام تسلسل الجيل القادم (NGS). بعد إزالة التعدد، ومراقبة الجودة، وتحديد sgRNA، تم تحليل البيانات باستخدام خط أنابيب MAGeCK. أولا، قام أمر العد بقياس وتطبيع عداد قراءة sgRNA في عينات تحكم (قاعدية) وعينات محررة بواسطة Cas9 (الشكل 3A,B). تشير ارتباطات بيرسون وسبيرمان إلى أن تمثيلية sgRNA تم الحفاظ عليها أثناء التجربة (gDNA المتبرع) مقارنة بمكتبة البلازميدية (الشكل 3C). بعد ذلك، قارن أمر الاختبار بين الحالتين، وخصص درجات تجميع الرتبة القوية (RRA) لكل جين (الشكل 3D). تم تحديد الجينات الغنية أو المستنفدة بشكل ملحوظ باستخدام عتبات p < 0.05 وتغيير الطي اللوغاريتمي (LFC) > 0.5 (الشكل 3E). وأخيرا، تم إجراء تحليل إثراء المسار للجينات المرشحة باستخدام Metascape، كاشفا عن أهم مصطلحات أنطولوجيا الجينات المرتبطة بالمنظمين المحددين (الشكل 3F).

figure-results-1
الشكل 1: فحص كريسبر في خلايا CAR T. (أ) مخطط فحص كريسبر في خلايا CAR T. (ب) اختيار الخلايا المحولة باستخدام البيوروميسين (P). تحتوي المكتبات البلازميدية على جين مقاومة للبوروميسين للانتقاء الإيجابي. تمت إضافة المضاد الحيوي في اليوم الثامن إلى الوسائط في عينات غير محولة من خلايا T غير المحولة (UTD) وCAR T وخلايا CAR T المحولة. تم استخدام عينات خالية من البوروميسين كوسيلة للتحكم في الانتشار. تعرض بيانات من متبرعين مستقلين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التحضير للمكتبة لتحليل إثراء sgRNA. (أ) مخطط بروتوكول إعداد المكتبة. (ب) مخطط تحديد المواقع النسبية لأحجام قطع إنزيم التقييد (المقص) ومناطق التلدين في بادئات PCR1 (السهم) والبادئات البيوتينيلية (سهم مع نقطة خضراء). (ج) الرحلان الكهربائي للحمض النووي قبل وبعد الهضم الريبي. (د) الإثراء الانتقائي لأشرطة sgRNA بعد PCR1. تظهر بيانات من متبرعين مستقلين من عينات قاعدية وCas9 للنمطيتين الظاهريتين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل الإثراء الإرشادي باستخدام MAGeCK. (أ) ملخص مخرجات دالة عد MAGeCK. (ب) توزيع عدد القراءات. (ج) معاملات بيرسون وسبيرمان للارتباط بين الحمض النووي المتبرع وعدد مكتبة البلازميدات. (د) الجينات المحتملة المغنية/المستنزفة مرتبة بواسطة تجميع تصنيف معدل وقوي (درجة RRA). (ه) مخطط البركان يظهر جينات ذات دلالة (قيمة p < 0.05، LFC > 0.5) باللون الأحمر. (و) مصطلحات أونتولوجيا الجينات العليا (GO) بعد تحليل مسار ميتاسكيب للجينات ذات الأهمية المخصية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تسلسل البادئات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: حالات PCR. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول الإضافي 1: قائمة sgRNA في مكتبة كينومي 1 وsgRNA المفقودة أثناء الهضم باستخدام NdeI و PspXI يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد فحص كريسبر على مبدأ الاضطراب الموجه الواحد، مما يعني أنه يجب دمج sgRNA واحد فقط لكل خلية. لتحقيق ذلك، عادة ما يتم توصيل sgRNA عبر ناقلات الفيروسية العدسية، ويجب التحكم بعناية في تعدد العدوى (MOI). وأيضا من الحدود. يوصى عموما ب 0.3، مما يؤدي إلى تحويل 25٪ إلى 30٪ من الخلايا مع جسيم فيروسي واحد6. لذا فإن العرافة الدقيقة ضرورية لتحديد حجم الجسيمات الفيروسية المطلوبة. خطوة حاسمة أخرى هي فقدان تغطية sgRNA أثناء البروتوكول. فقدان الخلايا أثناء الحصاد، وعدم الكفاءة أثناء استخراج الحمض النووي (وخاصة التحميل الزائد على العمود وعدم اكتمال الحمض النووي)، أو الإفراط في القالب أثناء تضخيم PCR كلها يمكن أن تساهم في هذا الفقد، مما يؤدي إلى تحريف تحليل sgRNA لدينا. بالنسبة للأوليغو البيوتينيلي، من الأفضل أن تكون منقاة ب HPLC لتجنب تشبع البيوتين الحر المستخدم في التخليق في خرز الستريبتافيدين. علاوة على ذلك، يوصى بشدة باستخدام معدل أميني بمقدار 3' لمنع تضخيم البالوداعات البيوتينيلية في اختبارات PCR اللاحقة. أيضا، عند تصميم هذه الأوليغو، تجنب أي تداخل مع برايمرات PCR1 لمنع المنافسة أثناء التضخيم. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب التحليل المعلوماتي الحيوي اهتماما دقيقا: أنماط استخراج sgRNA تعتمد على العمود الفقري للبلازميد (مثل lentiGuide-puro أو lentiCRISPR v2)، ويمكن أن تتراوح صرامة المحاذاة من المطابقة الدقيقة إلى بعض التسامح مع عدم التطابقات. علاوة على ذلك، وبما أن هذا البروتوكول يتضمن خطوة هضم، فقد تفقد بعض sgRNA التي تحتوي على مواقع تقييد، مما يتطلب تعديل مكتبة المرجع.

في هذه الدراسة، نقترح بروتوكول إعداد مكتبة فحص كريسبر محسن يثري الأجزاء التي تحتوي على sgRNA من خلال الهضم، والأهم من ذلك، خطوة سحب للأسفل. لقد تم اقتراح هضم إنزيمات التقييد سابقا كاستراتيجية لتقليل مدخلات gDNA وإثراء أشرطة sgRNA27. وبالمثل، تم تطبيق المجسات البيوتينيلية على نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئي لالتقاط الأحماض النووية المحددة أو مركبات الأحماض النوويةالبروتينية 28,29,30,31.

يبني بروتوكولنا على هذه المبادئ ويعدلها لفحص CRISPR في خلايا CAR T الأولية، رغم أنه يجب الاعتراف بعدة قيود. أولا، تفرض خلايا CAR T الأولية قيودا على نطاق الفحص، حيث أن قدرتها على التمدد محدودة. للحفاظ على تغطية كافية وتمثيل sgRNA، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الخلايا الابتدائية. عندما لا يكون ذلك ممكنا، يمكن استخدام مكتبات مخصصة أصغر12، رغم أن ذلك يقلل من نطاق الاستجواب الجيني. التغير البيولوجي هو تحد آخر؛ من المتوقع أن تكون الفروقات بين المتبرعين، وغالبا ما يكون تداخل الضربات الكبيرة متواضعا17. ثانيا، تعتمد استراتيجية التخصيب على وجود وموقع مواقع قطع إنزيمات التقييد. في حالات نادرة، قد تظهر هذه المواقع ضمن تسلسلات sgRNA، وهو ما يشكل إشكالية أكبر للمكتبات الصغيرة ذات التكرار المحدود. ومع ذلك، فإن معظم المكتبات، وخاصة التصاميم الجينومية بأكملها، تتضمن عدة sgRNAs لكل هدف، مما يقلل من التأثير الكلي لفقدان الدليل. أخيرا، قد توفر استراتيجيات إثراء بديلة قائمة على التجزئة، مثل السونيكيشن مع التقاط المجس24، بعض المرونة في الحالات التي لا يكون فيها هضم إنزيمات التقييد مناسبا.

بشكل عام، يمثل شريط sgRNA جزءا صغيرا جدا من إجمالي الحمض النووي الجيني في الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر، مما يجعل الإثراء الفعال أمرا حيويا لنجاح التحضير في المكتبات. مقارنة بالبروتوكولات القياسية، يقلل سير العمل المحسن لدينا من نقل gDNA ويفضل تضخيم PCR للsgRNA المعني. بينما الجمع بين تجزئة الحمض النووي وسحب المجسات البيوتينيلية مع خرز الستريبتافيدين ليس جديدا من الناحية المفاهيمية، فإن دمجه في فحص كريسبر يتجنب العقبات الشائعة في PCR ويزيد من قابلية تكرار فحص كريسبر. علاوة على ذلك، فإن دمج مقاييس QC الموحدة في كل خطوة رئيسية (مثل نقاء الخلايا التائية بعد الفرز، ونسبة الخلايا المقاومة للبورومايسين، وسلامة gDNA، وكفاءة تحويل CAR) سيعزز متانة وقابلية تكرار سير العمل. في الختام، رغم تطويره في سياق خلايا CAR T الأولية ومع وجود متبرعين اثنين فقط (وقد يمثل ذلك قيدا، رغم استخدام عدة عينات من كل مانح)، إلا أن هذا البروتوكول المحسن قد يكون قابلا للتطبيق على نطاق واسع على فحوصات CRISPR الأخرى وسير عمل NGS مع نقل كبير للحمض النووي (gDNA).

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد تضارب مصالح لدى المؤلفين.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة مشروع PID2022-137914OB-I00 الذي مولته MICIU/AEI /10.13039/501100011033 وFEDER في جامعة UE. وقد دعمت هذه الدراسة معهد صحة كارلوس الثالث (ISCIII) من خلال Red de Terapias Avanzadas TERAV وTERAV+ (RD21/0017/0009 و RD24/0014/0010) ومن خلال مركز الأبحاث الطبية الحيوية في السرطان الأحمر CIBERONC (CB16/12/00489). وقد دعمت هذه الدراسة جوبيرنو دي نافارا سالود (GN2023/08 و GN2024/04) وبرويكتوس إستراتيجيكوس (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 و0011-1411-2023-000074). تم إنشاء الشكل 1B والشكل 2A باستخدام BioRender.com

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4200 تيب ستيشنأجيلينتG2991A
أكريدين أورانجإنفيتروجينA1301
AMPure XP بيكمان كولترA63881
فاصل autoMACS NEOميلتيني130-120-327فرز الخلايا المغناطيسية عالية السرعة
الأوليغوس البيوتينيليةIDT
BSAسيغماA9647
عداد الخلايا الفلورية K2 من جهاز قياس السيلومترالتجديدCMT-K2-MX-150عداد الخلايا الفلورية
غرف العد CHT4التجديدCHT4-SD100-002
نانو بيدز CytoSinct CD4GenScriptL00863-1
نانو بيدز CytoSinct CD8GenScriptL00864-1
dNTPأجيلينت200418-51
داينابيدز M-280 ستريبتافيدينإنفيتروجين11206D
مغناطيس دايناماج-2إنفيتروجين12321D
EDTA 0.5 M pH 8.0إنفيتروجين15575-038
الإيثانولميرك1,00,98,31,000
إكسبيرت إكستربورتر ATXماكس سايتإكسبيرت ATx
فيكول-باكسيتيفا17544203
فيلتروبور S 0.2 وميكرو؛ mسارستيدت83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
مخزن هيركولاز 5Xأجيلينت600675-52مخزن 5X
إنزيم هيركولاز II للاندماجأجيلينت600679-51بوليميراز الحمض النووي
IL-15ميلتيني130-095-765
IL-7ميلتيني130-095-362
ماسترسايكلر X50aإبندورف6313HG006059
مخزن الكهرباء MaxCyteسيتيفاEPB1
NdeIمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةR0111L
نسيج النيوكليوسبينماشيري-ناجل74,09,52,250
PBSجيبكو14190-094
بوليبرينميركTR-1003-6
المقدماتثيرموفيشر
بروبيديوم يودسيغماP4864
PspXIمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةR0656S
بوروميسينجيبكوA11138-03
فلوروميتر الكيوبت 3.0إنفيتروجينس33216
اختبار DNA لكيوبت HSإنفيتروجينس32851
مجموعة معالجة الآبار المعقمة R-50x3ماكس سايتLM243882
خلية T TransAct البشريةميلتيني130-111-160كاشف تحفيز الخلايا التائية
محطة الشريط HSD1000أجيلينت5067-5585
تيكسماكسميلتيني130-097-196وسط نمو الخلايا التائية
مخزن تريس، 1.0 متر، درجة حموضة 8.0، درجة علم الأحياء الجزيئيإم دي ميليبوري648314
الماء، لعلم الأحياء الجزيئي، الحمض النووي (DNAse)، الرينز الريبي (RNAse) والبروتياز الخالي من الحمض النووي (DNAse)، والبروتيازثيرمو ساينتيفك327390010

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brudno, J. N., Maus, M. V., Hinrichs, C. S. CAR T cells and T-cell therapies for cancer: A translational science review. JAMA. 332 (22), 1924-1935 (2024).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: What we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Cui, K., et al. The challenges and progress of CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Mol Cell Biochem. 480 (10), 5345-5367 (2025).
  4. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  5. Redondo-Frutos, R. A., et al. Genetic engineering in CAR T cells for solid tumors: Current state, barriers and future developments. Hum Gene Ther. 36 (17-18), 1138-1153 (2025).
  6. Bock, C., et al. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-23 (2022).
  7. Shang, W., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), E4051-E4060 (2018).
  8. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  9. Chen, Z., et al. In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer. Cell. 184 (5), 1262-1280.e22 (2021).
  10. Belk, J. A., et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  11. Henriksson, J., et al. Genome-wide CRISPR screens in T helper cells reveal pervasive crosstalk between activation and differentiation. Cell. 176 (4), 882-896.e18 (2019).
  12. Gurusamy, D., et al. Multi-phenotype CRISPR-Cas9 screen identifies p38 kinase as a target for adoptive immunotherapies. Cancer Cell. 37 (6), 818-833.e9 (2020).
  13. Wei, J., et al. Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature. 576 (7787), 471-476 (2019).
  14. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  15. Legut, M., et al. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 603 (7902), 728-735 (2022).
  16. Ye, L., et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 34 (4), 595-614.e14 (2022).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Yukl, S. A., Kaiser, P., Kim, P., Li, P., Wong, J. K. Advantages of using the QIAshredder instead of restriction digestion to prepare DNA for droplet digital PCR. BioTechniques. 56 (4), 194(2014).
  19. Latham, S., Hughes, E., Budgen, B., Morley, A. Inhibition of the PCR by genomic DNA. PLoS One. 18 (4), e0284538(2023).
  20. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Wälder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47 (19), 5336-5353 (2008).
  21. Sasaki, Y., Miyoshi, D., Sugimoto, N. Effect of molecular crowding on DNA polymerase activity. Biotechnol J. 1 (4), 440-446 (2006).
  22. Seitz, V., Schaper, S., Dröge, A., Lenze, D., Hummel, M., Hennig, S. A new method to prevent carryover contaminations in two-step PCR NGS library preparations. Nucleic Acids Res. 43 (20), e135(2015).
  23. Giuffre, A., et al. Overview of the Agilent Technologies SureSelectTM target enrichment system. J Biomol Tech. 22 (Suppl), S30(2011).
  24. Chen, R., Im, H., Snyder, M. Whole-exome enrichment with the Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 634-641 (2015).
  25. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  26. Rodriguez-Marquez, P., et al. density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome. Sci Adv. 8 (39), 514(2022).
  27. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  28. Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based pulldown assay to validate mRNA targets of cellular miRNAs. J Vis Exp. (136), e57786(2018).
  29. Tsuji, Y. Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2. Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).
  30. Sui, H., Chen, Q., Imamichi, T. A pulldown assay using DNA/RNA-conjugated beads with a customized competition strategy: An effective approach to identify DNA/RNA binding proteins. MethodsX. 7, 100890(2020).
  31. Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Promoter pulldown assay: A biochemical screen for DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 2346, 165-172 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cas9 sgRNA

مقالات ذات صلة