يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

الآليات الجزيئية ل DBNL في فشل القلب: من استقلاب المناعة في البلاعم إلى الآثار العلاجية

445 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69756

⸱

يناير 2, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 2Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا لدمج المجموعات المتعددة الواصل، العشوائية المندلية، وعلم النسخ الأحادي الخلية، والفحص القائم على البنية في السيليكو ، لتحديد محور البلعم الشبيه بدريبرين (DBNL) بشكل منهجي في فشل القلب. نقترح DBNL كهدف مناعي أيضي قابل للدواء.

الملخص

لا يزال فشل القلب تحديا صحيا عالميا كبيرا، مع علاجات فعالة محدودة تستهدف آلياته الفيزيولوجية المرضية الأساسية. في هذه الدراسة، تم استخدام نهج متعدد الأوميكس متكامل يجمع بين العشوائية المندلية (MR) وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) لتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة والأهداف العلاجية ل HF. استخدمنا بيانات من دراسات الارتباط الجينومي (GWASs)، ومواقع الصفات الكمية للتعبير (eQTLs)، ومواقع سمات الميثلة الكمية (mQTLs)، ومواقع سمات البروتين الكمية (pQTLs) للتحقيق في الآليات الجينية لحمض البلاعم القلبي. تم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي الخلوي الواحد لتحليل التعبير الجيني في البلعم القلبية، واستخدم تحليل الوقت الزائف لدراسة التنظيم الديناميكي ل DBNL أثناء تمايز البلعميات. تم تحديد محاكاة الربط الجزيئي والديناميكية لحمض البيرينيكسيك (WY-14643؛ PubChem CID: 4594؛ المرادفات: 50892-23-4؛ WY-14643) كجهة تنظيمية محتملة ل DBNL. كشف تحليل المولتيوميكس أن DBNL (شبيه بدريبرين) هو جين رئيسي مرتبط بخطر HF. كشف تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أن DBNL يعبر عنه بشكل رئيسي في البلعم القلبية ويتم تنظيمه تحت الظروف المرضية. يرتبط التعبير عن DBNL بواسطة البلعم بمسارات الأيض المناعي والمسارات التليفية، خصوصا مسارات إشارات IL-6/JAK/STAT3، PI3K/AKT/mTOR، وTGF-β الإشارات. أشار تحليل الوقت الزائف إلى أن DBNL له تأثير تنظيمي ديناميكي على تمايز البلاعمية، خاصة في الالتهاب المزمن. أظهرت الالتحام الجزيئي والمحاكاة الديناميكية أن حمض البيريدين له دور محتمل في تنظيم DBNL. توضح هذه الدراسة دور DBNL في تطور فشل القلب وتقترح إمكاناته كهدف علاجي. ومن المهم أن الأهمية العلاجية تستنتج من التنبؤات الحاسوبية. تقدم هذه النتائج رؤى جديدة حول استقلاب المناعة والتواصل بين الخلايا بوساطة البلاعمية، مما يؤسس أساسا نظريا لتطبيقات مستقبلية في تحسين الأدوية المستهدفة ل DBNL والأبحاث الوظيفية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى المزيد من التحقق التجريبي والدراسات ما قبل السريرية لإثبات الفعالية السريرية ل DBNL كهدف علاجي.

المقدمة

يمثل فشل القلب تحديا صحيا عالميا كبيرا ومتزايدا يؤثر على ملايين الأفراد حول العالم ويضع ضغطا اقتصاديا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية1. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتدخلات فعالة في إدارة فشل القلب (HF).

تنشأ الفيزيولوجيا المرضية المعقدة لفشل القلب من ضعف انقباض عضلة القلب في البطين الأيسر، مما يؤدي إلى سلسلة من المضاعفات الجهازية مثل الاحتقان الرئوي والطرفي2. ومع ذلك، فإن معالجة الآليات الفسيولوجية المرضية الأساسية التي تكمن وراء تقدم فشل القلب، وخاصة إعادة تشكيل عضلة القلب السلبية، لا تزال تحديا حاسما ولم يتم تلبيته3. في العقود الأخيرة، شهد مجال البحث الطبي الحيوي تحولا جذريا في النموذج، ساهله بشكل رئيسي دمج تقنيات المولتيوميكس ومنهجيات المعلوماتية الحيوية المتقدمة. توفر هذه الأدوات فرصا استثنائية لتحديد العلامات الحيوية الجديدة للأمراض والأهداف العلاجية. يستخدم العشوائية المندلية (MR)، وهو نهج وبائي جيني صارم، تعدد أشكال النيوكليوتيدات الأحادية (SNPs) كمتغيرات أداية لاستنتاج العلاقات السببية بين التعرضات الجينية والنتائج السريرية4. من خلال اعتماد الإطار المنهجي للتجارب العشوائية المضبوطة، يعالج العشوائية المندلية (MR) بشكل فعال مشاكل الخلط بين السببية والعكس لتوفير أدلة قوية لتحديد وإعادة استخدام أهداف الأدوية. بالتوازي، يكشف تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) عن تباين الأنسجة بدقة لا مثيل لها، مقدما رؤى عميقة حول التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية وشبكات الاتصال بين الخلايا داخل الأعضاء المعقدة مثل القلب5. يقدم نهج التنوع العددي، الذي يجمع بيانات جينية ونسخية وبروتيومية، إمكانات كبيرة لتوضيح آليات المرض وتحديد المسارات العلاجية.

على الرغم من هذه التطورات التكنولوجية، لا تزال هناك فجوات معرفية كبيرة حول الآليات الخلوية والجزيئية المحددة التي تدفع التهاب القلب وإعادة تشكيل فشل القلب. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الخلايا المناعية، وخاصة البلعميات، ضرورية لتنظيم الاستجابات الالتهابية وإعادة تشكيل الأنسجة اللاحقة أثناء إصابات عضلة القلب وعمليات فشل القلب المزمن، والتي تعتبر بدورها حاسمة لتقدم المرض6. ركزت الأبحاث السابقة بشكل رئيسي على الوسطاء الالتهابيين الواسع أو علامات سطح الخلية، مما أدى إلى فجوة كبيرة في استكشاف الأهداف التنظيمية داخل الخلايا داخل هذه المجموعات الحيوية من الخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن الدراسات التقليدية للارتباط على مستوى الجينوم (GWASs) قد حددت العديد من الارتباطات الجينية المرتبطة بفشل القلب، إلا أنها غالبا ما تواجه صعوبات في إثبات علاقات سببية حاسمة، مما يحد من قابليتها للترجمة العلاجية المباشرة7. وبالتالي، فإن تنفيذ إطار شامل للعشوائية المندلية (MR) للمولتيوميكس، الذي يدمج المتغيرات الجينية التي تؤثر على مثيلة الحمض النووي (mQTLs)، والتعبير الجيني (eQTLs)، ووفرة البروتينات (pQTLs)، أمر ضروري لتحقيق استنتاجات سببية أكثر قوة عبر طبقات تنظيمية بيولوجية متعددة. يعالج هذا النهج القيود الجوهرية المرتبطة بدراسات QTL ذات الطبقة الواحدة. ومن الجدير بالذكر أن بروتين الشبيه بالدريبرين (DBNL) كان موضوع أبحاث موسعة في سياق تطور الخلايا العصبية وديناميكيات الهيكل الخلوي8؛ ومع ذلك، فإن أهميته الوظيفية وإمكاناته العلاجية في أمراض القلب والأوعية الدموية، وخاصة فشل القلب، لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. هذا الفجوة الكبيرة في فهمنا تعيق اعتبار DBNL هدفا جديدا ومحتملا لتطوير الأدوية في علاج فشل القلب.

لمعالجة هذه الفجوات المعرفية الحرجة، تهدف هذه الدراسة إلى تحديد الجينات الرئيسية المرتبطة سببيا بخطر فشل القلب بشكل قوي من خلال إطار عمل متكامل للرنين المغناطيسي متعدد الأومكس يجمع بين بيانات eQTL وmQTL وpQTL. تقدم هذه الدراسة نهجا جديدا يتضمن دمج تحليلات العشوائية المندلية متعددة الأوميات — بما في ذلك مواقع السمات الكمية للتعبير (eQTLs)، ومواقع السمات الكمية في المثيلة (mQTLs)، ومواقع سمات البروتين الكمية (pQTLs) — مع بيانات النسخ النصية عالية الدقة لخلية واحدة (GSE161470) وبيانات النسخ الجماعي (GSE161472) لتحديد جين DBNL كعامل خطر سبب حاسم لفشل القلب. تظهر هذه النتائج أن DBNL يعبر عنه بشكل رئيسي ومحدد في البلعم القلبية، وأن تعبيره يتغير ديناميكيا طوال عملية التمايز فيها. علاوة على ذلك، توضح نتائج هذه الدراسة الدور المحوري ل DBNL في تعديل البيئة المناعية القلبية الدقيقة وتنظيم المسارات المناعية المرتبطة بفشل القلب، مثل سلسلة الإشارات IL-6/JAK/STAT3، بالإضافة إلى مسارات الإشارات الليفية. بالإضافة إلى ذلك، من خلال استخدام تقنيات علم الأحياء الحاسوبي، تتنبأ هذه الأبحاث بأن حمض البيريديل (WY-14643) هو رابطة عالية الألفة ل DBNL، مما يوفر إطارا نظريا شاملا متعدد الأبعاد يدعم تصنيف DBNL كهدف علاجي جديد لفشل القلب ويسهل تطوير تدخلات دوائية مستهدفة. باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، قمنا بتوصيف التعبير والمسارات الوظيفية الخاصة بالخلايا للجين الرئيسي DBNL المحددة ضمن البيئة الدقيقة القلبية، ودرسنا دور DBNL في مسارات الإشارات المناعية الأيضية والليفية، وكذلك في التواصل بين الخلايا بين أنواع خلايا القلب. تم تحديد الروابط الجزيئية الصغيرة المحتملة ل DBNL من خلال محاكاة الالتحام الجزيئي الحاسوبي والديناميكا الجزيئية. نفترض أن DBNL، الذي يعبر عنه بشكل أساسي في البلعم القلبية، يمارس تأثيرا سببيا على تقدم فشل القلب من خلال تنظيم المسارات المناعية الأيضية والتداخل بين الخلايا. باختصار، من خلال دمج العشوائية المندلية المتقدمة متعددة الأوميات مع تحليل خلية واحدة عالية الدقة، قمنا بتحديد وتوصيف أهداف علاجية جديدة لفشل القلب بشكل منهجي واستكشفنا أهدافا محتملة لمعدلات الجزيئات الصغيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تحميل البيانات
بيانات التعبير الجيني
تم الحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) المستخدمة في هذه الدراسة من مستودع Gene Expression Omnibus (GEO) الذي يديره المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)، وتحديدا من مجموعة البيانات ذات رقم الإدخال9 GSE161470 (نسيج القلب البشري الذي يتكون من أربعة عينات ضابطة وعينة مرضية واحدة). تم نشر هذه المجموعة في الأصل من قبل تشانغ وآخرين في عام 2022. كان الهدف الأساسي من التحقيق الأصلي هو فحص التغاير الخلوي والآليات التنظيمية الجزيئية في نسيج القلب البشري تحت ظروف فشل القلب. للتحليل الحالي، تم اختيار خمس عينات من هذه المجموعة، كل منها يحتوي على ملفات تعبير شاملة لخلية واحدة مشتقة من نسيج القلب البشري. أما مجموعة البيانات الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة فقد تم الحصول عليها أيضا من مستودع NCBI GEO العام، وتحديدا ملف المصفوفة المتسلسلة المقابل لرقم الإدخال GSE161472، مع ملف التعليقات التوضيحية GPL11154. يتألف ملف التعبير من إجمالي 84 عينة، منها 37 عينة ضابطة و47 عينة مرضية. يشمل هذا البحث تحليلا تكامليا للمولتيوميكس، حيث تجرى جميع التحقيقات باستخدام بيانات متاحة للعامة.

بيانات eQTL
تركز بيانات eQTL، التي تم الحصول عليها من اتحاد eQTLGen، على توضيح الإطار الجيني لتعبير الجينات في الدم والعوامل الجينية المؤثرة على الصفات المعقدة3. يشارك الاتحاد حاليا في المرحلة الثانية من مشروعه الواسع، حيث يجري تحليلات تلوية لبيانات الجينوم العامة المتعلقة بتعبير جينات الدم.

بيانات التعريض - mQTLs
تم الحصول على بيانات mQTL من تحليل تلوي منشور لمجموعة الأوروبيين (EUR)، والذي يفحص مثيلة الحمض النووي الكامل للدم ضمن الإطار الجيني ل 3,701 عينة من مجموعات ذات أصول أوروبية11. تضمنت مجموعة البيانات معلومات عن 426,636 سمة mQTL.

بيانات التعريض - pQTL
تم الحصول على بيانات pQTL البلازما من قاعدة بيانات deCODE (https://www.decode.com/summarydata/)4. استخدمت هذه الدراسة إصدار بيانات 2021 لمجموعة بيانات deCODE pQTL، والتي شملت دراسة ارتباط جينومي شامل (GWAS) لمستويات بروتين البلازما تم قياسها باستخدام 4,907 أبتامر في مجموعة مكونة من 35,559 فردا من أصل أوروبي.

بيانات النتائج
تم الحصول على إحصائيات ملخصة لفشل القلب من دراسة ارتباط جينوم واسعة النطاق (GWAS) شملت بشكل رئيسي مشاركين من أصول أوروبية، تم الوصول إليها من خلال قاعدة بيانات معهد المعلوماتية الحيوية الأوروبي (EBI) (GCST90162626). شملت مجموعة بيانات فشل القلب 115,150 حالة و1,550,331 حالة ضابطة. يقدم فهرس GWAS، الذي يشمل المنشورات، والجمعيات الرائدة، والإحصاءات الملخصة التفصيلية، حاليا بيانات مرتبطة ب Genome Assembly وdbSNP Build.

تحليل العشوائية المندلية لخطات mQTLs، eQTLs، وpQTLs
للتحقيق بشكل منهجي في العلاقات السببية المحتملة بين التعبير الجيني، ووفرة البروتينات، ومستويات مثيلة الحمض النووي، وخطر فشل القلب، أجريت تحليلات العشوائية المندلية باستخدام مواقع سمات التعبير الكمية (eQTLs)، ومواقع سمات البروتين الكمية (pQTLs)، ومواقع سمات الميثيلة الكمية (mQTLs). خلال مرحلة معالجة بيانات التعرض، تم استخراج تعدد أشكال النيوكليوتيدات الأحادي (SNPs) المرتبطة بكل متغير تعرض (جين، بروتين، أو موقع مثيلة) من قواعد البيانات المعنية عند عتبة دلالة جينومية على مستوى الجينوم وهي P < 1 × 10⁻⁵ لتكون بمثابة متغيرات أولية مرشحة للأدوات (IVs). لاحقا، تم إجراء تجمع في عدم توازن الربط (LD) لكل عامل تعرض باستخدام حجم نافذة 10,000 كيلوبازي (kb) وعتبة LD R² 0.001 لضمان استقلالية الأجهزة. ثم تم توحيد هذه الوريدات المختارة مع إحصائيات ملخصة من دراسة ارتباط جينومي على مستوى فشل القلب (GWAS؛ ID: GCST90162626) باستخدام دالة read_outcome_data، مع الاحتفاظ فقط بتلك SNPs التي تظهر قيمة P ارتباطية أقل من 5×10⁻⁵ في مجموعة بيانات النتائج. لتقليل ضعف التحيز في الأدوات، تم حساب إحصائية F لكل IV ك F = (β_exposure/SE_exposure)²، ولم تدرج في التحليلات اللاحقة سوى الأدوات التي تحتوي على F > 10. لتقدير التأثير السببي، تم إجراء محاذاة الأليل بين مجموعات بيانات التعرض والنتائج باستخدام دالة harmonize_data من حزمة TwoSampleMR. ثم أجريت تحليلات الرنين المغناطيسي باستخدام أربعة أساليب إحصائية تكميلية: (1) طريقة التباين العكسي الموزون (IVW)، التي توفر تحليلات تلوية لتقديرات نسبة والد عبر SNPs; (2) انحدار MR-إيغر، الذي يأخذ في الاعتبار تعدد الاتجاهات من خلال دمج مصطلح اعتراض تحت افتراض قوة الأداة المستقلة عن التأثير المباشر (InSIDE)؛ (3) طريقة الوسيط المرجح، التي تعطي تقديرات سببية متسقة حتى لو كانت ما يصل إلى 50٪ من الأدوات غير صالحة؛ و(4) طريقة النمط المرجح، التي تحدد أكثر مجموعة تقدير التأثير السببي شيوعا، مما يوفر قوة إحصائية محسنة وخطأ من النوع الأول أقل مقارنة ب MR-Egger. في الحالات التي كان فيها متغير أداة واحد فقط متاحا، تم تطبيق طريقة نسبة والد حصريا. لتقييم متانة النتائج، أجريت تحليلات حساسية شاملة، بما في ذلك اختبار التباين عبر دالة mr_heterogeneity، وتقييم التنوع باستخدام mr_pleiotropy_test، وتحليلات ترك واحد خارج الوظيفة التي نفذت عبر دالة mr_leaveoneout، التي تستبعد كل SNP بشكل تكراري لتحديد تأثير المتغيرات الفردية على النتائج العامة. تم تصور ارتباطات مهمة باستخدام أدوات رسومية مثل mr_scatter_plot و mr_forest_plot. تم تطبيق هذا المسار التحليلي بشكل موحد عبر مجموعات بيانات eQTL وpQTL وmQTL للحفاظ على الاتساق المنهجي طوال الدراسة.

تحليل التداخل
تم إجراء تحليل التداخل الوظيفي باستخدام طريقة Coloc، وبيانات ملخص eQTL، وتحليل GWAS لفشل القلب5. تم استخدام تعدد أشكال النيوكليوتيد الواحد (SNP) لحساب الاحتمال الخلفي ضمن نافذة تجمع بحجم 100 كيلوبايت. في تحليل التمركز المشترك (coloc)، تشير فرضية H3 إلى الاحتمال اللاحق بأن الصفتين، وهما التعبير الجيني وفشل القلب، مرتبطتان لكن لهما متغيرات سببية مميزة. وعلى العكس، تشير فرضية H4 إلى الاحتمال اللاحق بأن الارتباط بين الصفتين يعزى إلى متغير سببي مشترك واحد. عتبة من SNP. PP. تم استخدام H4 أكبر من 0.90 لتحديد التزامن.

التسلل المناعي
طريقة CIBERSORT هي تقنية معتمدة على نطاق واسع لتقييم أنواع الخلايا المناعية داخل البيئة الدقيقة12. باستخدام مبادئ الانحدار المتجه الداعم، يمكن إجراء تحليل فك الالتفاف لمصفوفة التعبير لأنواع الخلايا المناعية. من خلال دمج 547 علامة حيوية، يمكن ل CIBERSORT تمييز 22 نمطا ظاهريا لخلايا المناعة البشرية، بما في ذلك الخلايا التائية، وخلايا B، وخلايا البلازما، ومجموعات مختلفة من الخلايا النخاعية. باستخدام مجموعة البيانات GSE161472، تم إجراء تحليل باستخدام خوارزمية CIBERSORT مع مصفوفة توقيع LM22 المدمجة، التي تصف ملفات التعبير الجيني ل 22 نوعا مختلفا من خلايا المناعة البشرية. تم قياس مستويات التسلل لهذه المجموعات ال22 من الخلايا المناعية لكل عينة فردية. لاحقا، تم تطبيق وظيفة اختبار التحليل لتقييم الارتباطات بين تعبير الجينات الرئيسية ومستويات تسرب الخلايا المناعية المقابلة.

معالجة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومراقبة الجودة
تمت معالجة بيانات ملف تعريف التعبير أحادي الخلية باستخدام حزمة Seurat (V4.3.0) في بيئة R (V4.3.0)6. استخدمت هذه الدراسة سير عمل تقليدي لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. في البداية، تم استيراد ملفات تعريف التعبير باستخدام حزمة Seurat. تم تصفية الخلايا بناء على عدة مقاييس جودة، بما في ذلك إجمالي عدد الوحدات العضلية العضلية لكل خلية، وعدد الجينات المعبر عنها، ونسبة قراءات الميتوكوندريا، ونسبة قراءات الريبوسوم. تم تحديد القيم الشاذة كقيم تنحرف عن الوسيط بأكثر من ثلاثة انحرافات مطلقة (MADs). كانت عتبات الترشيح المحددة المطبقة كما يلي: nFeature_RNA ≥ 200، percent.mt ≤ 2.15718، nFeature_RNA ≤ 2840.941، nCount_RNA ≤ 5194.27. عادة، كانت الخلايا التي تظهر أعداد UMI وعدد جينات معبرة مرتفعة جدا كخلايا مزدوجة (doublets)، بينما كانت الخلايا ذات النسب المرتفعة من قراءات الميتوكوندريا أو الريبوسوم تعتبر منخفضة الجودة، وقد تخضع للموت المبرمج أو التجزئة. وبعد هذه الخطوات التصفية، تم استخدام DoubletFinder (الإصدار 2.0.4) لتحديد وإزالة الدوبلت من كل عينة بشكل فردي، مما أكمل عملية مراقبة جودة الخلية. في البداية، تم إجراء تطبيع البيانات باستخدام دالة NORMALIZEData. تم تقييم حالة دورة الخلية لاحقا عبر دالة CellCycleScoring، وتم تحديد جينات متغيرة للغاية من خلال طريقة FindVariableFeatures (FindVariableFeatures). ثم تم تحجيم مجموعة البيانات باستخدام ScaleData لتوحيد البيانات والتخفيف من تأثير جينات الميتوكوندريا، وجينات الريبوسوم، وتأثيرات دورة الخلية على التحليلات اللاحقة. تم إجراء تقليل الأبعاد الخطية باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) من خلال دالة RunPCA، مع اختيار مكونات رئيسية مهمة لمزيد من التحليل. لمعالجة تأثيرات الدفعات عبر عينات مختلفة، تم استخدام خوارزمية هارموني (الإصدار 1.1.0). يقوم هذا النهج بتجميع الخلايا المماثلة بشكل تكراري من دفعات مختلفة داخل فضاء PCA مع الحفاظ على تنوع الدفعات داخل المجموعات. نظرا للتأثيرات الطفيفة نسبيا على دفعات لوحظت في مجموعة البيانات، تم تطبيق المعلمات الافتراضية (θ = 2). تم إجراء تقليل الأبعاد غير الخطية لاحقا باستخدام RunUMAP، تلاه بناء رسم جواري خلوي عبر FindNeighbors وتجميع الخلايا عبر FindClusters. بالنسبة لتعليق نوع الخلية، تم تنفيذ إطار هرمي للتعليق: كان التعليق اليدوي الأساسي يعتمد على أنماط التعبير الجيني المميزة المستندة إلى قاعدة بيانات CellMarker والأدبيات ذات الصلة؛ وقد تم تعزيز ذلك بنتائج التعليقات التوضيحية الآلية التي تم الحصول عليها من برنامج SingleR كمرجع. لزيادة دقة وشمولية تحديد أنواع الخلايا بشكل أكبر، تم استشارة عدة قواعد بيانات موثوقة، بما في ذلك أطلس الخلايا الأولية البشرية (HPCA)، BlueprintEncode، MonacoImmune، DatabaseImmuneCell، وNovershternHaematopoietic. تم إجراء التعليق الخلوي من خلال الاستعلام في قاعدة بيانات CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) ومراجعة الأدبيات، بمساعدة دعم التعليقات الآلي الذي قدمه برنامج SingleR (V2.4.0)رقم 13. يهدف إلى تحديد أنواع الخلايا الموجودة في الأنسجة المقابلة وجينات العلامات المرتبطة بها14.

تحليل تفاعلات الليغاند والمستقبلات
في هذه الدراسة، تم استخدام CellCall (الإصدار 1.0.7) لإجراء تحليل شامل لشبكات الاتصال بين الخلايا15. من خلال استخدام تعليقات نوع الخلية المستمدة من سورا إلى جانب مصفوفة العد الخام، تم إنشاء كائن تحليل مطبع مع معلمات مهيأة للجينوم البشري. تم تطبيق دالة TransCommuProfile لقياس قوة تفاعلات الخلية مع الخلايا من خلال خوارزمية موزونة، مع تطبيق عتبة دلالة بقيمة p < 0.05 لتحديد أزواج الليغاند المستقبلات الموثوقة. تم لاحقا إخضاع أزواج التفاعل الدلالة لتحليل إثراء مسار KEGG عبر دالة getHyperPathway، وتم توضيح العلاقات بين أنواع الخلايا والمسارات باستخدام مخططات الفقاعات. تم تصور شبكة الاتصال الكلية في النهاية من خلال رسم دائري، حيث تدل ثمانية ألوان مميزة على أنواع الخلايا المختلفة. تم تمثيل قوة التفاعل واتجاهها من خلال ميزات السهم، مما وفر توصيفا تفصيليا لديناميكيات الإشارات بين الخلايا.

تحليل الزمن الزائف
لدراسة التنظيم الديناميكي للنسخ للبلاعم طوال تطور فشل القلب، استخدمت هذه الدراسة خوارزمية مونوكل لإجراء تحليل زائف الزمن على مجموعات البلاعم الفرعية. تم استخراج مصفوفة التعبير الجيني المقابلة للمجموعات الفرعية المستهدفة للخلايا لبناء كائنات تحليل مسار خلية واحدة، مع اختيار جينات متغيرة للغاية كميزات ترتيب. باستخدام تقنية تقليل الأبعاد DDRTree، تم رسم خرائط الخلايا على فضاء ثنائي الأبعاد لإعادة بناء مسار التمايز. أجريت تحليلات التصور لتحديد توزيع الخلايا على محور الزمن الزائف ولتحديد الجينات التي تغير تعبيرها بشكل كبير خلال الزمن الزائف. ركزت التحليلات اللاحقة على الجين الرئيسي DBNL وحددت ديناميكيات تعبيره على طول مسار الخلية، موضحة آليات إعادة البرمجة النقية للبلاعم أثناء تقدم فشل القلب16.

تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA)
في هذه الدراسة، تم استخدام نهج GSEA لتوضيح الآليات التنظيمية المرتبطة بالجينات الرئيسية المشاركة في فشل القلب. باستخدام جينات رئيسية تم تحديدها سابقا، تم تصنيف العينات إلى مجموعات ذات تعبير عالي ومنخفض التعبير بناء على قيمة التعبير الوسيط. تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي باستخدام حزمة ليما، مما أنتج قائمة جينات مرتبة وفقا لتغير اللغاريتيم (logFC). تم إجراء تحليل إثراء مسار KEGG لاحقا باستخدام أداة clusterProfiler، حيث كانت مجموعات الجينات المستمدة من قاعدة بيانات MsigDB بمثابة خلفية مرجعية. ثم تم تطبيق خوارزمية GSEA لتحديد مسارات الإشارات التي تم إثراؤها بشكل كبير بين مجموعتي التعبير، وتم استخدام عتبة p معدلة أقل من 0.05 لتحديد الدلالة الإحصائية. لتوضيح الوظائف التنظيمية للجينات الأساسية ضمن المسارات الحرجة، تم استخدام تقنيات تصور مختلفة، بما في ذلك مخططات GSEA متعددة المسارات ومخططات الشبكة الدائرية.

تحليل تباين مجموعات الجينات (GSVA)
GSVA هو نهج غير معلمي وغير مراقب يستخدم لتقييم إثراء مجموعة الجينات ضمن بيانات النسخ النصية. تحول هذه الطريقة التغيرات على مستوى الجينات إلى اختلافات على مستوى المسار من خلال حساب الدرجات المركبة لمجموعات جينية محددة، مما يسهل تقييم التغيرات الوظيفية البيولوجية عبر عينات مختلفة. في هذه الدراسة، تم الحصول على مجموعات الجينات من قاعدة بيانات التواقيع الجزيئية. تم استخدام خوارزمية GSVA لحساب الدرجات المركبة لكل مجموعة جينية، مما مكن من تقييم التغيرات البيولوجية الوظيفية المحتملة عبر عينات مختلفة. تقدم نتائج تحليل إثراء GSVA في المواد الإضافية (الجدول التكميلي 1).

التنبؤ بدواء CTD
تم إدخال الجين المستهدف (DBNL) في مجال البحث في قاعدة بيانات السموم المقارنة (CTD)، وتم اختيار فئة المرض "أمراض القلب والأوعية الدموية"، وتم تنفيذ الاستعلام لاسترجاع بيانات التنبؤ بالأدوية المرتبطة بحالة "فشل القلب". تم استيراد نتائج التنبؤ التي تم الحصول عليها لاحقا إلى برنامج Cytoscape لتسهيل تصور البيانات وتمكين إنشاء خريطة لشبكة تفاعل الجينات والكيميائية.

طرق الالتحام الجزيئي
نظرا للبنية البلورية ثلاثية الأبعاد غير المحلولة لبروتين DBNL البشري (معرف UniProt: Q9UJU6)، توقعت هذه الدراسة البنية ثلاثية الأبعاد ل DBNL بناء على AlphaFold317. حمض البيرينيكسيك (WY-14643) متاح للتحميل من قاعدة بيانات PubChem (PubChem CID: 5694). بعد ذلك، تمت معالجة بنية البروتين مسبقا باستخدام برنامج MGLTools (الإصدار 1.5.7)18، بما في ذلك خطوات مثل إضافة ذرات الهيدروجين. في الوقت نفسه، تم تحويل البروتينات والجزيئات الصغيرة إلى صيغة PDBQT المطلوبة للالتحم. تم استخدام برنامج أوتودوك فينا (الإصدار 1.1.2)19 للالتحام الجزيئي العالمي (الإكسوجينيسي=16، num_modes=30) لاستكشاف أوضاع الربط المحتملة. عند الانتهاء من حسابات الالتحام، يجب اختيار التكوين المركب ذو أعلى ألف، والذي يشار إليه بأقل طاقة ارتباط حرة، كهيكل أولي لمحاكاة الديناميكا الجزيئية اللاحقة.

طريقة محاكاة الديناميكا الجزيئية
للتحقيق بشكل منهجي في آليات استقرار الارتباط والتفاعل بين المركبات والبروتينات المرشحة، أجريت محاكاة تقليدية للديناميكا الجزيئية (MD) باستخدام حزمة برنامج GROMACS (الإصدار 2024.03)20. تم توليد معلمات البروتين باستخدام حقل القوة Amber14SBرقم 21، وتم إنشاء نموذج جزيئات الماء باستخدام نموذج TIP3P22، وتم توليد معلمات طوبولوجيا الليغاند باستخدام أداة واجهة محلل بايثون Antechamber (ACPYPE)، التي تعتمد على حقل القوة الكهرماني العام (GAFF). تم وضع نظام مركب الليغاند والبروتين لاحقا داخل صندوق حدودي دوري ثماني الأوجه مملوء بجزيئات الماء TIP3P. تم إدخال أيونات الصوديوم (Na⁺) والكلوريد (Cl⁻) لتحقيق تركيز 0.15 مول/لتر ولتعادلية الشحنة الكلية للنظام. عند الانتهاء من بناء النظام، تضمنت الخطوة الأولى تقليل الطاقة باستخدام أكثر طريقة نزول انحدارا لمسافة 50,000 خطوة، بهدف القضاء على أي تشكيلات غير معقولة محتملة داخل الهيكل. تم إجراء مرحلتين من توازن النظام لاحقا: محاكاة NVT (عدد الجسيمات الثابت، الحجم، ودرجة الحرارة الثابتة) بسرعة 100 حصان ثانوي تليها محاكاة NPT (عدد الجسيمات الثابت، الضغط، ودرجة الحرارة). خلال هذه المحاكاة، تم تطبيق قيود موقعية على الذرات الثقيلة في العمود الفقري للبروتين للحفاظ على السلامة الهيكلية للبروتين. تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 300 كلفن باستخدام منظم الحرارة V-rescale، وتم تنظيم الضغط عند 1 بار باستخدام باروستات بارينيلو-رحمن للربط الضغطي. عند الانتهاء من مرحلة التوازن، تم إجراء محاكاة لمرحلة الإنتاج تمتد على 100 نانوثانية، وخلالها يتم القضاء على جميع القيود الموضعية. تم دمج المسار باستخدام خطوة زمنية بمقدار 2 فيمتوثانية، وتم استخدام طريقة إيوالد (PME) لإدارة التفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى بدقة. تم حفظ المسار كل 10 حصان، وتم إخراج ما مجموعه 10000 إطار للتحليل اللاحق. بالإضافة إلى ذلك، تم استخراج مسارات مستقرة في الفترة الزمنية 90-100 نانوثانية من المحاكاة، وتم حساب طاقة الارتباط الحرة لمجمعات بروتينات الليغاند باستخدام أداة GMX MMPBSAرقم 23.

التحليل الإحصائي
تعتمد صحة هذا التحليل العشوائي المندلي (MR) على ثلاثة افتراضات أساسية. (1) الصلة: يجب أن تظهر المتغيرات الآلية (IVs) ارتباطا قويا بالتعرض. (2) الاستقلالية: يجب أن تكون الوصفات الوريدية مستقلة عن أي عوامل تؤثر على التعرض والنتيجة معا. (3) تقييد الاستبعاد: يجب أن تؤثر الحقن الوريدية على النتيجة حصريا من خلال تأثيرها على التعرض. يشار إلى خرق هذا الافتراض، حيث يؤثر الوريد على النتيجة من خلال مسارات لا تتضمن التعرض، بالتعدد المتعدد الأفقي. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام النسخة R 4.3.0، مع اختبارات ثنائية الجانب، وكان يعتبر عموما أن قيمة p أقل من 0.05 تشير إلى الدلالة الإحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحديد DBNL كجين مرتبط بخطر فشل القلب من خلال تحليل العشوائية والتوازي المندلي
تم الحصول على معرف النتائج للعينات المرتبطة بفشل القلب، GCST90162626، من مجموعة بيانات الإحصاءات الملخصة. تم تحديد العلاقات السببية بين 1,247 زوجا من مواقع السمات الكمية للتعبير (eQTLs) والنتائج باستخدام دالتي extract_instruments و extract_outcome_data (الجدول التكميلي 2). كشف تحليل العشوائية المندلية اللاحق عن 567 زوجا جينيا مرتبطا بنتائج إيجابية ل eQTL (الشكل 1A). كشفت النتائج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن الالتهاب يشكل جانبا أساسيا من الفيزيولوجيا المرضية لفشل القلب (HF)، إلا أن الأبحاث السابقة ركزت بشكل رئيسي على الوسطاء الالتهابيين العامين وعلامات سطح الخلايا 17,18,24. وقد قيد هذا التركيز توضيح الآليات الخلوية المحددة المعنية. لتجاوز هذه القيود، استخدمنا نهجا تكامليا يجمع بين التوزيع العشوائي المندلي متعدد الأومور (MR) وتحليل النسخ الأحادي الخلية، حيث حددنا من خلاله بروتين DBNL ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا البرنامج البحثي مؤسسة العلوم الطبيعية الإقليمية في تشجيانغ الصينية (LTGY24H020001)، ومشروع العلوم والتكنولوجيا في الطب الصيني التقليدي في مقاطعة تشجيانغ (2023ZR131، 2023ZL158)، ومشروع الرفاهية العامة في نينغبو (2024S030)، وبرنامج البحث والتطوير التكنولوجي الرئيسي في نينغبو (2022Z149)، والمختبر الرئيسي للطب الدقيق لأمراض تصلب الشرايين في مقاطعة تشجيانغ (2022E10026)، ومشروع الصندوق الخاص للأبحاث الطبية السريرية لجمعية تشجيانغ الطبية (2021ZYC-A11).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قاعدة بيانات CellMarkerجامعة هاربين الطبية (CellMarker 2.0)http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/قاعدة بيانات CellMarker؛ للاستعلام عن جينات علامات الأنسجة/نوع الخلية أثناء التعليق على خلية واحدة
قاعدة بيانات السموم المقارنة (CTD)CTD (جامعة ديوك وآخرون)http://ctdbase.org/قاعدة بيانات CTD؛ لاسترجاع التفاعلات بين المواد الكيميائية والجينات والأنماط الظاهرية والأمراض، المستخدمة في التنبؤ بالأدوية
مجموعة بيانات deCODE Plasma pQTL (2021، 4,907 أبتامرات، 35,559 عينة أوروبية)جينات إزالة الشفرةhttps://www.decode.com/summarydata/إصدار بيانات pQTL لعام 2021؛ يستخدم كبيانات تعرض pQTL لتحليل الرنين المغناطيسي
بيانات eQTLGen Whole Blood eQTLاتحاد eQTLGenhttps://www.eqtlgen.org/eQTLGen المرحلة الأولى/الثانية (نسخة محددة حسب الاستخدام)؛ يستخدم كبيانات تعرض eQTL لتحليل الرنين المغناطيسي وتحليل التداخل التوطيبي
مجموعة بيانات RNA-seq لخلية GEO GSE161470(نسيج القلب البشري: 4 نقاط تحكم + عينة مرضية واحدة)مجموعة تعبير الجينات من NCBI (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470GSE161470؛ للحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأنسجة القلب البشرية للتحليل اللاحق
كتالوج GWASNHGRI– EBIhttps://www.ebi.ac.uk/gwas/كتالوج GWAS؛ لاسترجاع معلومات GWAS المتعلقة ب HF، والتعليقات، والتحليلات المساعدة
إحصائيات ملخصة لفشل القلب في GWAS (GCST90162626)NHGRI– كتالوج EBI GWAShttps://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626الانضمام إلى الدراسة: GCST90162626؛ يستخدم كبيانات نتائج لتحليل الرنين المغناطيسي وتحليل التداخل التوطيني
قاعدة بيانات التواقيع الجزيئية (MSigDB) v7.0معهد برودhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbMSigDB v7.0؛ لمجموعات جينات خلفية GSEA / GSVA وتعليقات المسارات
حمض البيرينيكسيك (WY-14643) بيانات البنية (PubChem)NCBI PubChemhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694PubChem CID: 5694؛ يستخدم للحصول على بنية ثلاثية الأبعاد للربط الجزيئي ومحاكاة الديناميكيات
قاعدة بيانات بروتين يوني بروت (DBNL، معرف UniProt: Q9UJU6)اتحاد يوني بروتhttps://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6UniProt: Q9UJU6؛ يستخدم للحصول على تسلسل الأحماض الأمينية ل DBNL للتنبؤ بالبنية والالتحام
تحليل تلوي mQTL للدم الكامل (المرجع 11، 3,701 عينة أوروبية، 426,636 سمة mQTL)المؤلفون / الاتحاد (وفقا لمرجعك 11)المؤلف المنتظر لإضافة رابط قاعدة البيانات الأصلي / DOIمعرف DOI أو مجموعة البيانات؛ يستخدم كبيانات تعرض mQTL لتحليل الرنين المغناطيسي

المراجع

  1. Darvish, M., et al. Heart failure: Assessment of the global economic burden. Eur Heart J. 46 (31), 3069-3078 (2025).
  2. Giambartolomei, C., et al. Bayesian test for colocalisation between pairs of genetic association studies using summary statistics. PLoS Genet. 10 (5), e1004383(2014).
  3. Ferkingstad, E., et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease. Nat Genet. 53 (12), 1712-1721 (2021).
  4. Yang, M., et al. No evidence of a genetic causal relationship between ankylosing spondylitis and gut microbiota: A two-sample mendelian randomization study. Nutrients. 15 (4), 1057(2023).
  5. Lee, D. S., et al. Simultaneous profiling of 3D genome structure and DNA methylation in single human cells. Nat Methods. 16 (10), 999-1006 (2019).
  6. Martini, E., et al. Single-cell sequencing of mouse heart immune infiltrate in pressure overload-driven heart failure reveals extent of immune activation. Circulation. 140 (25), 2089-2107 (2019).
  7. van der Ende, M. Y., Said, M. A., van Veldhuisen, D. J., Verweij, N., van der Harst, P. Genome-wide studies of heart failure and endophenotypes: Lessons learned and future directions. Cardiovasc Res. 114 (9), 1209-1225 (2018).
  8. Inoue, S., et al. Drebrin-like (Dbnl) controls neuronal migration via regulating N-cadherin expression in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 39 (4), 678-691 (2019).
  9. Luo, X., et al. Chamber-enriched gene expression profiles in failing human hearts with reduced ejection fraction. Sci Rep. 11 (1), 11839(2021).
  10. Lingscheid, T., et al. Pharmacokinetics of nirmatrelvir and ritonavir in COVID-19 patients with end-stage renal disease on intermittent hemodialysis. Antimicrob Agents Chemother. 66 (11), e0122922(2022).
  11. Hatton, A. A., et al. Genetic control of DNA methylation is largely shared across European and East Asian populations. Nat Commun. 15 (1), 2713(2024).
  12. Bense, R. D., et al. Relevance of tumor-infiltrating immune cell composition and functionality for disease outcome in breast cancer. J Natl Cancer Inst. 109 (1), djw192(2017).
  13. Hu, C., et al. CellMarker 2.0: An updated database of manually curated cell markers in human/mouse and web tools based on scRNA-seq data. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D870-D876 (2023).
  14. Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
  15. Zhang, Y., et al. CellCall: integrating paired ligand-receptor and transcription factor activities for cell-cell communication. Nucleic Acids Res. 49 (15), 8520-8534 (2021).
  16. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol. 32 (4), 381-386 (2014).
  17. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  18. Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  19. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  20. Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
  21. Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins. 65 (3), 712-725 (2006).
  22. Zahn, D., Schilling, B., Kast, S. M. Enhancement of the wolf damped coulomb potential: Static, dynamic, and dielectric properties of liquid water from molecular simulation. J Phys Chem B. 106 (41), 10725-10732 (2002).
  23. Valdés-Tresanco, M. S., Valdés-Tresanco, M. E., Valiente, P. A., Moreno, E. gmx_MMPBSA: A new tool to perform end-state free energy calculations with GROMACS. J Chem Theory Comput. 17 (10), 6281-6291 (2021).
  24. Davis, A. P., Wiegers, T. C., Johnson, R. J., Sciaky, D., Wiegers, J., Mattingly, C. J. Comparative toxicogenomics database (CTD): Update 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D1257-D1262 (2023).
  25. Stiber, J. A., et al. The actin-binding protein drebrin inhibits neointimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (5), 984-993 (2016).
  26. Liu, N., et al. HIP-55/DBNL-dependent regulation of adrenergic receptor mediates the ERK1/2 proliferative pathway. Mol Biosyst. 10 (7), 1932-1939 (2014).
  27. Bai, Y., et al. Identification of drug targets for Sjögren's syndrome: Multi-omics Mendelian randomization and colocalization analyses. Front Immunol. 15, 1419363(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DBNL IL 6 JAK STAT3 PI3K AKT mTOR
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.