$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت الموافقة على بروتوكول دراسة الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة تشونغتشينغ الطبية (IACUC-CQMU-2025-10073).
تحضير الكسر المخصيب باللاكتون بالسيسكويتربين (SLEL)
المواد الطبية المجففة من Eupatorium lindleyanum DC. تم سحقها وتعرضها لاستخراج الارتجاع مرتين باستخدام 70٪ (V/V) إيثانول تحت ضغط منخفض. تم إجراء كل استخراج بنسبة مذيب إلى مادة 10:1 (v/w) لمدة ساعتين. تم ترشيح المستخلصات المجمعة، وتركيزها تحت ضغط منخفض عند ≤60 درجة مئوية، ثم تجفيفها بالتجميد بالتفريغ للحصول على مسحوق مستخلص الإيثانول الخام.
تم إذابة المستخلص المجفف بالكامل في ماء مقطر (التركيز النهائي: 100 ملغ/مل) وخضع تدريجيا لكروماتوغرافيا راتنج البولي أميد، تلاها كروماتوغرافيا راتنج الامتصاص المسامي D101 لإثراء اللاكتونات السيسكويتيربينية. بعد الوصول إلى توازن الامتصاص، تم غسل راتنج D101 بالماء المقطر لإزالة الشوائب القطبية ثم تفريغ بالإيثانول اللامائي. بعد إخراج الإيثانول، تم تركيز القطعة المجمعة تحت ضغط منخفض وخضعت للتجفيف بالتجميد لإنتاج جزء SLEL، الذي يخزن عند −20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
تم تحقيق الفصل على منصة UPLC باستخدام نظام طور متحرك ثنائي من الأسيتونيتريل وحمض الفورميك 0.1٪ (v/v) في الماء. تضمن برنامج التدرج ممسكا متساويا لمدة 25 دقيقة في بداية عند محتوى عضوي منخفض، ومنحدر خطي قصير إلى 70٪ أسيتونيتريل بنسبة 70٪، وطور خطوة عضوي عالي عند 90٪ أسيتونيتريل (أسيتونيتريل)، وخطوة توازن نهائية تعود إلى شروط البداية. تم تشغيل النظام عند 0.25 ملم·دقيقة⁻1 مع درجة حرارة عمود 35 درجة مئوية وحجم حقن 0.1 ميكرولتر (الشكل التكميلي S1).
الحيوانات
تم استخدام ما مجموعه 36 ذكرا من جرذ سبراج-داولي (200 ± 20 جرام) و36 ذكرا من فأر BALB/c (20 ± 2 جم) في هذه الدراسة. تم إيواء الحيوانات في ظروف موحدة (22 ± 2 درجة مئوية، 55 ± 5٪ رطوبة، 12 ساعة دورة ضوء/ظلام) مع إمكانية الوصول المجاني للطعام والماء. تم تأقلم الحيوانات لمدة 7 أيام قبل التجارب ومراقبتها يوميا للتأكد من صحتها العامة. تم إجراء جميع الإجراءات لتقليل معاناة الحيوانات، وتم تطبيق التخدير قبل جمع الدم وجمع الأنسجة.
وذمة الأذن الناتجة عن الزيلين في الفئران
تم تأسيس نموذج وذمة أذن الفأر كما هو موضح سابقا9. بعد التكيف، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى ست مجموعات (n = 6 لكل مجموعة): مجموعة ضابطة (CG)، النموذج (MG)، ديكساميثازون (DEX، 10 ملغ/كغ)، وSLEL الجرعة المنخفضة (75 ملغ/كغ)، الجرعة المتوسطة (150 ملغ/كغ)، والجرعة العالية (300 ملغ/كغ). تم إعطاء جميع العلاجات عن طريق التمقاء الفموي مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام متتالية (حجم الجرعة النهائية: 10 مل/كغ). بعد ساعة ونصف من الإعطاء النهائي، تم تحفيز الالتهاب عن طريق تطبيق 30 ميكرولتر من الزيلين بشكل متساو على سطحي الأذن اليمنى، باستثناء المجموعة الضابطة. بعد ثلاثين دقيقة، تم تخدير الفئران، وجمع عينات دم، والحصول على ثقب دائري للأذن بقطر 8 مم من نفس المواقع التشريحية لكلتا الأذنين.
وذمة مخالب ناتجة عن كاراجينان في الفئران
تم تأسيس نموذج وذمة مخلب الجرذان باستخدام الكاراجينان كما وصفسابقا 10. تم توزيع الفئران عشوائيا إلى ست مجموعات (n = 6 لكل مجموعة): مجموعات CG، MG، DEX (5 ملغ/كغ)، وSLEL الجرعة المنخفضة (50 ملغ/كغ)، الجرعة المتوسطة (100 ملغ/كغ)، والجرعة العالية (200 ملغ/كغ). تم إعطاء العلاجات عن طريق الفم مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام (10 مل/كغ). تم قياس حجم الأقدام الأساسية قبل الجرعة النهائية. بعد ثلاثين دقيقة من آخر إعطاء، تم حقن 0.1 مل من محلول كاراجينان بنسبة 1٪ (مع الزجاج) تحت الجلد في السطح الأخمصي للكف الخلفي الأيمن. تم قياس حجم الأرجل عند 1 و2 و3 و4 ساعات بعد الحقن باستخدام جهاز قياس البلثيسمومتر. تم حساب وذمة الأرجل كما يلي:
وذمة الكف (٪) = (Vt − V0) / V0 × 100٪
الفحص النسيجي
تم جمع أنسجة الأذن والكف فور إجراء التقييمات الوظيفية. تم تثبيت الأنسجة في فورمالين مخزن 10٪ محايد لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وتم تضمينها في البارافين، وقطعت (5 ميكرومتر)، وصبغت ب H&E وفقا للبروتوكولاتالقياسية 11.
اختبار التغذية المناعية المرتبطة بالإنزيمات (ELISA)
تم الحصول على عينات المصل عن طريق الطرد المركزي عند حرارة 3000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم قياس مستويات TNF-α وIL-6 وIL-1β باستخدام مجموعات ELISA التجارية المتوفرة وفقا للبروتوكولات القياسية.
تحليل البقع الغربية
تم تحضير مستخلصات البروتين الكاملة من أنسجة الأذن والكف باستخدام محلول تحلل RIPA مع مكمل بمثبطات البروتياز والفوسفاتاز. تم قياس تركيزات البروتين باستخدام اختبار BCA، وتم تحليل كميات متساوية من البروتين (30 ميكروغرام لكل عينة) بواسطة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF. تم حجب الأغشية بحليب خالي من الدهون بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، تلاها الحضانة بالأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية خلال الليل، والأجسام المضادة الثانوية المرافقة ب HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم اكتشاف النطاقات المناعية النشطة باستخدام تعزيز التلميع الكيميائي وقياسها باستخدام برنامج ImageJ.
PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الأذن والكف باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي المدرج في جدول المواد. تم نسخ ميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام مجموعة نسخ عكسي تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء PCR الكمي باستخدام كيمياء SYBR Green مع بادئات جينية محددة (الجدول 1) في حجم تفاعل بحجم 10 ميكرولتر تحت بروتوكول تضخيم ذو خطوتين. يتم توفير شروط النسخ العكسي التفصيلية ومعلمات دورة PCR في قسم البروتوكول. تم حساب مستويات النسخ النسبية باستخدام طريقة 2⁻ΔΔCT ، مع استخدام Gapdh كجين مرجعي داخلي.
البيانات والتحليل الإحصائي
تعبر البيانات كمتوسط ± SD. أجريت المقارنات الإحصائية بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب غير المرتبط، بينما تم تطبيق ANOVA أحادي الاتجاه للتحليلات التي تشمل أكثر من مجموعتين. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها p < 0.05. تشير الدلالة إلى أن # p < 0.05 و ## p < 0.01 مقابل مجموعة الضابطة (CG)، و* p < 0.05 و ** p < 0.01 مقابل مجموعة النموذج (MG).