Method Article

بروتوكول مجهر متعدد العلامات لتحديد موقع جزيء واحد لدراسة الكروماتين في البيئة النووية الكثيفة

DOI:

10.3791/69868

⸱

June 5th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكول تلوين وتحليل مجهر تحديد موقع الكروماتين الجزيء الواحد (SMLM) بثلاثة ألوان يتيح إمكانية إعادة رسم الخرائط بين يوكروماتين وغير متجانس الكروماتين وRNAP II للتحليل المكاني. يتيح هذا البروتوكول وضع علامات متعددة الألوان بكفاءة في البيئات النووية الكثيفة، بما في ذلك الأهداف المرتبطة بالكروماتين، مما يسمح بالكشف المتزامن بشكل موثوق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورت المجاهر فائق الدقة قدرتنا بشكل كبير على استجواب البنى البيولوجية إلى ما بعد حد الحيود، مما جعلها ضرورية لدراسة البنى النووية المكتظة مثل الكروماتين، واللمينا النووية، والأجسام النووية مثل النوكليولات. يظهر الكروماتين تنظيما متعدد المقاييس—من نيوكليوسومات بحجم النانومتر إلى مجالات بحجم ميكرون—مما يتطلب أساليب تصوير قادرة على تحقيق دقة عالية وخصوصية جزيئية في آن واحد. يمكن مجهر تحديد موقع الجزيئات الفردية (SMLM)، وخاصة المجهر البصري العشوائي (STORM)، من رسم خرائط دقيقة للعلامات اللاجينية، مما يوفر رؤى حاسمة حول بنية الكروماتين ووظيفتها. ومع ذلك، فإن التصوير متعدد العلامات في البيئة النووية يشكل تحديات فريدة، بما في ذلك انخفاض وصول الأجسام المضادة، وزيادة الارتباط غير النوعي، وعدم استقرار الفلوروفور. لمعالجة هذه المشكلات، نقدم بروتوكول ملصق مناعي متسلسل محسن للبيئات النووية عالية الكثافة، مما يتيح SMLM ثلاثي الألوان قوي مع تداخل أقل قدر وأقل تدهور للإشارة. تشمل هذه الطريقة تركيبات حازمة محسنة، واختيار الفلوروفور، واستراتيجيات التحقق من صحة الأجسام المضادة لضمان إمكانية تكرار وتصنيف عالي الدقة عبر عدة أهداف. ومن المهم أننا ندمج هذا البروتوكول مع خط أنابيب تحليل حسابي يستفيد من التوطين من هدف جزيئي واحد كنقاط تثبيت مكانية (نقاط البذرة) لقياس المسافات بين الأهداف، والكثافات المحلية، والترابط متعدد التسميات. يتيح ذلك تحليلا مكانيا مفصلا لمكونات الكروماتين على المستوى النانوي. يعمل هذا البروتوكول كإطار عمل قابل للتكرار للتصوير متعدد المكونات والتحليل الكمي في بيئات تحت الخلية الكثيفة، ويوفر أداة قوية للباحثين الذين يحققون في البنى النووية المعقدة مثل الكروماتين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مكن ظهور المجهر لتحديد الموقع للجزيء الواحد (SMLM) من استكشاف غير مسبوق للهياكل البيولوجية على مقياس النانومتر 1,2,3,4,5. بعيدا عن التصوير بهدف واحد، ساهم التوسع إلى SMLM متعدد الألوان في تطوير المجال من خلال السماح بتصور متزامن لأنواع جزيئية متعددة، بالإضافة إلى العلاقات المكانية والزمانية بين هياكل الحيودتحت الحيود 6,7,8,9,10,11 . ومع ذلك، لا يزال تطبيق SMLM متعدد الإرسال على تعديلات الهيستونات الموزعة بكثرة تحديا بسبب الطبيعة البوليمرية الكثيفة للحمض النووي النووي وقلة الوصول إلى الأجسام المضادة داخل هذا البيئة 12,13,14,15,16,17,18.

يظهر الكروماتين تنظيما هرميا متعدد المستويات يمتد على عدة مراتب حجم، من تجمعات النيوكليوسومات على مقياس النانومتر إلى بنية نووية بمقياس ميكرومتر. على أكبر المقاييس، تحتل الكروموسومات مناطق كروموسومات مميزة، حيث يقسم الجينوم إلى أقسام A/B ومجالات مرتبطة طوبولوجيا (TADs) التي تحد من التفاعلات التنظيمية طويلة المدى من خلال آليات مثل بروز الحلقة 19,20,21,22. عند مقاييس أقل من 200 نانومتر، ينظم الكروماتين كبوليمر غير منظم يتكون من مجالات تعبئة غير متجانسة (PDs) بدلا من كتل يوكروماتين وغير متجانسة منفصلة، مع مناطق نشطة نسخيا تفضل أن تتمركز ضمن حدود الباركنسون23، 24، 25، 26، 27، 28، 29. على أصغر المقاييس (5-20 نانومتر)، يتكون الكروماتين من تجمعات نيوكليوسومية غير منتظمة وقوابض نيوكليوسوم، مما يبرز غياب نمط طي موحد من الدرجة العليا ويبرز الطبيعة الناشئة والمعتمدة على المقياس لتنظيم الجينوم 24,26,30. مع التقدم السريع في الأساليب القائمة على التسلسل مثل تسلسل الكروماتين بالتقلل المناعي والتقاط تكوين الكروماتين عالي الإنتاجية 19,30,31,32,33، تم تحديد خصائص مختلفة للهياكل التنظيمية على مقياس الكروماتين31,32. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات، على عكس التصوير، تفشل في التقاط الهندسة المكانية التي لا تلاحظ إلا بعد حل هذه الهياكل. كشفت طرق المجهر الإلكتروني مثل مجهر الكروماتين الإلكتروني (ChromEM24) وميكروسكوب الكروماتين الناقل (ChromSTEM25) أن الكروماتين غير متجانس ومنظم في مجالات تعبئة بمقاييس طولية تتراوح بين 50-200 نانومتر25، 28، 29. بينما تتيح هذه التقنيات دقة مذهلة لتحديد مجالات تعبئة الكروماتين، إلا أنها لا توفر خرائط جزيئية محددة كما يقدمها SMLM. يتيح تراكم نقاط الحمض النووي للتصوير في الطبوغرافيا النانوية (DNA-PAINT22) والتهجين الفلوري المتقاطع في الموقع (FISH)19من التعدد المتعدد الأبعاد عالي النقل؛ ومع ذلك، يتأثر DNA-PAINT بشدة بالضوضاء الخلفية المرتفعة الناتجة عن أحداث الارتباط العشوائية في البيئة النووية الغنية بالأوليجونكليوتيدات12،34، بينما تتطلب طرق FISH التقليدية القائمة على تغيير الحرارة اضطراب طي الكروماتين الأصلي. وقد طبقت دراسات سابقة تقنيات تصوير فائقة الدقة لدراسة الكروماتين بهذا المقياس الطولي وحددت تركيبا هجينا لمجالات التعبئة، مقابل نماذج فصل الطور السابقة 12,23,34,35. ينبع هذا البروتوكول من ورقة منشورة سابقا تناقش الأهمية البيولوجية لهذه النتائج.34. لذا، وبالنظر إلى دقته العالية وقدراته على التعدد، يظل dSTORM القائم على التلوين المناعي هو الاستراتيجية الأكثر جدوى لتصوير الكروماتين متعدد الألوان في ظروف شبه أصلية.

هذا البروتوكول ليس الأول الذي يثبت وضع علامات على أكثر من هدفين نوويين، حيث قامت دراسات سابقة بتصنيف مركبات بروتينية فردية أو جينات12,36. على الرغم من نجاح وسم تعديلات الهيستون بعد الترجمة للنوكليوسوم، إلا أن وضع علامات SMLM متعدد الألوان والتصوير والتحليل يمثل تحديات كبيرة. أولا، يتطلب التلوين المناعي في بيئة الكروماتين الكثيفة تحسين تركيز الأجسام المضادة، وتسلسل الحضانة، وتركيب المخزن لضمان الاختراق والارتباط الكافيين دون خلفية مفرطة. ثانيا، من الضروري إجراء تحليل شامل لعدة ملصقات، حيث من المرجح أن تمتد التفاعلات بين يوكروماتين وغير الكروماتين وإنزيمات مثل بوليميراز RNA إلى ما هو أبعد من الاستبعادات الثنائية البسيطة. حتى الآن، يبقى الحد الأقصى لعدد الألوان المعروضة في تصوير الكروماتين dSTORM اثنينمن 18، 37، 38، 39.

نقدم هنا بروتوكولا قويا لتصوير وتحليل SMLM بثلاثة ألوان. يعمل سير العمل في التلوين لدينا على تحسين وقت حضانة الأجسام المضادة ويستخدم مخازن تصويرمحسنة 40لجلسة تصوير طويلة لعدة ملصقات. كما نصف خطوط الأنابيب الحسابية لتحليل المسافة بلونين وتحليل كثافة المفاصل بثلاثة ألوان، مما يمكن من توصيف كمي للعلاقات بين الكروماتين المختلط، والإيكروماتين، وآلات النسخ. على عكس الدراسات السابقة للكروماتين ذات اللونين التي اقترحت فصل الكروماتين غير المتجانس عن يوكروماتين، يكشف تصوير الكروماتين بثلاثة ألوان أن الجينوم منظم في مجالات تعبئة، مع وجود يوكروماتين والنسخ النشط في محيط النوى غير المتجانسةالمكونة 34.

يوفر هذا البروتوكول للمجتمع إطارا قابلا للتكرار لإجراء SMLM الكروماتين متعدد الألوان، ويضع استراتيجيات تحليل مناسبة لأهداف نووية متعددة متقاربة وظيفيا. من خلال سد الفجوات المنهجية، يمكن الاستكشاف المنهجي لتنظيم مجال الكروماتين على المستوى فوق النووي، مكملا لنهج التسلسل والمجهر الإلكتروني مع الحفاظ على البنية النووية الأصلية. هذه المقالة هي بروتوكول موسع لورقة منشورةرقم 34.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: سيتم تقسيم قسم البروتوكول التالي إلى عملية التلوين وعملية الاقتناء الموضحة أدناه. للحصول على دروس تحليل البيانات، يرجى الرجوع إلى المنشورالمرتبط رقم 34 الذي يوضح تحليل التعديلات المتعددة على الهيستون الموسومة.

1. عملية التلوين:

ملاحظة: طوال البروتوكول، هناك ذكر لأطباق بحجم 35 مم أو 8 أطباق مزودة بغرف جيدة. هذه هي الأوعية التي يستخدمها مجموعتنا لزراعة الخلايا، رغم أن الطرق الأصغر والأكثر كفاءة ممكنة. تأكد من الحفاظ على التركيزات الموصى بها للأجسام المضادة المخازلة عند استخدام مواد بديلة. نظرا للطبيعة المتسلسلة لهذا البروتوكول، فإن اختيار الأجسام المضادة مهم لنجاح وضع العلامات. نستخدم المنطق القياسي لضمان أن الأجسام المضادة لمضيفنا لأهدافنا مختلفة بحيث يمكن للأجسام المضادة الثانوية استهداف أنواع مضيفة مختلفة مما يقلل فعليا من التأثيرات خارج الهدف. يتم تحديد ترتيب الوسم بناء على موقع الهدف داخل النواة. نظرا لأننا نستهدف مجالات تعبئة الكروماتين25، 28، 34، 35 ونفهم أن هذه عملية مدفوعة بالانتشار، فإننا دائما نضع علامات على الأهداف غير المتجانسة أولا، ثم يوكروماتين وأخيرا RNAPII لتقليل الاستبعاد الفراغي في المناطق الكثيفة غير المتجانسة اللون. تم تحسين المخازن المؤقتة تجريبيا أثناء تطوير البروتوكول. وجدنا أن إدراج مصل الماعز بعد الهدف الأول كان مفيدا في تقليل التأثيرات خارج الهدف في الخطوات اللاحقة.

  1. تحضير المخزن المؤقت
    1. مكونات المخزن المؤقت:
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول المكونات بما في ذلك أوقات التخزين والتحضير، يرجى مراجعة جدول المواد. نوصي بأن يكون لدى المستخدم جميع الحلول جاهزة قبل بدء البروتوكول لتجنب الأخطاء التجريبية. يجب أن يكون محلول التبريد أخيرا.
    2. اصنع مخزن حجب
    3. وزن ألبومين مصل البقر (BSA) بحيث يكون التركيز النهائي في حجم المخزن المؤقت المطلوب للتجربة 3٪ وأضيفه إلى أنبوب الطرد المركزي. قم بإمالة الأنبوب بزاوية 45° بحيث تنتشر بلورات BSA داخل الأنبوب، ثم أضف محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يتم ذلك لمنع تكون كتل بلورة لا تذوب.
    4. اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب جميع البلورات. لا تهز الأنبوب أو الدوامة - فهذا سيسبب تكون فقاعات تجذب البروتينات إلى السطح وتمنع BSA من الذوبان الكامل.
    5. بمجرد الذوبان الكامل، أضف ترايتون X-100 بحيث يكون تركيزه النهائي 0.2٪ (v/v) بالنظر إلى الحجم المختار في الخطوة 1.3. إذا لم تذوب البلورات بالكامل، استخدم الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط المحلول ببطء دون تكوين فقاعات.
      ملاحظة: إذا كنت تصنع محلول مؤقت معدل، أضف مصل الماعز بنسبة 10٪ في هذه العملية. ومع ذلك، يجب أن تكون المخازم الحجب المعدلة جديدة أثناء الاستخدام وعدم تخزينها لفترات طويلة، مع التأكد من أن التركيزات النهائية هي نفسها كما هو مذكور في جدول المواد - 3٪ BSA، 0.2٪ ترايتون X-100.
    6. اصنع حاجز غسيل:
      كرر الخطوات لعزل المخزن في 1.1.2، لكن استخدم التركيزات المذكورة في قسم المواد وهنا لراحتك (0.2٪ BSA، 0.1٪ Triton X-100 في 1X -DPBS، وللمعدل يشمل 1٪ مصل ماعز)
    7. اصنع حلا ثبيا:
      1. أضف PBS إلى أنبوب الطرد المركزي.
      2. أضف كمية مناسبة من 16٪ بارافورمالديهيد إلى أنبوب الطرد المركزي لتركيز نهائي قدره 4٪.
        ملاحظة: جهز الخلايا طازجة وجاهزة عند إخراج الخلايا من الحاضنة. بينما لا يستخدم المحلول المثبت الحالي عادة الجلوتارالديهايد، إلا أنه يمكن تضمينه وقد يكون مفيدا بسبب التثبيت الأكثر متانة والتثبيت الأطول مقارنة بالبارافورمالديهايد. إعداد dSTORM لا يمتلك قدرات لإشارات عمر الفلورة من جلوتارالديهايد (GA)، ومع ذلك قد يجد المستخدمون الذين لديهم القدرة ذلك مفيدا للفصل عن الهياكل الموسومة بالفلوروفور.
    8. اصنع محلول التبريد:
      1. وزن بوروهيدريد الصوديوم على ورق الوزن.
      2. جهز أنبوب الطرد المركزي.
      3. أضف بوروهيدريد الصوديوم إلى الأنبوب.
      4. أضف PBS إلى الأنبوب.
        ملاحظة: يجب أن يكون المحلول يحتوي على فقاعات بعد إضافة PBS.
    9. اصنع مخزن تصويري:
      1. قم بإذابة 1,4-ديازابيسيكلأوكتان (DABCO) في مياه خالية من الأيونات RNASE خالية من الإنزيمات DNASE لإنتاج محلول DABCO بسعة 13 مل بتركيز 1 M.
      2. أضف 12 M HCl (~240 ميكرولتر) حتى يذوب DABCO تماما ويصل الرقم الهيدروجيني إلى 8.0.
      3. تحضير 1 متر من كبريتات الصوديوم عن طريق إذابته في 10X PBS. DTT لا يحتاج إلى أي تحضير.
      4. للتحضير النهائي، استخدم المخزونات السابقة لصنع 65 ملليمول DABCO مع 30 ملليمول كبريتيت الصوديوم و30 ملليمول DTT (1 ملليبورت) في مياه منزوعة الأيون.
      5. اضبط الرقم الهيدروجيني من خلال المعايرة باستخدام HCl و NaOH حتى يصبح الرقم الهيدروجيني 8.0. تخزين التخزين مغطى ومغلق بفيلم بارافيلم عند درجة حرارة لا تزيد عن 4 درجات مئوية. راقب الرقم الهيدروجيني طوال فترة الاستخدام.
  2. تفاصيل عملية التلوين الأولى على الملصق:
    1. التعلق:
      1. خذ الخلايا الحية من الحاضنة وأخرج وسط زراعة الخلايا من الطبق. تخلص من وسط زراعة الخلايا في حاوية نفايات بيولوجية خطرة.
      2. أضف كمية كافية من PBS لتغطية الخلايا (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية للغرفة).
      3. لف الطبق بلطف لغسل الخلايا ب PBS، ثم أزل PBS من الطبق. تخلص من PBS في حاوية نفايات بيولوجية خطرة.
      4. أضف محلول مثبت كاف لتغطية الخلايا (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية الحجرة)، ثم اترك الخلايا لتثبت لمدة 10 دقائق.
      5. أثناء تثبيت الخلايا، قم بوزن بوروهيديرات الصوديوم لمحلول التبريد وضفه إلى أنبوب الطرد المركزي.
      6. أزل المحلول المثبت من الطبق وتخلص منه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة ذات العلامة المناسبة.
    2. التبريد
      1. أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية الحجرة)، ثم ضع الطبق على هزاز (أي هزاز عادي مناسب) لمدة 5 دقائق لغسل الخلايا.
      2. أزل الطبق من الهزاز، وأخرج PBS، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة ذات العلامات المناسبة.
      3. أضف كمية كافية (250 ميكرولتر، طبق 8 آبار) لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية للغرفة)، ثم ضع الطبق على هزاز لمدة 7 دقائق لتبريد التألق الذاتي في الخلايا.
      4. أثناء وجود الخلايا على الهزاز، تخلص من محلول التبريد المتبقي في أنبوب الطرد المركزي في حاوية النفايات الكيميائية السائلة الموسومة بشكل مناسب.
      5. أزل الطبق من الهزاز، وأخرج محلول التبريد، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة المميزة بشكل مناسب.
      6. أضف كمية كافية (250 ميكرولتر، طبق 8 آبار) PBS إلى الطبق لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية للغرفة)، ثم ضع الطبق على هزاز لمدة 5 دقائق لغسل الخلايا.
      7. أزل الطبق من الهزاز، وأخرج PBS، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة ذات العلامات المناسبة.
      8. كرر الخطوات 1.2.2.6 و1.2.2.7 مرتين إضافيتين (ليصبح المجموع 3 غسلات PBS).
    3. الحجب
      1. أضف ما يكفي من حاجز العزل إلى الطبق لتغطية السطح (250 ميكرولتر، طبق ب8 آبار، 1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية الحجرة).
      2. ضع الطبق على هزاز لمدة ساعة على الأقل لاختراق أغشية الخلايا وحجب مواقع الارتباط (احتل المواقع غير المحددة حتى لا تتداخل مع المواقع المستهدفة). (بينما اختبرنا عدة مرات لتحديد الحد الأدنى لمدة الحجب الناجح بأنها 20 دقيقة، نوصي بشدة بالحجب لمدة لا تقل عن ساعة واحدة أو أكثر حتى الليل. قد يكون من الضروري تحسين الهدف وخط الخلية.)
      3. أثناء وجود الخلايا على الجهاز، حضر محلول صبغ الأجسام المضادة الأولي (انظر التركيز الموصى به على موقع البائع أو راجع الجدول في قسم المواد).
      4. لتحديد الحجم الكلي لمحاليل التلوين المراد إنتاجها، أضف 0.5 مل إلى الحجم اللازم لتغطية الخلايا (مثلا لطبق واحد بحجم 35 مم، حضر محلول بحجم 1.5 مل).
      5. قم بإزالة الحجم المحدد في القسم 1.2.3.1 من مخزن المخزن الحاجب وإضافة هذا الحجم إلى أنبوب طرد مركزي جديد لتحضير محلول التلوين.
      6. أضف كمية مناسبة من مخزون الأجسام المضادة الأولية إلى المخزن الحاجب للحصول على التركيز النهائي الصحيح. يمكن العثور على حجم الأجسام المضادة الأولية لعدة أجسام مضادة شائعة الاستخدام في قسم المواد.
      7. أزل الطبق من الهزاز، أزل الحاجز الحاجز، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة المميزة بشكل مناسب.
    4. صبغة الأجسام المضادة الأولية:
      1. أضف كمية كافية من محلول تلوين الأجسام المضادة الأولية إلى الطبق لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية الحجرة)، ثم ضع الطبق على هزاز لمدة لا تقل عن ساعة إلى ساعتين حتى الليل لوضع علامات على الأهداف الخلوية.
      2. أزل الطبق من الهزاز، وأزل محلول صبغ الأجسام المضادة الأساسي، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة المميزة بشكل مناسب.
      3. أضف كمية كافية من حاجز الغسيل إلى الطبق لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية الحجرة)، ثم ضع الطبق على هزاز لمدة 5 دقائق لغسل الخلايا.
      4. أزل الطبق من الهزاز، أزل حاجز الغسيل، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة المميزة بشكل مناسب.
      5. كرر الخطوات 1.2.4.3 و1.2.4.4 مرتين إضافيتين (ليصبح المجموع 3 غسلات غسيل خازن).
      6. أثناء وجود الخلايا على الهزاز أثناء الغسيل الأخير، حضر محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي (راجع التركيز الموصى به على موقع البائع أو راجع التجارب السابقة).
      7. لتحديد الحجم الكلي لمحاليل التلوين المراد إنتاجها، أضف 0.5 مل إلى الحجم اللازم لتغطية الخلايا (مثلا لطبق واحد بحجم 35 مم، حضر محلول بحجم 1.5 مل).
      8. قم بإزالة الحجم المحدد في القسم 1.2.4.7 من مخزن العزل وإضافة هذا الحجم إلى أنبوب طرد مركزي جديد لتحضير محلول التلوين.
      9. أضف كمية مناسبة من مخزون الأجسام المضادة الثانوية إلى المخزن الحاجب للحصول على التركيز النهائي الصحيح. يمكن العثور على أحجام مخزون الأجسام المضادة الثانوية لعدة أجسام مضادة شائعة الاستخدام في جدول المواد.
      10. لف أنبوب الطرد المركزي بمحلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي بورق الألمنيوم حتى يصبح جاهزا للإضافة إلى الخلايا في الطبق.
    5. صبغة الأجسام المضادة الثانوية:
      1. أضف كمية كافية من محلول تلوين الأجسام المضادة الثانوية إلى الطبق لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية الحجرة)، ثم ضع الطبق على شاكر لمدة لا تقل عن 40 دقيقة لإضافة فلوروفورات إلى الأهداف الخلوية الموسومة.
      2. تأكد من تغطية الطبق بورق الألمنيوم لمنع تبييض الفلوروفور.
      3. أزل الطبق من الهزاز، وأزل محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة الموسومة بشكل مناسب.
      4. أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية الحجرة)، ثم ضع الطبق على هزاز لمدة 5 دقائق لغسل الخلايا.
      5. أزل الطبق من الهزاز، وأخرج PBS، ورمه في حاوية النفايات الكيميائية السائلة ذات العلامات المناسبة.
      6. كرر القسمين 1.2.5.4 و1.2.5.5 مرة أخرى (ليصبح المجموع غسلتين في PBS).
      7. يمكن الآن تصوير الخلايا أو تخزينها للتصوير لاحقا. إذا كنت تتوقع التصوير فورا، اتبع الخطوات في قسم الاستحواذ. إذا كنت تخزن للتصوير لاحقا، استمر في اتباع الخطوات التالية.
      8. أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية السطح (1 مل لطبق 35 مم و500 ميكرولتر لشريحة زجاجية للغرفة) قبل التخزين.
      9. لف الطبق بطبقة بارافيلم، ثم بورق الألمنيوم لمنع تبخر السائل وتبييض الفلوروفور.
      10. خزن الطبق الملفوف عند 4°C حتى يكون جاهزا للتصوير.
        ملاحظة: بالنسبة للملصقات المستخدمة في هذا البروتوكول، يمكن تخزين الأطباق لمدة يومين إلى ثلاثة أيام قبل أن تتأثر جودة الصورة بشكل كبير؛ ومع ذلك، قد تختلف استقرارات الأجسام المضادة المختلفة، ولكن مع التخزين المناسب، تبقى مستقرة لفترة بعد اكتمال البروتوكول. لا ينصح بتخزين طبق مميز لأكثر من أسبوع لأن المحلول المثبت غير مركز بما يكفي لتحقيق ثبات طويل الأمد.
  3. عملية تلوين الملصقات اللاحقة:
    1. الصد:
      1. راجع الإصدارات 1.2.3.1 - 1.2.3.2 لكن استخدم مخزن الحماية مع مصل الماعز. يمكن أن يكون وقت الحضانة للحجب أقصر من ساعة واحدة، لكننا نوصي بأوقات أطول مع حد أعلى ليلا (18-24 ساعة) لهذه الملصقات التالية لتقليل الارتباط خارج الهدف. يرجى الرجوع إلى التجارب السابقة.
      2. وفي الوقت نفسه، حضر محاليل الأجسام المضادة الأولية، بدلا من الحاجز العلني، في محلول الانسداد باستخدام مصل الماعز.
    2. صبغة الأجسام المضادة الأولية:
      1. جهز محلول العزل المعدل ومحلول الغسيل باستخدام مصل الماعز ومحلول غسل بمصل الماعز كما هو موضح في قسم تحضير المخزن المؤقت (buffer buffer).
      2. راجع الأقسام 1.2.3-1.2.4 (الحجب وتلوين الأجسام المضادة الأولية) باستخدام مخازن الحظر والغسل المعدلة:
        ملاحظة: يمكن أن يكون وقت الحضانة للأجسام المضادة الأولية أقصر من ساعة واحدة، وطويلا حتى الليل (8-24 ساعة). على الرغم من أن أفضل أداء في وضع العلامات تم تحقيقه مع فترات حضانة أطول، خاصة في التصنيفات المتعددة. تم إعداد البيانات في هذا البروتوكول من خلال خطوات حضانة ليلية.
      3. قبل انتهاء فترة الحضانة بقليل، جهز محاليل الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المعدل 1.1.3.
    3. صبغة الأجسام المضادة الثانوية:
      1. راجع القسم 1.2.5 (صبغة الأجسام المضادة الثانوية) لكن استخدم محلول حاجز مع مصل الماعز.
        ملاحظة: يرجى ملاحظة أن وقت الحضانة قد يكون أقصر حتى ساعة واحدة، لكننا اختبرنا أوقاتا أطول (2-4 ساعات) بأداء مشابه. بالنسبة للتسميات التالية، يرجى تكرار القسم 1.3.

2. عملية الاستحواذ

ملاحظة: لجمع البيانات، استخدم برنامج العناصر من برنامج نيكون للتصوير (NIS) المتوافق مع المجهر المستخدم. أي برنامج يمكنه التحكم في الفلتر، مسار الضوء، وإعدادات الكاميرا مناسب لهذا البروتوكول. تم تعديل بروتوكول التصوير التالي لإضاءة التألق الداخلي الكلي (TIRF) للعينة؛ ومع ذلك، فإن بروتوكول التصنيف متوافق مع أشكال متعددة من التصوير. التصوير غير المعتمد من TIRF ممكن باستخدام هذا البروتوكول لتصنيف STORM ومطلوب لتطبيقات STORM ثلاثية الأبعاد. يرجى استخدام بروتوكول قياسي لطرق التصوير البديلة.

  1. عملية تلوين الملصقات اللاحقة:
    1. قم بتشغيل المكونات البصرية المطلوبة وقم بالاتصال بالبرنامج المناسب. في معظم الحالات، كما في NIS، لن يتم تهيئة البرنامج بالكامل إلا إذا تمكن الكمبيوتر من التواصل بشكل صحيح مع المجهر والكاميرا والتحكم المسرحي.
    2. برنامج Open NIS (أو ما يعادله).
    3. إعداد العرض الحي: فعل العرض المباشر > مفتاح التبديل حافظ على التكبير التلقائي > تحت إعدادات الكاميرا، اضبط وقت التعريض إلى 30 مللي ثانية.
    4. قم بإعداد مسار البيانات للاستحواذ.
    5. انتقل إلى اللوحة العلوية اقتناء> المسار السريع في الزمن>
    6. اختر اسم الملف المناسب للاقتناء الأول وحدد عدد الإطارات إلى 10,000.
      ملاحظة: يتم اتخاذ هذه الخطوات لتحديد الوقت الذي تتعرض فيه العينة لمصدر الضوء بمجرد بدء التصوير.
    7. تأكد من أن الزاوية الحرجة والزاوية الصفرية ل TIRF مضبوطة مسبقا قبل الاستحواذ. يرجى الرجوع إلى المصادر الإلكترونية حول الدروس حول كيفية تحقيق ذلك. كما ذكرت سابقا، إذا لم تستخدم إضاءة TIRF، يمكن تخطي هذه الخطوة.
    8. اختر مسار الضوء المناسب للكاميرا وقم بتبديل خيار إضاءة الإبينيوم تحت المصابيح (على نظام NIS أو برنامج مكافئ) لضمان إعداد المرآة لإضاءة المجال الواسع من مصدر ضوء غير معتمد من الليزر القياسي.
  2. تحضير العلبة:
    1. استرجاع العينات وإضافة مخزن تصوير (الصياغة الموضحة في القسم 1.1 تحضير المخزن المؤقت) إلى العينة. (اعتمادا على المخزن التصويري المستخدم، قد تحتاج إلى اتخاذ احتياطات مختلفة. حماية العينات من الضوء.)
    2. بعد إضافة الزيت إلى الهدف، ضع العينة على المسرح مع الحامل المناسب وقم بتبديل Perfect Focus ثم ركز على العينة.
  3. خطوات التصوير:
    1. ابحث عن بقعة ليزر وانتقل إلى مكان على الطبق/اللوحة بدون خلايا.
    2. قم بتبديل إضاءة TIRF .
    3. غير المرشح ليطابق المرشح المناسب لتمرير الضوء الأحمر (أو أي ليزر استخدم لالتقاط البيانات لهذه العينة المحددة).
      ملاحظة: استخدم مرشحا متعدد الدرجات كما هو موضح في جدول المواد. الفلتر متعدد الشقوق غير ضروري، ويمكن للمستخدمين أيضا تصوير مكعبات مرشح غير مميزة مصممة للفلوروفورات المستخدمة في التلوين.
    4. شغل الليزر بأقل قدرة ليزر ~ 1 ملغاوات (يعتمد ذلك على مصدر الإضاءة لكنه يفعل لمنع التبييض العرضي) واضبط زاوية المرآة على الزاوية الحرجة.
    5. إذا لم تكن هناك خلايا قريبة، زد قوة الليزر حتى تظهر بقعة الليزر بوضوح في العرض الحي.
    6. استخدم أداة منطقة الاهتمام (ROI)، ارسم وحدد واحفظ العائد على الاستثمار في مكان موقع الليزر الموقع.
      ملاحظة: بالنسبة للعينات متعددة الملصقات، يرجى التأكد من محاذاة بقع الليزر لجميع مصادر الضوء اللازمة للعينة. في هذا البروتوكول نستخدم ثلاثة ليزرات ونتأكد من أن جميع النقاط متساوية. وهذا أمر أساسي لأن التسجيل المشترك للبيانات المكانية يتطلب محاذاة بالليزر.
    7. العودة إلى إضاءة الإبينيوم ومرشح الحقل الساطع.
    8. باستخدام أداة تعريف العائد على الاستثمار، يمكنك التنقل للعثور على خلية سليمة مناسبة (مثلا، يجب أن تكون خلية HCT116 المناسبة ذات شكل ملتصق أو متعدد الأضلاع أو بيضاوي مع حدود خلية واضحة).
    9. ركز العائد على المؤشرات على النواة واضغط موافق لتكبير موضع العائد على العائد (قم باستخدام إضاءة المجال الساطع لأن صحة الخلية لا يمكن تحديدها مباشرة من صور فلورية واسعة المجال للنواة.
    10. العودة إلى إضاءة TIRF باستخدام نفس الطريقة المستخدمة في 2.3.2.
    11. اختر المرشح المناسب لأطول طول موجة للهدف الموسوم (في معظم الحالات يكون هذا الهدف بعيد الحمراء، أي الهدف الموسوم بأليكسا فلور 647). عادة، يتم اختيار أطول طول موجة أولا لتجنب عينة تبييض ضوئي ذات أطوال موجية أقصر، في حال وجود أهداف موسمة لها ثانويات تتداخل مع الأطياف.
    12. عند طاقة الليزر المنخفضة لكل ليزر مطلوب (في حالة متعددة العلامات سيكون 3 ليزر)، شغل الليزر وإضاءة النواة لضمان محاذاة العينة بشكل صحيح.
    13. استخدم ضوابط TIRF لضمان إضاءة العينة ب TIRF.
    14. اختر الوظيفة المناسبة للاقتناء بناء على الاحتياجات. ومع ذلك، يمكن تعديل ذلك قبل الاستحواذ مباشرة.
    15. حدد وقت التعرض بناء على احتياجات الفلوروفورات (استخدم بين 10-30 مللي ثانية).
    16. انقر على شراء> تايم لابس سريع.
    17. اضبط الإطارات إلى ≥10,000 واضغط على تطبيق لإنشاء الملف في الدليل المحدد.
    18. شغل طاقة الليزر إلى 50٪ وقم بعمل عينة من التبييض الضوئي.
    19. يجب أن تتغير النواة في البداية، لكن بعد فترة قصيرة (بعد ثوان) يجب أن تبدأ في الوميض.
    20. ارجع إلى الزاوية الحرجة المطلوبة ووضعية Z عن طريق تبديل المواقع المحفوظة أو التحكم يدويا في زاوية المرآة ووضعية Z والحصول على تايم لابس سريع.
    21. تأكد من عدم وجود انحراف في المرحلة أو لن يتم تسجيل الصور متعددة القنوات بشكل صحيح. استخدم علامات ائتمانية (حبيبات دقيقة فلورية) أو حفظ موضع Z في بداية الاستحواذ لاستخدامه لاحقا لتصحيح الانحرافات باستخدام طريقة حفظ الموقع للاكتساب متعدد النقاط في الجهاز.
    22. غير الفلتر (أو اتركه إذا كنت تستخدم النقاط المتعددة مع نطاق تمرير للفلوروفور المطلوب) وكرر القسم 2.3.17-2.3.20 (للتصنيفات التالية، تأكد دائما من البدء على طاقة ليزر منخفضة، وضبط المعاملات والاكتساب).
  4. معالجة البيانات:
    1. قم بتحميل مكدس الصور الخام في FIJI باستخدام إضافة Bio-Formats. قم بإنشاء إسقاط بأقل شدة عن طريق اختيار Image> Stacks> Z Project واختيار الحد الأدنى للشدة كنوع الإسقاط. اطرح هذا الإسقاط الأدنى من مكدس الصورة الخام باستخدام Process > Image Calculator. على الصورة الناتجة، قم بطرح الخلفية (عملية > طرح الخلفية) بنصف قطر كرة متدحرجة يبلغ 5 بكسلات.
    2. حدد منطقة الاهتمام (ROI) للخلايا الفردية يدويا أو باستخدام إضافة Nuclei Outline (الإضافات > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
    3. قم بإجراء تحليل التوطين على مكدس الصور المعالجة مسبقا ضمن عائد الاستثمار المحدد باستخدام إضافة ThunderSTORM (تحليل Plugins > ThunderSTORM > Run). استخدم المعايير المناسبة لتحديد الموقع القوي (مثلا، مرشح الصورة: B-spline، الترتيب = 3، المقياس = 2؛ عتبة الشدة القصوى = 1.5× std (الموجة F1)؛ طريقة تحديد الموقع تحت البكسل: غاوسي، سيغما = 2؛ نصف قطر التوافق = 4؛ طريقة التركيب: الاحتمالية القصوى). يمكن استخدام الإحداثيات الناتجة لإعادة بناء الصورة فائقة الدقة.
    4. في التجارب متعددة القنوات، يتم دمج القنوات لتوليد صورة dSTORM مركبة معاد بناؤها من الكروماتين (صورة > ألوان > قنوات الدمج).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صور dSTORM ثلاثية الألوان الممثلة

تم اختبار بروتوكول التلوين التسلسلي المقترح لمجموعة متنوعة من خطوط الخلايا، بما في ذلك الأرومات الليفية BJ، HCT116، AC16، HeLa، MCF10A، وغيرها. يظهر الشكل 1 الصور الممثلة لخلايا BJ الليفية، وخلايا HeLa وMCF10A.

التحقق من صحة خط أنابيب التحليل باستخدام مجموعات بيانات محاكاة

استلزم تطوير بروتوكول فلورة مناعي ثلاثي الألوان إنشاء نهج حسابي متخصص قادر على التعامل مع تعقيد بيانات SMLM النووية متعددة الأهداف (الشكل 2A,2 B). نظرا لبيئة الكروماتين الكثيفة حيث تتعايش عدة أهداف بالقرب منها، قمنا بتنفيذ إطار تحليل سحابة النقاط الذي يعالج إحداثيات التوطين مباشرة بدلا من إعادة بناء الصور. يستفيد هذا النهج من أدوات تحليل التجميع الواسعة المتاحة لبيانات السحابةالنقطية 40,41,42. قمنا بتقييم منهجي قدرة خط التحليل على التمييز بين أنماط مكانية ذات معنى بيولوجي باستخدام مجموعات بيانات محاكاة مضبوطة. تم توليد أربعة أنواع من التوزيع لتمثيل سيناريوهات تنظيم الكروماتين المتميزة: التوزيع الطبيعي للتعديلات المتجمعة بإحكام، التوزيع الموحد للأنماط المتفرقة، نمذجة مناطق الاستبعاد ذات التوزيع الحلقي، والتوزيع العشوائي كضابط تنظيمي (الشكل 2C). تم ربط هذه الأنماط المحاكاة بمواقع عنقود حقيقية للكروماتين غير المتجانس مشتقة من بيانات H3K9me3 التجريبية، مما حافظ على قيود مكانية نووية واقعية. يستخدم هذا الإطار التحليلي تجميع DBSCAN (إبسيلون = 50 نانومتر، النقاط الدنيا = 3) وهو أحد الطرق العديدة لتحليل العنقود في بيانات SMLM40، 41، 42. لضمان معاملات التجميع الصحيحة، قمنا سابقا بوصف طريقة تحسين مصممة للكشف عن مجالات تعبئة الكروماتين34. يرجى ملاحظة أنه عند استخدام هذا كخطوة أولية في التحليل، سيحتاج المستخدمون إلى تحسين المعاملات التي تؤثر على الاختيار من خلال هيكل وبيئة ووظيفة هدفهم. هنا يتم تحديد حدود العناقيد من خلال حسابات الهيكل المحدب، مما يلغي الافتراضات المتعلقة بهندسة المجال. أظهر التحقق من صحتنا تمييزا واضحا بين جميع أنماط التوزيع المحاكاة من خلال ملفات مخططات المسافة المميزة (الشكل 2D). كل نوع من التنظيم المكاني أنتج توقيعات مميزة عند تحليل التوطين بالنسبة لمراكز الكروماتين غير المتجانسة. تم اختبار تحليل الإشغال المشترك باستخدام محاكاة المؤشرات المزدوجة مع علاقات مكانية مضبوطة (الشكل 2E). أعطت العلامات المفصولة مكانيا (تكوين العمودي الحلقي) كثافة فاصل دنيا كما هو متوقع، مما أدى إلى ملفات توزيع مسطحة (الشكل 2E). أنماط العلامات المتداخلة (تكوين الطبيعي-العشوائي) أدت إلى انخفاض كثافة المفاصل مع زيادة المسافة من نقاط المرجع، متطابقة مع التنبؤات النظرية. تظهر نتائج التحقق هذه قدرة إطارنا على اكتشاف وقياس علاقات الاقتران المكاني في مجموعات بيانات متعددة الأهداف المعقدة. لمزيد من المعلومات حول كيفية توليد هذه المجموعات المحاكاة، يرجى الرجوع إلى المنشورالكامل رقم 34.

نتائج تمثيلية من تحليل تنظيم الكروماتين

يكشف تطبيق نهجنا التحليلي المعتمد في العينات البيولوجية عن أنماط تنظيمية مكانية مميزة يمكن تحقيقها من خلال هذا البروتوكول. باستخدام خلايا HeLa التي تمت معالجتها باستخدام إجراء التلوين بثلاثة ألوان ل H3K9me3 و H3K27ac و RNA Polymerase II، نظهر القدرات التحليلية التي تمكنها هذه المنهجية. يعمل H3K9me3 كنظام مرجعي مثالي بناء على الأدلة المثبتة على تنظيم الكروماتين المتمركز على مقياس 200 نانومتر من خلال الدراسات فائقة الدقة السابقة23، 28، 35. يبدأ التحليل بتحديد مجالات الكروماتين غير المتجانسة باستخدام DBSCAN، والتي تصنف لاحقا حسب نصف القطر الفعال: المجالات الصغيرة (25-40 نانومتر)، المجالات المتوسطة (40-80 نانومتر)، والمجالات الكبيرة (80-253 نانومتر). هذا التصنيف في الحجم يفسر التباين الموثق في أبعاد مجالات تعبئة الحمض النووي، حيث يبلغ متوسط نطاق النطاق حوالي 80 نانومتر في نصف قطر25. تستخدم قياسات المسافة نافذة بحث نصف قطر عنقودي بمقدار 1.5x (الشكل 2B في الأعلى) لالتقاط إشارات الإيوكروماتين والبوليميراز القريبة (الشكل 3A,B).

تظهر النتائج التمثيلية أن كل من H3K27ac وRNA Polymerase II يحددان موقعا متسقا بالقرب من حدود الكروماتين المختلطة عبر جميع فئات المجالات، متوافقة مع الدراسات السابقة28،44 والنماذج لموقع النسخ بالنسبة لمجالات الكروماتين23،35،45،46. يكشف تحليل المسافة الكمي عن مواقع متوسطة قريبة جدا من أطراف المجال: تظهر المجالات الكبيرة H3K27ac عند -1.0 نانومتر وبوليميراز RNA II عند 8.4 نانومتر من الحدود، بينما تظهر المجالات الأصغر ارتباطات محيطية مماثلة مع اختلافات موقعية طفيفة. تشير هذه القياسات إلى تركيز عناصر الكروماتين النشطة عند الواجهة بين المجالات القمعية والملائمة بدلا من استبعادها تماما. يظهر تحليل كثافة المفصل قدرة البروتوكول على كشف الترابط المكاني بين الأهداف المميزة (الشكل 3C-F). يظهر التحليل بالنسبة لمجالات الكروماتين المتغاير أن كثافة المفاصل القصوى تحدث خارج حدود المجال مباشرة (r/r₀> 1)، مما يشير إلى تفضيل التمركز المشترك لناز البوليميراز H3K27ac-RNA II في المناطق الطرفية (الشكل 3G-I). تظهر هذه النتائج كيف يمكن لهذا المسار التلويني والتحليل أن يساعد في تحقيق العلاقات المكانية المعقدة في البيئات الكثيفة.

figure-results-1
الشكل 1: ثلاث صور ملونة للخلايا المستخدمة. صور ثلاثية الألوان ل (أ) بلاستات ليفية BJ (ب) هيلا و(ج) MCF10A. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: إطار التحليل الكمي لتنظيم الأهداف المكانية بالنسبة لتجمعات الكروماتين غير المتجانسة. (أ) خط أنابيب التحليل لبيانات SMLM متعددة القنوات المستخدمة في هذه الدراسة. (ب) مخطط حسابات المسافة إلى الأطراف لمجموعات الكروماتين المختلطة المحددة وطريقة عد الألفة المشتركة. تستخدم كلتا الطريقتين لتحديد ترتيب هدفين بشكل كمي بالنسبة لبنية عنقود الكروماتين المتغاير (heterochromatin). (ج) أمثلة على توزيعات التشتت حول مجموعات محددة من الكروماتين غير المتجانس مستخدمة في دراسة34 لتحديد التنظيمات البيولوجية المميزة للهياكل المستهدفة (متجمعة داخل مجال مقابل حول المجال مقابل غير مرتبطة وموزعة عشوائيا). (د) المسافة إلى مخطط النسيج المحيطي للتوزيع المركزي والموزع العشوائي والتوزيع الطولي و(ه) منحنيات الألفة المشتركة لحالات المحاكاة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: العلاقات المكانية الكمية لعلامات النسخ حول مجالات الهستون. (أ) نتائج المسافة إلى الهيستوجرام المحيطي للبيانات البيولوجية النموذجية لخلايا HeLa متعددة العلامات. للمجالات الصغيرة (<40 نانومتر)، والمتوسطة (40-80 نانومتر)، والكبيرة (>120 نانومتر) لمجموعات RNAPII و(B) H3K27ac بالنسبة لتجمعات H3K9me3. (C-E) صور نموذجية لصورة dSTORM بثلاث تسميات لخلايا HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p)، مع صورة مدمجة ومصغرة لمجال واحد. (F) ملاءمة الغلاف المحدب (الأحمر) للمجال الموضح في E مع منطقة التحليل الرمادية. (G) مخططات الألفة ل RNAPII بالنسبة ل H3K27ac و H3K27ac (H) بالنسبة ل RNAPII في العائد على الاستثمار التحليلي لجميع المجالات في بيانات متوسطة الحجم في مجموعة البيانات. (1) كثافة المفاصل في RNAPII و H3K27ac في تحليل عائد الاستثمار لجميع المجالات متوسطة الحجم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل هذا البروتوكول ذو الألوان الثلاثة لتقنية SMLM تقدما كبيرا في قدرتنا على دراسة تنظيم الكروماتين ضمن البيئة النووية الكثيفة. يوفر نهج وسم الفلورة المناعية المتسلسلة، إلى جانب تحليل السحابة النقطية المكانية الذي يستخدم تقديرات تحديد المواقع كنقاط كأساس للتحليل، أداة قوية لفحص العلاقات النانوية بين تعديلات الكروماتين المختلفة وآليات النسخ النشطة التي كانت سابقا غير قابلة للكشف باستخدام تقنيات المجهر التقليدية.

تعالج استراتيجية التلوين المتسلسل للبروتوكول التحديات الأساسية المتأصلة في التصوير النووي متعدد الأهداف. على عكس الهياكل السيتوبلازمية أو المرتبطة بالغشاء والتي تكون متفرقة نسبيا، توجد أهداف الكروماتين النووي في كثافة عالية جدا مع مجالات مكانية متداخلة. نهجنا المعدل في الحجب، الذي يتضمن مصل من أنواع مضيفة الأجسام المضادة الثانوية بعد كل جولة وسم، يمنع بشكل فعال التفاعل المتقاطع بين أزواج الأجسام المضادة مع الحفاظ على خصوصية الهدف. تضمن الحضانات الليلية عند 4°C اختراق كامل للأجسام المضادة في جميع أنحاء حجم النواة، وهو أمر حاسم لتحقيق كثافة وسم موحدة ضرورية لتحليل SMLM الكمي. ينتج هذا البروتوكول صورا بدقة 15-20 نانومتر عبر عدة خطوط خلية، مما يجعله قابلا للتطبيق على نطاق واسع لدراسات تنظيم الكروماتين.

فيما يلي نصائح لحل المشاكل لجلسة التصوير. إذا لم تبيض النوى، فإن السبب الأكثر احتمالا هو عدم كفاية شدة الليزر في العينة، وقد ينتج ذلك عن إعداد طاقة منخفضة أو زاوية TIRF غير صحيحة؛ في هذه الحالة، قم بفحص محاذاة الليزر، وزيادة قوة الليزر، وضبط زاوية TIRF بعناية. إذا كانت الوميضات في النواة قليلة جدا لكنها تبقى ساطعة باستمرار، فهذا يشير إلى أن النوى لم تفتتح بشكل كاف. إذا كانت الرمش متناثرة جدا والنوى غير مرئية على الإطلاق، فإن التفسير الأكثر احتمالا هو عدم نجاح التلوين، ويجب فحص المواد الكيميائية والأجسام المضادة قبل تكرار البروتوكول. وعلى العكس، إذا كان عدد الوميضات النووية مرتفعا جدا (وهو نتيجة مرغوبة)، فهناك حاجة إلى وقت تبييض أطول حتى يمكن رؤية الوميض الجزيء الفردي المنفصل بشكل جيد. في تجارب SMLM التقليدية، يمكن غالبا تقدير كثافة الوسم المناسبة باستخدام هياكل مرجعية محددة جيدا مثل الأنابيب الدقيقة؛ ومع ذلك، يظهر الكروماتين تنظيما متجانسا للغاية ويفتقر إلى بنية حقيقة أرضية محددة جيدا، مما يجعل هذا التقدير أكثر تحديا. استنادا إلى التحسين التجريبي والخبرة السابقة، نضمن أن كثافة التصنيف الفعالة تصل إلى حوالي 100 توطين لكل ميكرومتر مربع لتمكين إعادة بناء قوية لمجالات تعبئة الكروماتين. في بروتوكولنا، لم نستخدم أي علامات ائتمانية لكننا نوصي إذا كان لدى المستخدمين هذه العلامات الائتمانية. في تجاربنا، تبقى الإزاحات الجانبية ضمن 0.2 بكسل (أقل من ~5 نانومتر)، وهو ما يمكن تجاهله. لذلك، لم نستخدم علامات الائتمان.

يوفر اختيار H3K9me3 وH3K27ac وRNA بوليميراز II معلومات تكميلية حول تنظيم الكروماتين على المستوى النانوي. يعمل H3K9me3 كمرجع مكاني مثالي لأنه يشكل عناقيد منفصلة ومحددة جيدا تمثل الكروماتين المختلط المكون ويمكن التعرف عليها بشكل موثوق من خلال خوارزميات التجميع الآلي. يشير H3K27ac إلى الكروماتين المرتبط بالمعزز الذي يشارك بنشاط في تنظيم الجينات، بينما يشير RNA Polymerase II مباشرة إلى مواقع النسخ النشط. معا، تتيح هذه الأهداف الثلاثة دراسة كيفية تنظيم الآليات النسخية وتعديلات الكروماتين التنظيمية بالنسبة للمناطق غير المتجانسة اللون داخل البنية النووية.

يعالج إطار تحليل السحابة النقطية القيود الحرجة لدراسات تنظيم الكروماتين السابقة من خلال تمكين التحليل المكاني الشامل في البيئات النووية الكثيفة. طرق المقارنة الزوجية التقليدية لا يمكنها التقاط العلاقات المكانية المعقدة التي تحدث عندما تتعايش عدة تعديلات كروماتين داخل نفس المناطق النووية. يستخدم نهجنا تحليل كثافة المفصل لكشف أماكن التواجد المشترك بين H3K27ac وRNA بوليميراز II بالنسبة لتجمعات H3K9me3، مما يوفر معلومات كمية لا يمكن الحصول عليها من تجارب منفصلة ذات لونين.

تظهر النتائج الممثلة باستمرار نموذجا تنظيميا متماسكا بدلا من التقسيم الصارم للكروماتين. كل من H3K27ac وRNA بوليميراز II يتمركزان بشكل تفضيلي عند أطراف عنقود الكروماتين المختلط عبر أحجام مجالات مختلفة، مع القياسات الكمية التي تظهر موقعهما ضمن 10 نانومتر من حدود العنقود، مما يدعم نتائج مجموعات أخرى بطرق ونماذج نسخ مماثلة 23,28,35,45,46. يكشف تحليل كثافة المفصل أن آليات النسخ النشطة والكروماتين المرتبط بالمعزز تتزاوج غالبا في المناطق المحيطة بالمجموعات غير المتجانسة اللون. تتحدى هذه النتائج نماذج فصل الأطوار البسيطة وتدعم مبادئ تنظيمية متكاملة حيث تحافظ تعديلات الكروماتين المختلفة على قرب مكاني قريب بدلا من تشكيل أقسام منفصلة مميزة.

يتيح التصميم المعياري للبروتوكول التحقيق في أسئلة بيولوجيا الكروماتين المتنوعة من خلال استبدال الأهداف مع الحفاظ على نفس الإطار التحليلي. يمكن لدراسات توقيت التكرار أن تحل محل بروتينات دورة الخلية مثل مستضد الخلايا النووي (PCNA) وصيانة الكروموسومات الصغيرة (MCM)، بينما قد تستهدف دراسات استجابة تلف الحمض النووي γH2AX وعوامل الإصلاح. قد تفحص دراسات دورة الخلية تعديلات الهيستونات التي تتغير خلال الانقسام، وقد تركز أبحاث التمايز على العلامات اللاجينية المرتبطة بالالتزام بالنسب النسبي. يستوعب نهج الوسم المتسلسل أي تركيبة من البروتينات النووية أو تعديلات الكروماتين التي توجد لها أجسام مضادة موثوقة، مع محدودية أساسا بالتوافق الطيفي واعتبارات التفاعل المتبادل. تتيح هذه المرونة للباحثين معالجة الأسئلة الأساسية حول ديناميكيات الكروماتين خلال العمليات الخلوية المختلفة مع الحفاظ على قدرات التحليل المكاني الكمي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مؤلفو هذا البروتوكول ليس لديهم إفصاحات أو مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل منح NIH U54CA268084 و U54CA261694 و R01CA228272، ومنح مؤسسة العلوم الوطنية EFMA-1830961 وCBET-2430743، ودعم خيري من روب وكريستين جولدمان، والسيد ديفيد ساكس، ومؤسسة كريستينا كاريناتو الخيرية.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 مضاعف الإلكترونات CCD أندورDU-888U3-CSO-#BV NA
مصل البقر الألبومينسيغما ألدريتشA7030يستخدم في العزل والغسيل من الدوافع. لا تخزن مخزن حجب BSA لأكثر من شهر عند 4°؛ C
شركة تشانغتشون للصناعات البصرية التقنية المحدودة، موديل MGL-FN-532 (532 نانومتر) مزود الطاقة الصناعي (PSU-H-LED  https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
صندوق ليزر OBIS المتماسك (405 نانومتر، 488 نانومتر، 532 نانومتر، 552 نانومتر، 637 نانومتر) متماسك1228877 تصاعدت الليزرات مع 3– 10 كيلوواط/سم&زيادة 3; متوسط القدرة عند العينة، لا تقل عن 10,000 إطار يتم جمعها لكل قناة طول موجي مع  10– 30  MS  وقت الاستحواذ. 
DABCO (1,4-ديازابيسيكلو-(2.2.2)-أوكتان)سيغماD27802NA
DBPS (1X)ثيرمو فيشر14190-136NA
الماء المقطرNANAأي ماء مقطر لا بأس به 
DTT (ديثيوثرايتول)، 1Mسيغما43816NA
ثماني زجاجات تغطية جيدة الحجراتسيلفيسC8-1.5H-Nيمكن أن تكون أي صفيحة زجاجية قاعية، لكن يجب تعديل الحجم حسب الوعاء.
ضد الفأر AF568 ضد الماعزثيرمو فيشرA11004تركيز المخزون: 2 ملغ/مل<بر/> الاستقرار بعد المسموم: 2– 3 أيام
ضد الماعز للأرنب AF647ثيرمو فيشرA21245تركيز المخزون: 2 ملغ/مل<بر/> الاستقرار بعد المسم: 4– 5 أيام
ماعز مضاد للفئران A488ثيرمو فيشرA11006تركيز المخزون: 2 ملغ/مل<بر/> الاستقرار بعد المسموم: 2– 3 أيام
الأجسام المضادة الأولية H3K27acثيرمو فيشرMA5-23516تركيز المخزون: 1.0 ملغ/ملليمتر 
H3K9me3 الأجسام المضادة الأساسية  أبكامAB1769156تركيز المخزون: 1.287 ملغ/ملليتر 
أنبوب مخروطي بولي بروبيلين عالي الوضوح 15 ملمتر   كورنينغ 352096يستخدم في حلول التثبيت والتبريد  
أنبوب مخروطي بولي بروبيلين عالي الوضوح 50 ملكورنينغ352070تستخدم لمخزون 40 مل من مخازن العزل والغسل العاملة
حمض الهيدروكلوريك (HCl)، 12Mسيغما258148NA
نيكون إكليبس Ti-E مع نظام تركيز مثالي  نيكونTI-DH 611392 المجهر المقلوب 
نيكون SR APO TIRF، تكبير 100x، 1.49 NA نيكونhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
مصل الماعز العاديأبكامAB7481-1002تستخدم بعد الانتهاء من الملصق الأول. يجب أن يكون موجودا في مخازن الحجب والغسل
Paraformaldehyde 16 ٪ علوم المجهر الإلكتروني15710يستخدم في محلول مثبت يجب أن يستهلك خلال أسبوعين من التحضير. ابق محميا من الضوء عند 4&درجة؛ C
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 10XأمبيونAM9625NA
أطراف Pipette 1000 ميكروSureOne02-707-404أي رأس ماصة جيد طالما أنه s مناسبة للحجم
RNAPII-PS2أبكامAB252855تركيز المخزون: 0.98 ملغ/مل
بوروهيدريد الصوديومثيرمو فيشرS678-10استخدم المخزن الطازج للتبريد في كل مرة.
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)ثيرمو فيشر  A16037.36NA
كبريتات الصوديومسيغماS0505NA
ترايتون X-100 10٪ثيرمو فيشر  28314NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).">Bond, C., Hugelier, S., Xing, J., Sorokina, E. M., Lakadamyali, M. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).
  2. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).">Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).
  3. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).">Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).
  4. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).">Oddone, A., Vilanova, I. V., Tam, J., Lakadamyali, M. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).
  5. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).">Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  6. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).">Ricci, M. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).
  7. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).">Heo, S. J., et al. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).
  8. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).">Wang, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).
  9. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).">Zhang, Y., et al. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).
  10. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).">Daugird, T. A., et al. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).
  11. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).">Kant, A., et al. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).
  12. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).">Esa, A., et al. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).
  13. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).">Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).
  14. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).">Yushchenko, D. A., Bruchez, M. P. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).
  15. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).">Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).
  16. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).">Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).
  17. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).">Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  18. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).">Castells-Garcia, A., et al. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).
  19. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).">Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).
  20. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).">Nuebler, J., Fudenberg, G., Imakaev, M., Abdennur, N., Mirny, L. A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).
  21. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).">Davidson, I. F., Peters, J. M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).
  22. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).">Schueder, F., et al. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).
  23. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).">Miron, E., et al. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).
  24. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).">Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).
  25. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).">Li, Y., et al. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).
  26. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).">Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).
  27. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).">Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  28. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).">Li, Y., et al. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).
  29. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).">Li, W. S., et al. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).
  30. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).">Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  31. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).">Li, A., et al. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).
  32. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).">Szabo, Q., Bantignies, F., Cavalli, G. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).
  33. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).">Satam, H., et al. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).
  34. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).">Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).
  35. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).">Almassalha, L. M., et al. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).
  36. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).">Yin, Y., Lee, W. T. C., Rothenberg, E. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).
  37. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).">Xu, J., et al. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  38. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).">Xu, J., Liu, Y. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).
  39. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).">Otterstrom, J., Castells-Garcia, A., Vicario, C., Gomez-Garcia, P. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).
  40. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).">Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  41. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).">Weidner, J., et al. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).
  42. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).">Nieves, D. J., et al. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).
  43. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).">Hyun, Y., Kim, D. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).
  44. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).">Markaki, Y., et al. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).
  45. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).">Gelléri, M., Sterr, M., Strickfaden, H., Cremer, C., Cremer, T., Cremer, M. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).
  46. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).">Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationChromatin StructureSuper Resolution MicroscopySequential ImmunolabelingDense Nuclear EnvironmentThree Color SMLMEpigenetic MarksAntibody StainingFluorophore SelectionSpatial Analysis Chromatin

Related Articles