Method Article

تطوير وفعالية جسيمات سكوالين-شيداميد النانوية المستجابة للإنزيم لعلاج سرطان البنكرياس

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول تخليق وتوصيف جسيمات السكوالين-كيتوزان المعدلة بحمض الفوليك، ويقيم إفراز أدويتها المستجابية للإنزازيم وامتصاصها الخلوي في المختبر، ويطبقها لتعزيز علاج سرطان البنكرياس عبر التوصيل المستهدف.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا لمعالجة الاختراق المحدود داخل الورم للأدوية الصغيرة من الجزيئات الصغيرة الناتج عن المصفوفة الخارجية الكثيفة (ECM) لسرطان الغدة في قنوات البنكرياس (PDAC). تقدم الأدوية الممتازة إمكانات كبيرة لتجاوز هذا التحدي من خلال تعزيز اختراق الأدوية وفعالية قتل الأورام. سكوالين (SQ)، وهو مقدمة طبيعية لتخليق الكوليسترول الحيوي ذو سلامة حيوية ممتازة وتوافق حيوي، يمكن أن يحسن توافق الأغشية للأدوية المحبة للماء ويعزز امتصاصها الخلوي عند اقترانها مع عوامل كيميائية أو جزيئات صغيرة نشطة بيولوجيا. في هذه الدراسة، طورنا نظاما جديدا للدهن قائم على SQ: تم ربط دواء السرطان الكيميائي المضاد للماء تشيداميد (CHI) ب SQ عبر رابطة أميدية — وهو رابط يستجيب للبنكرياس والكاثيبسين B (إنزيمات رئيسية معبر عنها بشكل زائد في بيئة PDAC الدقيقة). أدى هذا الاقتران إلى إنتاج دواء SQ-CHI الأمفيفيلي، الذي تم تجميعه ذاتيا ليصبح جسيمات نانوية معدلة بالفولات (FA) (FA-SQ-CHI NPs). أظهرت الجرعات الهيدروديناميكية المحسنة قطرا هيدروديناميكيا موحدا ± 1.5 نانومتر، ومعامل تعدد التشتت (PDI) 0.181 ± 0.18، وقدرة تحميل دواء عالية تبلغ 59.0٪ ± 0.77٪، وإمكانات زيتا مستقرة تبلغ -13.10 ± 0.86 مللي فولت. أظهرت دراسات الإطلاق المختبري أن الممارسات العلاجية حققت 80.2٪ ± 4.22٪ من الإفراز التراكمي خلال 72 ساعة في وجود 0.25٪ من البنكرياس، بينما لوحظ فقط 33٪-38٪ في الهوامل المعدلة حسب الرقم الهيدروجيني (الرقم الهيدروجيني 4.5 أو 7.4) بدون إنزيمات. أكدت اختبارات امتصاص الخلايا أن تعديل FA حسن بشكل كبير كفاءة التوصيل داخل الخلية، مع زيادة شدة الفلورية بمقدار 1.8-2.3 مرة في خلايا PDAC (PSN-1 و CFPAC-1) مقارنة بالخلايا غير المستهدفة عند 12-24 ساعة. يوفر البروتوكول الحالي منهجية شاملة لتخليق وتوصيف الدواء الأولي، وتقييم الصناعي للحركيات المستجيبة للإنزيمات السريعة، وتحليلات مقارنة لفعالية العلاج واختراق الأنسجة، مع تسليط الضوء على المزايا الأساسية للحامل النانوي في التوصيل المستهدف، والتحميل العالي للأدوية، والإطلاق المنظم بالإنزيمات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الغدة في قنوات البنكرياس (PDAC) هو ورم خبيث للغاية في الجهاز الهضمي، بمعدل حدوث يكاد يساوي معدل الوفيات، ومعدل بقاء لمدة 5 سنوات لا يتجاوز 8٪-9٪1. البيئة الدقيقة المعقدة للورم (TME) هي السمة المميزة ل PDAC2. يتكون بشكل أساسي من مصفوفة خارج خلايا غير طبيعية (ECM)، وأروميات ليفية مرتبطة بالسرطان نشطة (CAFs)، وبيئة خلوية تثبط المناعة بشكل عميق. جهاز PDAC ECM غني بالكولاجين من النوع الأول. كل من محتواه المتغير وبنيته غير الطبيعية يدفعان إلى تقدم الورم ويرتبطان بتوقعات ضعيفة3. تعد الخلايا البثارية أكثر الخلايا الفكية وفرة وتتكون من أنواع فرعية مميزة وظيفيا، مثل الخلايا الصبغية المنتجة للمصفوفات والخلايا الالتهابية الالتهابية (iCAFs)، والتي تظهر مرونة ظاهرية4.

من الناحية المناعية، تهيمن خلايا النخاع الميلويدي المؤيدة للورم على اختبار PDAC TME. الخلايا اللمفاوية المضادة للأورام نادرة أو غير وظيفية. تساهم الخلايا اللمفاوية B الناضجة أيضا في تثبيط المناعة 3,4. مجتمعة، تضع هذه المكونات عدة حواجز علاجية. تتميز السبات الكثيفة، التي تتميز بضغط سائل بيني مرتفع، بإنشاء حاجز اختراق كبير يعيق بشدة وصول العوامل العلاجية إلى مناطق الأورام العميقة، مما يحد بشكل كبير من الفعالية السريرية للأدوية الكيميائية5. وبالتالي، فإن تطوير أنظمة توصيل الأدوية القادرة على تجاوز هذا الحاجز السمكي والتغلغل بعمق في نسيج ورم البنكرياس أمر بالغ الأهمية.

في السنوات الأخيرة، جذب السكوالين (SQ)، وهو مقدمة طبيعية لتخليق الكوليسترول الحيوي، اهتماما كبيرا بسبب سلامته البيولوجية الممتازة وتوافقه الحيوي. وبما أنها شديدة الكاره للماء، يمكن اقتران SQ مع الأدوية المحبة للماء لتكوين أدوية أولية أمفيفيلية، مما يحسن التوافق الحيوي للأدوية المحبة للماء والجزيئات الصغيرة مع أغشية الخلايا ويعزز كفاءة امتصاص الخلايا7. أظهرت دراسات سابقة أن SQ يمكن أن يتقن تساهميا مع عوامل كيميائية مختلفة مثل السيسبلاتين، الباكليتاكسيل، والجيمسيتابين، مكونة جسيمات نانوية للدواء الأولي ذات قدرة تحميل دوائية عالية، مما يحسن توصيل الدواء إلى الأورام الصلبة 8,9. تؤكد هذه الخصائص الإمكانات الواسعة للتطبيق لنظام SQ في تطوير أنظمة توصيل الأدوية.

لتعزيز استهداف الأورام، تستخدم هذه الدراسة حمض الفوليك (FA) كرابط استهداف. FA هو فيتامين قابل للذوبان في الماء وضروري لاستقلاب الكربون الواحد، والتخليق الحيوي10، وتوازن الأكسدة11، وتفاعلات المثيلة12. يمكن اقتران FA عبر مجموعات الكربوكسيل الخاصة به مع الحامل النانوي من التعرف المحددين والارتباط بمستقبل الفولات (FR)، يليه الاندوسايتوزيس الداخلي الذي يعبر عنه المستقبل13. من خلال الاستفادة من تعزيز نفاذية وتأثير الاحتفاظ بالخلايا الورمية، قام Zheng وآخرون 14 بتقييم تعبير α مستقبلات الفولات (FRα) في سرطان البنكرياس، والبنكرياس الطبيعي، والأنسجة المجاورة، والتهاب البنكرياس المزمن باستخدام Western blotting والكيمياء المناعية، وحللوا ارتباطه بالخصائص السريرية المرضية. تم التعبير عن FRα في 94.7٪ (72/76) من حالات سرطان البنكرياس، مرتبطة بالانتشار، لكنها كانت غائبة في أنسجة البنكرياس الطبيعية. يمكن للجسيمات النانوية المعدلة ب FA أن تتراكم بشكل انتقائي في الأنسجة الموجبة ل FR، مما يمكن من العلاج الموجه جزيئيا.

تشيداميد (CHI) هو مثبط جديد لهيستون دي أسيتيلاز (هيستون). أظهرت الدراسات ما قبل السريرية أنه يظهر أيضا نشاطا قويا مضادا للأورام ضد الأورام الصلبة مثل سرطان البنكرياس والثدي، ويمكنه عكس مقاومة الأدوية في خلايا الورم15,16. ومع ذلك، يرتبط محبته القوية للماء بكفاءة اختراق منخفضة في بيئة الورم الدقيقة وتوزيع ضعيف داخل الأنسجة الورمية الصلبة، مما يحد بشدة من إمكاناته العلاجية السريريةلسرطان البنكرياس. باستخدام تشيداميد (CHI) كدواء نموذجي، تقترح هذه الدراسة تحضير الجسيمات النانوية المجمعة ذاتيا عبر اقتران CHI مع SQ والتعديل اللاحق ب FA. تهدف هذه الاستراتيجية إلى تعزيز فعالية CHI المضادة للأورام ضد سرطان البنكرياس من خلال التغلب على ضعف اختراقه في البيئة الدقيقة للورم وتوزيعه غير الأمثل داخل نسيج الورم الصلب. علاوة على ذلك، من خلال تقييم فعالية CHI في المختبر في خطوط خلايا سرطان البنكرياس، من المتوقع أن يحسن هذا النهج بشكل كبير اختراق وتأثيرات CHI السامة للخلايا — وهو دواء جزيء صغير ممثل محبة للماء — داخل البيئة الدقيقة لأورام البنكرياس، مما يوفر أساسا تجريبيا لتوجيه العلاج القائم على CHI في سرطان البنكرياس.

تشرح دراستنا الإجراءات التجريبية لتحضير جسيمات البرودوين المجمعة ذاتيا من CHI-SQ-PEG-FA لعلاج سرطان البنكرياس. على وجه التحديد، نصف تحسين وتوصيف عملية التحضير لجسيمات CHI-SQ-PEG-FA النانية، إلى جانب دراسات إطلاق الأدوية في المختبر . تشمل العملية: أولا، تحسين التركيبة باستخدام نهج تجريبي بعامل واحد وتحديد الحجم الأمثل للجسيمات وتحميل الدواء؛ ثانيا، توصيف الجسيمات النانوية باستخدام اختبارات UPLC وMTS؛ وأخيرا، إنشاء نموذج ورم كروي مشترك في المختبر . باستخدام الكومارين-6 (C6) كمسبار فلوري في الجسيمات النانوية المستهدفة، نقوم بالتحقق من اختراق وتوزيع الجسيمات النانوية داخل كرويدات الأورام ثلاثية الأبعاد ونحصل على بيانات ذات صلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تركيب SQ-CHI و SQ-PEG-FA

  1. تخليق SQ-CHI: يزن 120.4 ملغ (0.3 ميليمول) من حمض 1,1',2-تريس-نورسكوالينويك ويذيب في 1 مل من النيتروجين N-ثنائي ميثيل فورماميد (DMF). أضف تدريجيا NHS (46 ملغ، 0.4 ملليمول) وEDCI (72 ملغ، 0.38 ملليمول) ودع التفاعل يستمر لمدة 90 دقيقة تحت حماية النيتروجين.
  2. قم بإذابة الشيداميد (58.56 ملغ، 0.15 ملليمول) في 1 مل من DMF وإضافته باتجاه القطرات إلى خليط التفاعل. حرك التفاعل في درجة حرارة الغرفة تحت غلاف جوي من النيتروجين لمدة 72 ساعة.
  3. بعد الانتهاء، تبخر المذيب تحت ضغط منخفض عند 5-15 كيلوباسكال للحصول على المنتج الخام. تنقية المنتج الخام باستخدام كروماتوغرافيا عمود الفلاش باستخدام تدرج التربيع DCM/MeOH (99:1، 99:5، 85:5).
  4. التحقق الهيكلي ل SQ-CHI: ضع منتج SQ-CHI المصقول في قارورة زجاجية وجففه تحت الفراغ في مجفف لمدة 24 ساعة. قم بإذابة المنتج في حوالي 1 مل من الكلوروفورم الدوتراتي (CDCl3) ونقله إلى أنبوب عينة بالرنين المغناطيسي النووي. إجراء تحليل بالرنين المغناطيسي النووي بمقدار 1H لتأكيد البنية الكيميائية للمنتج17.
  5. تخليق SQ-PEG-FA: إذابة 41.12 ملغ من حمض 1,1',2-tris-norsqualenoic في 35 ميكرولتر من DMF. أضف تدريجيا N-هيدروكسي سوكسسينيميد (NHS، 15.71 ملغ) و1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) الكربوديميد (EDCI، 24.59 ملغ) إلى هذا المحلول.
  6. دع التفاعل يستمر لمدة 90 دقيقة تحت غلاف جوي من النيتروجين. قم بإذابة 20 ملغ من FA-PEG-NH2 في 35 ميكرولتر من DMF وإضافته باتجاه القطرات إلى خليط التفاعل.
  7. حرك الخليط الناتج في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة تحت النيتروجين. قم بتنقية المنتج الخام باستخدام أنبوب طرد مركزي فائق الترشيح MWCO بقوة 3 كيلو دالتون بقوة 5,200 x جرام لمدة 30 دقيقة لإزالة الحمض الحر غير المتفاعل. ضع المحلول المائي المنقي من SQ-PEG-FA في قارورة زجاجية وقم بتجميده مسبقا عند -50 درجة مئوية. قم بتحويل المحلول المجمد مسبقا في مجفف بالتجميد للحصول على مركب SQ-PEG-FA كمسحوق متحطم.

2. التحقق الهيكلي ل SQ-PEG-FA

  1. ضع مركب SQ-PEG-FA المحمول بالليوفيليا في أنبوب طرد مركزي بسعة 2 مل وتجفيفه أكثر تحت الفراغ في مجفف لمدة 24 ساعة. قم بإذابة المنتج في حوالي 1 مل من كبريتسيد ثنائي ميثيل الدويترات (DMSO-d6) ونقله إلى أنبوب عينة NMR. قم بتحليل بالرنين المغناطيسي النووي بمقدار 1H لتأكيد البنية الكيميائية للمجمع.
  2. تحسين تحضير وتوصيف NPs SQ-CHI-PEG-FA
  3. يزن 6.64 ملغ من SQ-CHI ويذيبه في 2 مل من الإيثانول المطلق لتحضير محلول مخزون بسعة 3.32 ملغ/مل (4.3 ميكرومتر).
  4. أضف محلول الإيثانول SQ-CHI (1، 0.2، 0.1، أو 0.05 مل) باتجاه الانخفاض إلى 1 مل من الماء منزوع الأيونات أثناء التحريك. حرك لمدة 5 دقائق، ثم أزل الإيثانول عن طريق التبخر بضغط منخفض. قم بسونيكات الخليط الناتج لمدة 30 دقيقة للحصول على تعليق جسيمات CHI-SQ. قياس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) للجسيمات النانوية باستخدام جهاز الزيتازر لتحديد التركيبة المثلى18.
  5. أضف 0.1 مل من محلول الإيثانول SQ-CHI بشكل انخفاضي إلى 1 مل من الماء منزوع الأيونات بعد فترات تحريك مختلفة (0، 5، 10، أو 20 دقيقة). بعد فترة التحريك المعنية، إزالة الإيثانول عن طريق التبخر المنخفض الضغط، ثم الصوتية لمدة 30 دقيقة للحصول على تعليق جسيمات CHI-SQ النانوية النانوية. قس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر PDI لتحديد الوقت الأمثل للتحريك.
  6. أضف 0.1 مل من محلول الإيثانول SQ-CHI بشكل انخفاضي إلى 1 مل من الماء منزوع الأيونات تحت التحريك لمدة 5 دقائق. بعد التحريك، قم بإزالة الإيثانول عن طريق التبخر المنخفض للضغط. قم بسونيك الخليط الناتج لفترات مختلفة (0، 5، 20، أو 30 دقيقة) للحصول على تعليق جسيمات CHI-SQ. قس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر PDI لتحديد زمن الصوتية الأمثل.
  7. أكد الظروف المثلى بناء على النتائج السابقة. هنا، نسبة الحجم المحصل عليها من الماء إلى محلول المخزون = 10:1، ووقت التحريك = 5 دقائق، ووقت التحريك = 30 دقيقة. كرر جميع التجارب بشكل مستقل بثلاث نسخ لضمان الموثوقية.
  8. استخدم طريقة العامل الواحد مع الحفاظ على ثبات المعاملات الأخرى. تغير العوامل التالية بشكل تسلسلي لتقييم تأثيرها على توزيع حجم الجسيمات وجهد زيتا للجسيمات النانوية: نسبة الكتلة للمكونات (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0، 1:0.05، 1:0.5، 1:0.7)، نسبة حجم الطور (الطور المائي: الطور العضوي = 1:1، 1:5، 1:10، 1:20)، ووقت السونيك (5، 15، 30، 45 دقيقة).
  9. وفقا للبروتوكول المحسن، امزج محاليل مخزون SQ-CHI و SQ-PEG-FA عند النسبة المحددة. أضف هذا الخليط بشكل قطري إلى ماء منزوع الأيونات تحت التحريك المستمر. استمر في التحريك لمدة 5 دقائق لضمان الخلط الكامل. إزالة الإيثانول عن طريق تبخر خفض الضغط، ثم سونيك المجسس لمدة 30 دقيقة لإنتاج تعليق الجسيمات النانوية النهائي CHI-SQ-PEG-FA.
  10. قس القطر الهيدروديناميكي، وتوزيع الحجم (PDI)، وجهد زيتا للجسيمات النانوية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي باستخدام محلل حجم جسيمات الليزر. راقب شكل الجسيمات النانوية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM، تكبير 150,000 مرة) والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM، تكبير 80,000 مرة).
  11. تحديد محتوى تحميل الأدوية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC)
  12. اضبط الظروف الكروماتوغرافية كما يلي: عمود C18 (2.1 مم × 50 مم، 1.7 ميكرومتر); الطور المتحرك: محلول مائي 0.1٪ حمض الفورميك - الأسيتونيتريل (75:25، V/V); طول موجة الكشف: 258 نانومتر؛ معدل التدفق: 0.2 مل/دقيقة؛ درجة حرارة العمود: 23 درجة مئوية؛ حجم الحقن: 5 ميكرولتر؛ مدة العرض: 10 دقائق.
  13. أعد تركيب نظام تعليق CHI-SQ-PEG-FA NP وقم بطرد مركزه عند 7,500 × g لمدة 30 دقيقة. اجمع المادة الفائقة وتصفيها عبر غشاء دقيق مسامي بحجم 0.22 ميكرومتر. استخدم الترشيح الناتج كحل اختباري. حقن وتحليل محلول الاختبار تحت الظروف الكروماتوغرافية المحددة. احسب محتوى تحميل الدواء للجسيمات النانوية بناء على تركيز CHI المقياس في المصفح.

3. دراسة إطلاق الأدوية في المختبر

  1. قم بإزالة الماصة بدقة من محلول CHI الطازج أو تعليق جسيمات CHI-SQ-PEG-FA النانوية في كيس غسيل كلوي بوزن جزيئي يبلغ 3 كيلو دالتون.
  2. اغمر كيس الغسيل في وسط إطلاق يحتوي على تركيزات مختلفة من البنكرياس (0٪، 0.05٪، 0.1٪، 0.25٪). عند فترات زمنية محددة مسبقا (0.1، 0.5، 1، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 24، 30، 36، 48، 72 ساعة)، اسحب عينات 1 مل من وسط الإطلاق واستبدلها فورا بحجم مماثل من الوسط الطازج المسخن مسبقا للحفاظ على ظروف الغوص.
  3. تحديد تركيز CHI في جميع العينات باستخدام طريقة UPLC (الظروف الكروماتوغرافية كما هو محدد في القسم 3) وحساب الإفراز التراكمي للدواء.
  4. استخدم عازل أسيتات الأمونيوم (pH 4.5) كوسيط إطلاق. قم بإزالة الماصة بدقة 2 مل من تعليق الجسيمات النانوية في كيس غسيل الكلى (3 كيلو دالتون). أضف وحدات نشاط مختلفة (0، 0.7، 1.4، 2.8 واحد) من كاثيبسين B مباشرة إلى كيس الغسيل الكلوي. اغمر الكيس في وسط إطلاق بسعة 40 مل وحضنه في هزاز بدرجة حرارة ثابتة عند 37 ± 0.5 درجة مئوية و75 دورة في الدقيقة. عند نقاط التوقيت المحددة مسبقا (0.1، 0.5، 1، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 24، 30، 36، 48، 72 ساعة)، اسحب عينات بحجم 1 مل واستبدلها فورا بحجم مماثل من وسط طازج مسبق التسخين بنفس درجة الحموضة للحفاظ على توازن النظام.
  5. ترشيح العينات المجمعة عبر غشاء دقيق مسامي بحجم 0.22 ميكرومتر. حلل المصفى بواسطة UPLC لتحديد تركيز الدواء. احسب نسبة الإفراز التراكمية ل CHI ورسم ملفات إفراز الأدوية.
  6. قم بإدخال ماصة بحجم 2 مل من محلول CHI أو تعليق CHI-SQ-PEG-FA NP في كيس غسيل الكلى (3 كيلو دالتون MWCO). اغمر كيس الغسيل في وسط إطلاق يحتوي على تركيزات مختلفة من البنكرياس (0٪، 0.05٪، 0.1٪، 0.25٪). عند النقاط الزمنية المحددة مسبقا (0.1، 0.5، 1، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 24، 30، 36، 48، 72 ساعة)، اسحب عينات بحجم 1 مل واستبدلها فورا بحجم مماثل من وسط إطلاق طازج مسبق التسخين للحفاظ على ظروف الغسيل.
  7. قم بقياس تركيز الدواء في العينات بواسطة UPLC. احسب الإفراز التراكمي للدواء وأنشئ منحنيات الإطلاق.
  8. تقييم استقرار الجسيمات النانوية في PBS
  9. اخلط NPs CHI-SQ-PEG-FA مع PBS (pH 7.4) بنسبة 1:20 (v/v). حضن الخليط في هزاز بدرجة حرارة ثابتة عند 37 ± 0.5 درجة مئوية و100 دورة في الدقيقة. خذ عينات عند 1، 3، 6، 12، 18، 24، 30، 36، 42، 48، 72، 96 ساعة لقياس القطر الهيدروديناميكي وجهد زيتا.
  10. اختبار تكاثر الخلايا باستخدام طريقة MTS
  11. تم زراعة خلايا سرطان البنكرياس PSN-1 في وسط RPMI-1640 كامل. تم جمع الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي عن طريق الهضم باستخدام 0.25٪ تريبسين عند 37 درجة مئوية وأعيد تعليقها إلى كثافة 4-6 ×10 4 خلايا/مل في وسط كامل. تم زرع التعليق في صفائح بسعة 96 بئر بقدرة 100 ميكرولتر لكل بئر، وتم زرعه مسبقا لمدة ساعتين في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بالالتصاق الكامل للخلايا.
  12. استنشق الوسيط الثقافي الأصلي. قم بإنشاء مجموعة ضابطة (وسط زراعة فارغ) وتدرجات تركيز متعددة لمجموعات الشيداميد (0.2، 2، 8، 10، 20، 80 بيمول بتركيز)، مع ثلاثة آبار مكررة لكل مجموعة. أضف 100 ميكرولتر من الوسط الفارغ أو الخالي من الأدوية إلى كل بئر، ثم انقل صفيحة الخلية إلى الحاضنة لمواصلة الزراعة. يعالج المجموعات التجريبية ب 100 ميكرولتر من الوسط الطازج يحتوي على تركيزات متفاوتة (0.2، 2، 8، 10، 20، 80 بينوم) من SQ-PEG، أو CHI-SQ-PEG NPs، أو CHI-SQ-PEG-FA NPs، بينما تحصل مجموعة الضابطة على حجم متساو من الوسط الفارغ. بعد حضانة إضافية لمدة 96 ساعة، أزل الوسط المحتوي على الأدوية من كل بئر.
  13. أضف 20 ميكرولتر من محلول MTS العامل إلى كل بئر، يليه الحضانة لمدة 4 ساعات. اهز لوحة ال 96 بئر لمدة 15 ثانية لضمان التجانس، وقم فورا بقياس الامتصاص (قيمة A) لكل بئر عند طول موجي 490 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة. احسب معدل تكاثر الخلايا بطرح قيمة OD للمجموعة الفارغة من قيمة OD للمجموعة المعالجة بالمخدرات، وقسمة النتيجة على الفرق بين قيمة OD لمجموعة الوسط الفارغ وقيمة OD للمجموعة الفارغة، ثم اضرب في 100.
  14. تأسيس نموذج ورم سمي مشترك في المختبر
  15. امزج خلايا PSN-1 في مرحلة النمو اللوغاريتمي مع خلايا HPSC بنسبة 2:7 وزرعها في صفائح 96 بئر ذات ارتباط منخفض جدا بكثافة 5,000 خلية لكل بئر. بعد تكوين الكرويدات الورمية، يعالج الكرويدات بتركيبات نانوية مختلفة (NPs كومارين الموسومة 6 CHI-SQ-PEG/C6 وCHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) أو DMSO (كضابطة) ويحضنها معا لمدة 48 و96 و144 ساعة لتقييم فعالية الدواء.
  16. بعد الحضانة، أضف حجما متساويا من مادة اختبار قابلية الحيوية للخلية إلى كل بئر. ضع اللوحة على هز مداري وهز لمدة 15 دقيقة لضمان التحلل الكامل، ثم الحضانة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  17. انقل محلل الخلية إلى صفيحة سوداء بسعة 96 بئر. قياس إشارة التلميض الكيميائي عند طول موجي قدره 562 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوح متعدد الوظائف لقياس مدى بقاء الخلية.
  18. دراسة امتصاص الجسيمات النانوية في الخلايا
  19. تحضير الجسيمات النانوية المستهدفة (CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) والجسيمات النانوية غير المستهدفة (CHI-SQ-PEG/C6 NPs) التي تتضمن الكومارين-6 (C6) كمسبار فلوري. يزرع خلايا PSN-1 بشكل روتيني في مرحلة النمو اللوغاريتم لمدة 24 ساعة لتشكيل طبقة أحادية. قم بإذابة الكومارين 6 في الإيثانول لتحضير محلول مخزن بقوة 200 ميكروغرام/مل. اخلط 10 ميكرولتر من المحلول مع SQ-CHI و SQ-PEG-FA (أو SQ-PEG) بنسبة 1:0.7، ثم حقنه باتجاه السقوط في ماء منزوع الأيونات أثناء التحريك. حرك لمدة 5 دقائق، ثم أزل الإيثانول عن طريق التبخير، ثم استخدم سونيكات لمدة 30 دقيقة. وأخيرا، قم بالتطهير عبر الترشيح الفائق (3 كيلو دالتون، 12,000 دورة في الدقيقة، 20 دقيقة) للحصول على القطع.
  20. تعامل الخلايا على النحو التالي: تتلقى المجموعات التجريبية وسط خال من المصل يحتوي على مواد خالية من المصل تحتوي على NPs حرة من C6، CHI-SQ-PEG/C6 NPs، أو CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs (بتركيز نهائي CHI يبلغ 5 ميكرومول/لتر وتركيز C6 2.6 ميكرومول/لتر)، بينما تحصل المجموعة الضابطة على حجم متساو من الوسط الفارغ.
  21. بعد الحضانة لمدة 4 ساعات و12 ساعة و24 ساعة، استنشق الوسط المحتوي على الدواء. نوى خلايا الصبغة باستخدام 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)19.
  22. إجراء الملاحظات تحت مجهر فلوري (40x، طول موجة الإثارة Ex=360 نانومتر، طول موجة الانبعاث Em=477 نانومتر). تقييم امتصاص الخلايا للجسيمات النانوية بقياس شدة الفلورة للكومارين-6.

4. التحليل الإحصائي

  1. قم بإجراء جميع التجارب مع ما لا يقل عن 3 نسخ مكررة للحصول على البيانات المقدمة في هذه الدراسة. تحليل الإحصائيات باستخدام برنامج GraphPad Prism. عرض البيانات التجريبية كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SD)، وقارن بين المجموعات باستخدام اختبار Student t أو اختبار ANOVA أحادي الاتجاه أو اختبار Wilcoxon عند الحاجة. اضبط عتبة الدلالة الإحصائية عند P < 0.05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نجحت هذه الدراسة في تصميم وتقييم نظام جديد مستهدف لتوصيل الأدوية النانوية — جسيمات نانوية ذاتية التجميع المعتمدة على دواء شيداميد، Squalenylation Prodrug، (CHI-SQ-PEG-FA NPs؛ الشكل 1). قمنا بتخليق NPs CHI-SQ-PEG-FA (الشكل 2) وقيمنا بشكل منهجي تأثيرات معايير مختلفة، بما في ذلك نسبة طور الزيت إلى الماء (الشكل 3A)، مدة التحريك (الشكل 3B)، وظروف التحريك (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر هذه الدراسة دليلا عمليا خطوة بخطوة لتنفيذ نظام منخفض الخصر يعتمد على التجميع الذاتي للجسيمات النانوية. أظهرت الجسيمات النانوية التي تم تجميعها ذاتيا في هذه الدراسة شكل كروي منتظم، وتشتتا جيدا، وحجم جسيمات موحد، وكفاءة عالية في تحميل وتغليف الدواء، وأظهرت استقرارا مرضيا21. تم استخدام نموذج زراعة الورم الكروي ثلاثي الأبعاد (PSN-1/HPSC) لتقييم اختراق الجسيمات النانوية، مما كشف أن NPs المعدلة بحمض الفوليك CHI-SQ-PEG-FA يمكنها اختراق نواة كرويدات الورم بشكل أكثر ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنح مؤسسة العلوم الطبيعية من مقاطعة تشجيانغ (LZ23H290001، LY19H280001)؛ منح المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82474338 و 82274364)؛ برنامج التعاون بين العلوم والتكنولوجيا الزراعية في مقاطعة تشجيانغ بين المناطق الريفية الثلاث وتسعة أحزاب (2025SNJF075)؛ وكذلك مشروع أبحاث الرعاية العامة لشركة هوتشو الكبرى للعلوم والتكنولوجيا (2021GZ261); وكذلك مشروع البحث العلمي العام لإدارة التعليم في مقاطعة تشجيانغ (Y202456442، 2025YKJ10).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25٪ trypsin-EDTAجيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)25200072
1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل)كربوديميد هيدروكلوريد (EDCI)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)E6383
قوارير التبريد بسعة 2 ملكورنينج (الولايات المتحدة الأمريكية)430488
ألواح زراعة الخلايا ذات 96 بئركورنينج (الولايات المتحدة الأمريكية)3598
الإيثانول المطلقمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)100092680
الأسيتونمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)32201-2.5L
أسيتونيتريلتيديا (الولايات المتحدة الأمريكية)A998-4درجة HPLC
أسيتات الأمونيوممجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)10002861
كبريتات الصوديوم اللامائيةسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)31481
خزانة السلامة البيولوجيةثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية1380, 1332, 1356
قوارير زراعة الخلاياكورنينج (الولايات المتحدة الأمريكية)CLS430372
حاضنة زراعة الخلاياثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكيةHERA51901126
تشيداميد (تشي)شركة شنتشن للتكنولوجيا الحيوية للنواة الدقيقة المحدودة (الصين)النقاء >95٪
قارئ الميكروبليت متعدد الأوضاع من Cytation 5BioTek، الولايات المتحدة الأمريكيةCYT5MV
محرك التسخين المغناطيسي DF-101S الحراريشركة تشنغتشو كيتشوانغ للآلات المحدودة، الصين
ثنائي كلوروميثانمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)80047318
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)D2650
ديوكسانعلاء الدين (الصين)D116156-5 مل
DMEM mediumجيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)12100046
محلول دولبيكو المحلول الملحي الفوسفات (DPBS)جيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)14040141
أسيتات الإيثيلمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)10009460
الإيثيل إيثرمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)
FA2004B التوازن الإلكترونيشركة شنغهاي تيانمي للأدوات المتوازنة، الصينFA2004B
مصل البقر الجنيني (FBS)جيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)10099141C
فولات-بولي (إيثيلين جليكول)-أمين (FA-PEG-NH2)شركة شنغهاي بنغشو للتكنولوجيا البيولوجية المحدودة (الصين)PS2-NFA-2000
حمض الفورميكعلاء الدين (الصين)F112034درجة HPLC
مجفف بالتجميدثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
القسطرة البشرية Bسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)SRP0289
خطوط خلايا سرطان البنكرياس البشرية (PSN-1، CFPAC-1)مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية (ATCC)CRL-3211، CRL-1918
خلايا البنكرياس النجمية البشرية (HPaStec, HPSC)مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية (ATCC)
التربسين البشريسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)
حمض الهيدروكلوريكمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)CFSR-10011008
المجهر المقلوبأوليمبوس، اليابانIX83
وسيط دولبيكو المعدل من إيسكوف (IMDM)جيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)12440053
IX 1000 Vortex mixer شركة هانغتشو رويتشنغ للآلات المحدودة، الصينIX 1000
الميثانولمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)M433287-10L
الميثانول  تيديا (الولايات المتحدة الأمريكية)MS1922-001درجة HPLC
أنابيب الطرد المركزي الدقيق (1.5/2.0 مل)أكسجين (الولايات المتحدة الأمريكية)MCT-150-C
الميكروبايبتات (20، 100، و1000 & mu؛ L)ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية4642050, 4642070, 4642090
نظام تنقية المياه Mill-Q ميليبور، الولايات المتحدة الأمريكيةZR0Q00800
  مجموعة اختبار MTS (3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-yl)-5-(3-كربوكسي ميثوكسفينيل)-2-(4-سلفوفينيل)-2H-تترازوليوم)بروميغا (الولايات المتحدة الأمريكية)G3582
N,N-ثنائي ميثيل فوراميد (DMF)علاء الدين (الصين)
ن-بروموسوكسينيميد (NBS)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)B81255
N-هيدروكسيسوكسينيميد (NHS)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)56480
أوبتيما ماكس للطرد المركزي الفائق  بيكمان، الولايات المتحدة الأمريكية393490
محلول البنسلين/ستريبتوميسينجيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)15140-122
حمض الدوريسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)P7875
أثير البترولمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)
فينازين ميثوسلفات (PMS)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)3180806
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)70011069
بولي (إيثيلين جليكول)-أمين (PEG-NH2)شركة شنغهاي بنغشو للتكنولوجيا البيولوجية المحدودة (الصين)PG2-AM-20k
RPMI-1640 متوسطجيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية)31800022
مسحوق السيليكاسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)53698شبكة 300
بيكربونات الصوديومسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)401676
كلوريد الصوديوممجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)10019318
ثنائي كرومات الصوديوم ثنائي هيدراتسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)1.93689
سكوالينسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)Y0002131
أنابيب الطرد المركزي المعقمة (15 و50 مل)كورنينج (الولايات المتحدة الأمريكية)430791, 430828
حمض الكبريتيكمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)10021618
رباعي الهيدروفورانمجموعة الصين الوطنية للأدوية (سينوفارم)34865-4X4Lدرجة تحليلية
أنابيب الطرد المركزي فائق الترشيح (الحد للوزن الجزيئي: 3.5 كيلو دالتون)بيكمان، الولايات المتحدة الأمريكية344088

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., et al. Role of the microbiome in occurrence, development and treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 18, 173(2019).
  2. Chen, K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression. EBioMedicine. 66, 103315(2021).
  3. Mascharak, S., et al. Desmoplastic stromal signatures predict patient outcomes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep Med. 4 (11), 101248(2023).
  4. Fu, Y., et al. Unbiasedly decoding the tumor microenvironment with single-cell multiomics analysis in pancreatic cancer. Mol Cancer. 23 (1), 140(2024).
  5. Helms, E., Onate, M. K., Sherman, M. H. Fibroblast heterogeneity in the pancreatic tumor microenvironment. Cancer Discov. 10, 648-656 (2020).
  6. Navarro Chica, C. E., et al. Design and characterization of squalene-Gusperimus nanoparticles for modulation of innate immunity. Int J Pharm. 590, 119893(2020).
  7. Rodríguez-Nogales, C., et al. Squalenoylgemcitabine/edelfosine nanoassemblies: anticancer activity in pediatric cancer cells and pharmacokinetic profile in mice. Int J Pharm. 582, 119345(2020).
  8. Emamzadeh, M., et al. Dual controlled delivery of squalenoyl-gemcitabine and paclitaxel using thermo-responsive polymeric micelles for pancreatic cancer. J Mater Chem B. 6, 2230-2239 (2018).
  9. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabinelipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. Chemplus chem. 85, 1283-1291 (2020).
  10. Yang, H., et al. High-level 5-methyltetrahydrofolate bioproduction in bacillus subtilis by combining modular engineering and transcriptomics-guided global metabolic regulation. J Agric Food Chem. 70 (19), 5849-5859 (2022).
  11. De Santis, M. C., et al. Signaling pathways regulating redox balance in cancer metabolism. Front Oncol. 8, 126(2018).
  12. Rushing, B. R., et al. Exploratory metabolomics underscores the folate enzyme ALDH1L1 as a regulator of glycine and methylation reactions. Molecules. 27 (23), 8394(2022).
  13. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  14. Zheng, H. Expression and significance of molecular imaging marker folate receptor α in pancreatic cancer. J Shandong Uni Health Sci. 48 (3), 83-85 (2010).
  15. Zhang, N., et al. Chidamide combined with paclitaxel effectively reverses the expression of histone deacetylase in lung cancer. Anticancer Drugs. 31, 702-708 (2020).
  16. He, M., et al. Chidamide Inhibits Aerobic Metabolism to Induce Pancreatic Cancer Cell Growth Arrest by Promoting Mcl-1 Degradation. PLoS ONE. 11 (11), e0166896(2017).
  17. Chen, Q. B., et al. Extraction and Structural Characterization of Squalene from Siraitia grosvenorii Seeds. Guangxi Zhiwu. 26 (6), 687-689 (2006).
  18. Xu, M. Y., et al. Application Study of Nano Laser Particle Size Analyzer in Silica Sol Particle Size Testing. Diamond Abrasives Eng. 35 (02), 55-58 (2015).
  19. Shen, Z., et al. Study on the binding characteristics of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA. Acta Biophysica Sinica. (03), 352-356 (1991).
  20. Mahajan, R. R., et al. Oral Administration of Neratinib Maleate-Loaded Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles: Optimization, Physical Characterization, and In Vivo Evaluation. Pharmaceutics. 17 (2), 221(2025).
  21. Ouyang, P., Lu, Y. Research progress on dispersion stability of nanoparticles in lubricating oil. Appl Chem Ind. 51 (6), 1843-1847 (2022).
  22. Xiao, S., et al. Development and application of folic acid-conjugated starch nanoparticles as a tumor-targeting drug delivery carrier. Chin Sci Bull. 51 (10), 1151-1155 (2006).
  23. Song, Y., Shi, W., Chen, W. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. J Mater Chem. 22 (25), 12568-12573 (2012).
  24. Tie, Y., et al. Targeting folate receptor β positive tumor-associated macrophages in lung cancer with a folate-modified liposomal complex. Signal Transduct Target Ther. 5, 6(2020).
  25. Li, C., et al. Small molecule nanodrug assembled of dual-anticancer drug conjugate for synergetic cancer metastasis therapy. Bioconjug Chem. 29, 3495-3502 (2018).
  26. Dormont, F., et al. Squalene-based multidrug nanoparticles for improved mitigation of uncontrolled inflammation in rodents. Sci Adv. 6, eaaz5466(2020).
  27. Jiang, W., et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy. J Nanobiotechnol. 18, 50(2020).
  28. Yong, T. Y. Exocytosis of porous silicon nanoparticles and their application in deep tumor penetration and cancer stem cell therapy. [Doctoral dissertation]. , Huazhong Univ Sci Technol. (2017).
  29. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabine lipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. ChemPlusChem. 85, 1283-1291 (2020).
  30. Zhang, W., et al. Prodrug-like acetylmannosamine modified liposomes loaded with arsenic trioxide for the treatment of orthotopic glioma in mice. J Pharm Sci. 109, 2861-2873 (2020).
  31. Fan, X. X., et al. ROS-responsive berberine polymeric micelles effectively suppressed the inflammation of rheumatoid arthritis by targeting mitochondria. Nano-Micro Lett. 12, 76(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Responsive NanoparticlesSqualene Chidamide ProdrugPancreatic CancerExtracellular MatrixDrug PenetrationFolate Modified NanoparticlesControlled Drug ReleaseCellular UptakeTumor TargetingProdrug Synthesis

Related Articles