مقالة منهجية

التصوير الطيفي فائق الدقة لجزيئات الحمض النووي باستخدام التباين الذاتي

DOI:

10.3791/69917

⸱

مارس 6, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول عمليات مفصلة حول تحضير العينات، وجمع البيانات، وتحليل أطياف الفلورة الجوهرية للحمض النووي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أحدث التصوير فائق الدقة ثورة في البحث البيولوجي من خلال كشف التفاصيل الهيكلية على المستوى النانوي. تعتمد معظم طرق الدقة البصرية فائقة على تصنيف الجزيئات الحيوية بالفلورية، مما يمكن من تمييز أنواع جزيئية محددة لكنه قد يعطل وظائف الخلية، ويظهر أخطاء في جزيئات الربط، ويفشل في توفير كثافة وسم عالية ومتسقة المطلوبة لتصوير الكروماتين على نطاق جزيئات الحمض النووي الفردية. تقنية تتيح التصوير الجيني الخالي من العلامات والموقع بدقة نانومتر ستؤثر بشكل عميق على علم الأحياء. هنا، نقدم بروتوكولا يستغل التألق الداخلي للحمض النووي لإجراء مجهر تحديد موقع جزيء واحد طيفي (sSMLM). يشرح البروتوكول تحضير العينات، وجمع البيانات، والتحليل الطيفي. باختصار، يتم إنشاء هلام DNA رقيق عن طريق وضع محلول بولي نيوكليوتيد على الزجاج وتركه ليجف لساعات. بعد تكوين الهلام، يتم تصوير العينة بوجود مخزن تصوير باستخدام sSMLM. تتكون مجموعة البيانات المسجلة من صورة من الدرجة الصفرية، توفر توطيبا مكانيا، وصورة من الدرجة الأولى تشفر طيف الانبعاث لكل توطين. يتم توليد إعادة بناء مكانية من بيانات الدرجة الصفرية، وبعد ذلك يتم استخراج الأطياف المقابلة من إشارة الدرجة الأولى. وأخيرا، نثبت جدوى هذا النهج باستخدام أطوال موجية متعددة للإثارة وجزيئات DNA بأطوال وتسلسلات وتركيبات مختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات المجهر الفلوري فائق الدقة — بما في ذلك المجهر الإضاءة الهيكلي (SIM)، ومجهر استنزاف الانبعاث المحفز (STED)، ومجهر تحديد الموقع للجزيء الواحد (SMLM) مثل المجهر الفوتوغرافي (PALM) والمجهر البصري العشوائي (STORM) — دفعت دقة المجهر البصري إلى ما هو أبعد من حد الحيود 1,2,3,4,5,6,7، مما أتاح وصولا غير مسبوق إلى تنظيم الكروماتين على نطاق النانوية 8,9,10,11,12. ومع ذلك، تعتمد طرق التلوين الحالية لرؤية هياكل حمض النووي على وسم البروتينات المرتبطة بالحمض النووي بدلا من الحمض النووي نفسه، أو تستخدم أصباغ جزيئية صغيرة يمكن أن تزعج تكوين الكروماتين الأصلي وتضعف بقاء الخلية13,14. وبسبب هذه القيود، فإن تطوير طرق تصوير بصري فائق الدقة بدون علامات في ظروف محلية وغير مضطربة أمر مرغوب فيه للغاية. البروتوكول المعروض هنا مخصص للنوكليوتيدات الحمض النووي ذات السلسلة الواحدة أو المزدوجة السلسلة الصناعية المنقية، حيث يمكن اكتشاف الفلورة الداخلية بشكل موثوق؛ وهو غير محسن لتصوير جزيئات الحمض النووي النووي في الخلايا الثابتة أو الخلية الحية.

نظرا لأن الأحماض النووية كانت تعتبر لفترة طويلة غير فلورية بسبب انخفاض قوتها الكمومية (حوالي 10−4 تحت الإثارة فوق البنفسجية) وتحللها الفلوري فائق السرعة عند درجة حرارةالغرفة 15، كانت الدراسات حول التألق الجوهري للحمض النووي (وخاصة عمر التألق) نادرة حتى تم تطوير مطيافية الفيمتوثانية. لقد تم الاعتراف جيدا بأن النيوكليوتيدات تتوهج بشكل ضعيف تحت الإضاءة فوق البنفسجية، في حين أن امتصاصها في النطاق المرئي أضعف بكثير. ومع ذلك، لوحظ مؤخرا أن الفلورة المرئية المثارة بالضوء للأحماض النووية غير المعدلة عند تركيزات فسيولوجية ذات صلة موجودة16. من المحتمل أن هذه الظاهرة تم تجاهلها لأن معظم الدراسات الكيميائية الضوئية للنيوكليوتيدات أجريت في محاليل مخففة (10-100 ميكرومولار)17، 18، 19، 20، بينما في النوى والكروموسومات، يمكن أن تصل تركيزات الحمض النووي إلى 0.1-1 M 21,22,23. والأهم من ذلك، لوحظ تبديل الفلورة العشوائية تحت الإضاءة المرئية16، مما مهد الطريق لاستخدام الأحماض النووية غير المعدلة كعوامل تباين داخلية في المجهر فائق الدقة القائم على التمركز.

تم استكشاف الخصائص الكيميائية الضوئية لمونومرات النيوكليوتيدات وجزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة ذات التسلسلات البسيطة عند تركيزات فسيولوجية تحت إثارة الضوء المرئي24. كما ثبت أن هذه الجزيئات ذات خصائص تبديل فلورية عشوائية، وهو ما يتماشى جيدا مع نظرية استنزاف الحالة الأرضية (GSD)6,7 من خلال فحص استعادة الفلورة للنيوكليوتيدات تحت ظروف استنزاف مختلفة. علاوة على ذلك، نظرا لأن النيوكليوتيدات تظهر عوائد كمومية عالية نسبيا واحتمالية عبور منخفضة بين الأنظمة، فإن عد الفوتونات وفترات الوميض لأحداث انبعاث جزيء واحد قابلة للمقارنة مع تلك الخاصة بالأصباغ الخارجية الشائعة في STORM (مثل Alexa Fluor 647)، حيث تظهر طيفا مميزا25،26 مما يجعل الحمض النووي عامل تباين جوهري مثالي للتصوير عالي الدقة. بالإضافة إلى ذلك، يتيح تنفيذ خوارزمية الانحدار الطيفي الموضحة في القسم السابق التصوير بدقة فائقة أقل من عشرة نانومتر للعديدات وألياف الحمض النووي الخطية أحادية السلسلة27.

لالتقاط الطيف الكامل للفلورة الجوهرية للحمض النووي، استخدمنا منشور مزدوج الإسفين (DWP) للكشف الطيفي، والذي يتيح تحليل طيافيا وتصوير جزيء واحد عالي الإنتاجية مع أقل فقدان للنقل وخطأ الموجة 28,29,30، وبرنامج تحليل SMLM مفتوح المصدر (RainbowSTORM) لمعالجة البيانات التلقائية 31,32. استنادا إلى هذه القدرة، طورنا منصة SMLM متعددة الليزر متكاملة مع الكشف الطيفي وخط أنابيب تحليل طيفي مخصص. يشمل البروتوكول الذي نقدمه هنا تحضير العينات، وجمع البيانات، والتحليل، مما يوفر سير عمل قابل للتكرار لاستغلال التألق الداخلي للحمض النووي في مجهر تحديد الموقع الجزيء الواحد. بعيدا عن تمكين دراسات إثبات المفهوم على تصوير الأوليجونكليوتيدات أحادية السلسلة وجزيئات الحمض النووي ذات السلسلة المزدوجة مع التباين الجوهري، أسس هذا النهج أساسا لتطبيقات أوسع في تصوير الحمض النووي تحت ظروف طبيعية خالية من العلامات، مثل التنبؤ بالتسلسل بناء على التألق الداخلي للحمض النووي مع طرق حسابية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير عينات جل الحمض النووي (الشكل 1A)

  1. قم بإذابة عينة الحمض النووي (سواء من الأوليجونوكليوتيد أو الحمض النووي ثنائي السلسلة) في ماء منزوع الأيونات خالي من النوكلياز إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ملليمول، وتخزين محلول المخزون عند -4 درجة مئوية.
  2. تحضير 5 ميكرولتر من الليكوت لتقليل تكرار دورات التجمد والذوبان. إذا كنت تستخدم أليكوات مجمدة، قم بإذابتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-15 دقيقة حسب الحجم.
  3. نظف شريحة زجاجية بلطف باستخدام مناديل مختبر. اصنع 5 ميكرولتر من محلول جزيء الحمض النووي بحجم 100 ملليمول على شريحة زجاجية نظيفة حديثا ودعها تتبخر لمدة 1-3 ساعات، مكونة جل الحمض النووي.
  4. شغل هذه الخطوة في غطاء بخار من أجل السلامة. جهز مخزن التصوير كما هو موضح في جدول المواد. تم التحقق من صحة كل من مخزن β-ميركابتوإيثانول ومخزن DABCO لدعم التبديل الضوئي العشوائي لجزيئات الحمض النووي.
  5. شغل هذه الخطوة في غطاء بخار من أجل السلامة. أضف 5 ميكرولتر من محلول التصوير إلى جل الحمض النووي وضع غطاء غطاء فوقه مباشرة قبل التصوير. قد تكون هناك فقاعات داخل العينة المغطاة. استخدم ملقطا لإزالة الفقاعات داخل العينة المغطاة.

2. معايرة نظام sSMLM وجمع البيانات (الشكل 1B)

  1. جهز مصفوفة نانوية مصنعة بقطر ثقب 100 نانومتر وتباعد 4 ميكرومتر، مرتبة في 8 صفوف × 5 أعمدة للمعايرة التالية لنظام SMLM الطيفي33.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أيضا استخدام مخطط دقة 1951 (R3L1S4N) الخاص بالقوات الجوية الأمريكية (USAF) للمعايرة الطيفية33.
    1. إنتاج مصفوفة الهول النانوية عن طريق التمزيق المعدني المتسلسل وطحن شعاع الأيونات المركز (FIB). أولا، وضع فيلم ألمنيوم بسماكة 150 نانومتر على غطاء زجاجي بوروسيليكات بحجم 22 × 22 مم باستخدام التقطيع المستمر بقوة 75 واط مع تدفق أرجون قياسي 20 سنتيمتر مكعب في الدقيقة (SCCM) عند 3 mTorr.
    2. قم بتشكيل مصفوفة 5 × 8 نانوهول في طبقة الألمنيوم باستخدام طحن FIB يعمل بجهد تسريع 30 كيلو فولت.
  2. شغل نظام SMLM الطيفي (الشكل 2)، وأدخل مرشحات ذات عرض نطاق ترددي ضيق (532 نانومتر، 580 نانومتر، 633 نانومتر، 680 نانومتر، و750 نانومتر) مباشرة أمام الكاميرا، واستخدم مصدر ضوء أبيض (مثل مصباح المجهر) لإضاءة عينة المعايرة.
  3. اجمع 10 إطارات مع كل فلتر. اضبط وقت التعريض ل 532 نانومتر، 580 نانومتر، 633 نانومتر، و680 نانومتر إلى 200 مللي ثانية وإلى 2000 مللي ثانية ل750 نانومتر بسبب انخفاض كثافة المصباح وكفاءة الكاميرا المنخفضة في منطقة الأشعة تحت الحمراء القريبة (الشكل 3).
  4. حمل عينة جل الحمض النووي على المجهر، وتأكد من أن جانب الغطاء يواجه الهدف، وافتح برنامج الكاميرا لجمع البيانات.
  5. حدد موضع z المناسب بمساعدة نظام تتبع التركيز التلقائي، لضمان رؤية وميض عشوائي واضح. هذه الخطوة حاسمة وتتطلب الصبر لأن عينات جل الحمض النووي تفتقر إلى إشارات مورفولوجية واضحة مثل هياكل الخلية، مما يصعب التنقل نحو إشارة صحيحة.
  6. تأكد من أن الهدف لا يلامس حافة الانزلاق الداخلي، لأن ذلك قد يسبب تسرب المخزن إلى زيت الغمر ويتداخل مع التتبع.
  7. احصل على 10,000-30,000 إطار بقدرة إضاءة نموذجية تبلغ 5 كيلوواط/سم² وزمن تعريض 30 مللي ثانية. قم بضبط عدد الإطارات، وقوة الإضاءة، ووقت التعريض حسب الحاجة. بعد الاستحواذ، يقوم البرنامج بحفظ البيانات بصيغة nd2 بشكل افتراضي.
  8. بعد الانتهاء من التجربة، تخلص من شريحة الزجاج في حاوية نفايات حادة معتمدة (مثل صندوق التخلص من الزجاج المكسور أو الحاد)، وتخلص من جميع المخازن المتبقية في حاوية النفايات الكيميائية المخصصة وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية.

3. تحليل بيانات المعايرة والتحليل الطيفي (الشكل 1C)

  1. قم بتحميل مكدس الصور الخام المكتسبة من عينة الحمض النووي إلى FIJI (ويندوز 64-بت)، باستخدام إضافة Bio-Formats.
  2. اطرح الحد الأدنى للإسقاط من المكدس للحصول على مجموعة بيانات مطروحة من الخلفية وحفظها للتحليل الطيفي. بالنسبة لمكدس الصور الخام المحملة، اختر مكدس > الصورة > مشروع Z واختر الحد الأدنى للشدة في نوع الإسقاط. ثم اختر Process > Image calculator لطرح الحد الأدنى للإسقاط من مكدس الصور الخام وحفظه كملف TIFF.
  3. قم بإجراء تحديد الموقع على مكدس الصور الخام من الدرجة الصفرية باستخدام إضافة ThunderSTORM (الإصدار 1.3). استخدم المعلمات المناسبة (مثل العتبة = 1.2 × std (الموجة F1)، السيغما = 1.5، نصف قطر التركيب = 3) لإعادة بناء الصورة من الدرجة الصفرية واستخراج إحداثيات حدث الانبعاث (الوحدات: نانومتر). لتكديس الصور الخام المقصوصة من الدرجة الصفرية، اختر Plugin > ThunderSTORM > تحليل Run.
  4. استخدم FIJI وبرنامج RainbowSTORM مفتوح المصدر (رابط GitHub فيالنسخة 32، مع إصدار MATLAB أحدث من 2020b) لمعالجة بيانات المعايرة للحصول على العلاقة بين الإزاحات الأفقية والعمودية والأطوال الموجية31,32.
    1. قم بتحديد الموقع على صور المعايرة للأطوال الموجية الخمسة باستخدام إضافة ThunderSTORM. استخدم المعلمات المناسبة (مثل العتبة = 5 × std (الموجة F1)، السيغما = 1.5، نصف قطر الملاءمة = 3) لإعادة بناء توطين الفتحات النانوية على الرتبة الصفرية وتوطيفها المقابل على الرتبة الأولى.
    2. قم بضبط العتبة (مثلا، في نطاق 5-10 × std (Wave.F1)) حتى يتم تحديد 80 موقعا لكل صورة معايرة.
    3. شغل RainbowSTORM وانقر على المعايرة الطيفية > تصفح وتحميل ملفات CSV لكل طول موجي معايرة (532 نانومتر، 580 نانومتر، 633 نانومتر، 680 نانومتر، 750 نانومتر) من الخطوة السابقة. انقر على حفظ ملف المعايرة.
  5. حول الإحداثيات القائمة على النانومتر إلى إحداثيات بكسل وربط إياها بنافذة الطيف المقابلة بناء على الانزياحات الأفقية والعمودية من الرتبة الصفرية إلى الرتبة الأولى، والتي يتم تحديدها في المعايرة (الشكل 4)، لقياس الطيف الكامل للتوهج الجوهري للحمض النووي.
    1. استخدم سكريبتات بايثونالمخصصة 34 (الإصدار 3.11.7) لاستخراج بيانات الطيف الكامل من خلال الخطوات التالية.
    2. حدد مسارات الملفات الصحيحة لمكدس الصور المثبت من الخلفية (.tiff) من الخطوة 3.2، وملف CSV التوطين (.csv) الناتج من الخطوة 3.3، وملف المعايرة من الخطوة 3.4 (.mat).
    3. استخدم 900-950 بكسل كإزاحة أفقية لبيانات 488 نانومتر مكتسبة باستخدام DWP ثلاثي الأبعاد، مما يتوافق مع نافذة طيفية بين 484-588 نانومتر، أوسع قليلا من نطاق مرشح 500-550 نانومتر لضمان التغطية.
    4. استخدم 925-984 بكسل كإزاحة أفقية للبيانات التي يتم الحصول عليها ب DWP ثلاثي الأبعاد، والتي تتوافق مع نافذة طيفية 525-750 نانومتر، ومرة أخرى تم اختيارها لتكون أوسع من نطاق مرشح 590-650 نانومتر.
    5. استخدم 23 بكسل كزاوية عمودية لكل من بيانات 488 نانومتر و532 نانومتر مع DWP ثلاثي الأبعاد.
      تم اشتقاق القيم أعلاه من منحنى المعايرة الطيفية الذي تم الحصول عليه باستخدام RainbowSTORM. يمكن العثور على سكريبتات بايثون لقياس الطيف الكامل في34.
  6. خطي الطيف غير الخطي للتحليل اللاحق (المقارنة، التصنيف، إلخ) باستخدام ملاءمة متعددةحدود من الدرجة الثالثة (الشكل 3).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستغرق العملية الكاملة - من تحضير العينة إلى جمع البيانات وتحليلها - لحزمة صور واحدة من عينة الحمض النووي حوالي 120 دقيقة، بافتراض أن تكوين جل الحمض النووي يتطلب ساعة واحدة (الشكل 1). الوقت المجمع للإذابة، وتكوين الجل، والمعايرة الطيفية محدد عند حوالي 90 دقيقة، بغض النظر عن عدد الصور أو العينات في التجربة. لتعظيم الكفاءة، نوصي بجمع عدة مجموعات صور عبر عدة عينات في جلسة واحدة.

تظهر الصور الفورية الممثلة التي تم الحصول عليها بعد DWP في الشكلين 1B و3A، حيث تقسم إشارات الفلورة إلى الرتبة الصفرية (اليسار، تحتوي على معلومات مكانية) والرتبة الأولى (على اليمين، تحتوي على معلومات طيفية). في الشكل 1B، تم التقاط الصور باستخدام تكوين DWP ثنائي الأبعاد، حيث يكون الفصل بين الصور من الدرجة الصفرية والأولى صغيرا نسبيا. على النقيض من ذلك، يظهر الشكل 3A البيانات التي تم جمعها باستخدام تقنية DWP ثلاثية الأبعاد، حيث يتم فصل ترتيبي الحيود بشكل أوسع بسبب الفرق البصري المطلوب للتصوير ثلاثي الأبعاد على الطائرات ذات السطحين. تم جمع جميع البيانات المعروضة في الشكل 1C والشكل 3 والشكل 4 باستخدام تكوين DWP ثلاثي الأبعاد. يعتمد الاختيار بين التصوير ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد على الهدف التجريبي: فبالنسبة لقياسات الطيف بالفلورة الجوهرية لعينات الحمض النووي المركبة، يفضل عموما DWP ثنائي الأبعاد لأن هذه العينات تفتقر إلى الميزات الهيكلية ثلاثية الأبعاد ذات الصلة، رغم أنه يمكن أيضا استخدام تكوين DWP ثلاثي الأبعاد عند الحاجة إلى معلومات محورية.

معا، تظهر هذه النتائج التمثيلية القدرة الأساسية لمنصة التصوير المبنية على DWP على تحديد المواقع المكانية وأطياف الانبعاث من جزيئات الحمض النووي الفردية في الوقت الحقيقي. يدل الأداء السليم للنظام من خلال الفصل الواضح والمستقر بين الصورة المكانية من الدرجة الصفرية والصورة المشتتة طيفا من الدرجة الأولى، حيث يقابل كل توطين جزيء واحد في الرتبة الصفرية أثرا طيفيا مميزا في الرتبة الأولى. يتم إجراء التحليل الطيفي الكمي عن طريق تحديد أحداث جزيء واحد معزولة في الصورة من الدرجة الصفرية، وقياس الانحراف النسبي للبكسل للإشارة من الدرجة الأولى المرتبطة، وتحويل هذا التحول إلى طول موجي باستخدام دالة رسم خرائط معايرة. نظرا لأن العلاقة بين إزاحة البكسل وطول موجة الانبعاث غير خطية، يتم تطبيق ملاءمة كثيرة حدود من الدرجة الثالثة لإعادة بناء أطياف الانبعاث الخطي بدقة من البيانات الخام28. يمكن دمج الأطياف المكونة من جزيء واحد الناتج بشكل أكبر في خطوط التحليل الحاسوبية، بما في ذلك نماذج التعلم الآلي أو التعلم العميق، لتمكين التصنيف الطيفي والاستدلال على تركيب تسلسل الحمض النووي أو البنية الجزيئية بناء على توقيعات الفلورة الجوهرية تحت ظروف إضاءة وحالات فوتوفيزيائية مختلفة.

تم جمع جميع البيانات المعروضة في هذا البروتوكول باستخدام مخزن التصوير المعتمد على β-ميركابتوإيثانولرقم 35. من حيث المبدأ، يجب أن يكون أي مخزن تصوير يعزز سلوك تبديل الفوتوفور الفلوري متوافقا مع هذا النهج، مثل مخزن التصوير المعتمد على DABCO36. تشمل جزيئات الحمض النووي المختبرة جزيئات أحادية السلسلة ذات 20 قاعدة A، G، C، T؛ سلسلة تيار متردد أحادية السلسلة ذات 40 قاعدة (A1C1، A5C5، A10C10، A20C20); غوانين قاعدة ذات سلسلة واحدة بخمسة و8 و12 و16 حديد؛ مقود GC مزدوج السلسلة ذو 20 قاعدة وAT (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل). يعتمد اختيار بنى الحمض النووي ذات 20 و40 قاعدة على ملاحظة أن سلسلة الحمض النووي ذات 40 قاعدة تعتمد تكوينا مدمجيا بحجم فعال أقل من 40 × 3.4 = 13.6 نانومتر، مما يضعها تحت حد الدقة لصورة SMLM المعاد بناؤها. لم تكن أطوال موجات الإثارة (488 نانومتر و532 نانومتر) محسنة بشكل فريد لتسلسلات محددة، بل تم اختيارها لإثبات أن فلورة الحمض النووي الجوهرية يمكن اكتشافها بقوة عبر تركيبات قواعد وحالات تكوين مختلفة باستخدام أي من الطولين الموجيين. اختبرنا المخزن التصويري كما هو موضح في الشكل التكميلي 1 ووجدنا أنه لم يتم اكتشاف إشارات وميض عشوائية تقريبا، مما استبعد مكونات المخزن ومعالجات سطح الزجاج. فقط هلام DNA + مخزن التصوير قدم عددا كبيرا من الوميض. كانت شرائح الزجاج وغطاء الغطاء نظيفة ومناولة بعناية، بينما تم تشكيل جل العينة في بيئة مغلقة. لذلك، من غير المرجح أن تأتي الإشارات المكتشفة من الشوائب أو التألق الذاتي للركيزة. قمنا أيضا بقياس الإشارة من هلام التجفيف ومحلول الحمض النووي معا، ووجدنا أنه لا يوجد فرق كبير، لذا فإن التشويهات الكيميائية الضوئية أثناء التجفيف ليست المصدر الرئيسي للإشارات. عادة ما تظهر منتجات التحلل الضوئي أطيافيا واسعة ولا تمتلك خصائص وميض، وهي لم تلاحظ في دراستنا من قبل. الحدود الكمية للكشف، التي تنعكس في الحد الأدنى لعدد الفوتونات في التموضع، هي 30 - 50 [عدد الفوتونات]. تبقى هذه القيمة كما هي لعينات الحمض النووي والأنظمة الموسومة، مثل H3K9me3 الموسوم ب AF647 في الخلايا الثابتة. متوسط دقة تحديد الموقع لفلورة الحمض النووي الجوهرية حوالي 15 - 25 نانومتر، بينما AF647 حوالي 10 - 15 نانومتر.

في السيناريو ثنائي الأبعاد، يكون حجم الصورة المعاد بناؤها من SMLM 22 نانومتر. دقة توطين الانبعاثات العشوائية لها متوسط ~20 نانومتر، وهو ما يصف فترة الثقة لمكان تحديد موقع الجزيء الواحد. ومع ذلك، فإن العينات التي تم اختبارها للتألق الداخلي لا تمتلك هياكل بيولوجية، لذا لا يمكن تفسير دقة الهياكل. يقال إن المجهر المتبعثر رامان المتماسك بدقة 250 - 300 نانومتر37، بينما المجهر ثنائي الفوتون للأشعة فوق البنفسجية بدقة 300 نانومتر38. نسبة الإشارة إلى الضوضاء في تصوير التشتت المتماسك في رامان تتراوح بين 10 - 10039، بينما هي 2 - 20 (غالبا ما يعبر عنها كانحراف الإشارة إلى كلا الطرفين من الانحراف المعياري، SSDR) لتصوير المجهر الفوري 2 فوتوني 40,41. معدل الإشارة إلى الضوضاء في الفلورة الجوهرية للحمض النووي باستخدام sSMLM حوالي 5 بسبب انخفاض عدد الفوتونات والقيود التي تفرضها ضوضاء الكشف بالكاميرا.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل مع المدة المقدرة. (أ) يتضمن تحضير العينة إذابة المخزون، وتحضير جل الحمض النووي، وإضافة مخزن التصوير. يتراوح الوقت الكلي من 1 إلى 3 ساعات حسب العينة والبيئة. (ب) كل اقتناء يتطلب عملية معايرة باستخدام عينة مصفوفة نانوية مصممة خصيصا. سيكون إجمالي وقت المعايرة حوالي 20 دقيقة، ووقت جمع البيانات لمكدس صور واحد حوالي 10 دقائق، بما في ذلك البحث في العينة (10,000 إطار و50 مللي ثانية وقت تعريض). (ج) يتضمن خط التحليل معالجة FIJI المبدئية والتحليل الطيفي بلغة بايثون. تستغرق المعالجة المسبقة في FIJI حوالي 10 دقائق، بينما يكون التحليل الطيفي سريعا مع الرموز المعتمدة. تم جمع الأطياف المعروضة من جوانين ذو 16 قاعدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: المخطط البصري. يتم توجيه خطوط الليزر الأربعة (405 نانومتر، 488 نانومتر، 532 نانومتر، 647 نانومتر) إلى المجهر المقلوب عبر محاذاة الليزر، مما يجعل النظام مستقرا وسهل التشغيل. يتم وضع DWP مباشرة أمام كاميرا sCMOS، مما يتيح الكشف الطيفي لجزيء واحد. عند المعايرة لنظام DWP، يتم إدخال عجلة فلتر بين الكاميرا وDWP. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: المعايرة الطيفية. أطوال موجات المعايرة المستخدمة هي 532 نانومتر، 580 نانومتر، 633 نانومتر، 680 نانومتر، و750 نانومتر. عن طريق وضع مرشحات ضيقة النطاق الترددي بالتتابع مع هذه الأطوال الموجية المركزية بعد DWP وقبل الكاميرا، يمكن قياس الانزياحات الأفقية والعمودية المقابلة للأطوال الموجية المختلفة، مما يسمح برسم منحنى معايرة بين موقع البكسل والطول الموجي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: أطياف جزيئات DNA مزدوجة السلسلة وأحادية السلسلة مختارة تحت إثارة 532 نانومتر و488 نانومتر على التوالي. (A - B) الأطياف غير الخطية والخطية ل GC_alter، والتي تشير إلى نوع من جزيئات الحمض النووي ثنائية الخيوط، مع كلا الخيطين كجزيئات قاعدة 20 5'-GCGGCGCGCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-3'. يظهر الطيف الأخضر المميز المنحنى المتوسط. (C - D) الأطياف غير الخطية والخطية ل A10C10، والتي تشير إلى نوع من جزيئات الحمض النووي أحادي السلسلة، بطول 40 قاعدة و10 أدينين و10 سيتوزين متكرر (5'- AAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3'- AAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCC-3'- AAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCC-3'). يظهر الطيف الأزرق المميز المنحنى المتوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: تجارب التحكم في التألق الداخلي للحمض النووي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم لأول مرة بروتوكولا لالتقاط الطيف الكامل للفلورية الجوهرية للحمض النووي من جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة وثنائية السلسلة، يغطي سير العمل من تحضير العينة إلى جمع البيانات والتحليل الحاسوبي. يتيح هذا البروتوكول التصوير فائق الدقة بدون علامات لجزيئات الحمض النووي من خلال الاستفادة من التألق الداخلي بدلا من المجسات الخارجية. من حيث المبدأ، يمكن توسيع هذا النهج ليشمل الخلايا الثابتة وربما ليشمل تصوير الخلايا الحية، لأنه يتجنب الوسم الكيميائي والتضخيم القائم على الأجسام المضادة. الكروماتين داخل النواة يتضمن الحمض النووي النووي، والحمض النووي الريبي، وأنواع مختلفة من البروتينات، وهو نظام أكثر تعقيدا بكثير من هلام الحمض النووي. حاليا، بسبب انخفاض عدد الفوتونات من جزيئات الحمض النووي، فإن الانبعاثات العشوائية من داخل النواة في الخلايا الثابتة/الحية تشكل تحديا. لكن بالنسبة للكروموسومات المعزولة، أو النواة، تم الإبلاغ عن إشارة التألق الداخلي للحمض النووي 16,24,27. ومع ذلك، في شكله الحالي، يقتصر البروتوكول على البيئات المختبرية باستخدام عينات DNA مصطنعة. بالمقارنة، يتطلب وضع علامات على الحمض النووي النووي أو الكروماتين باستخدام التلوين المناعي عادة إجراءات متعددة الخطوات طويلة — بما في ذلك التبريد، والحجز، وحضانة الأجسام المضادة الأولية والثانوية — والتي قد تستغرق عدة ساعات (غالبا ~5 ساعات لكل هدف)12,42، مما يدخل تعقيد تجريبي واضطرابات محتملة في بنية الكروماتين الأصلية. من خلال إزالة العلامات الخارجية، لا يقلل التصوير القائم على التألق الداخلي وقت تحضير العينة بشكل كبير فحسب، بل يتجنب أيضا الاضطرابات الهيكلية وأخطاء الربط المرتبطة بالمجسات الفلورية الضخمة والأجسام المضادة، مما يمكن من تحديد مواقع الحمض النووي على نطاق نانوي أكثر دقة.

على الرغم من طبيعته الخالية من التسميات وبساطة مفاهيمها، يتطلب تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح اهتماما دقيقا لعدة تفاصيل تجريبية حاسمة. على سبيل المثال، أثناء تحضير العينة، يؤدي الوقت غير الكافي لتكوين هلام الحمض النووي إلى تقليل عدد المواقع الموضعية الجزيئية الفردية القابلة للكشف مقارنة بالجل المكتمل. عادة ما يستغرق تكوين الجل حوالي ساعة ونصف. إذا لم يكن المحلول قد جف تماما، فقط انتظر قليلا بعد. بالنسبة لغطاء 22 × 22 مم، يكفي 5 ميكرولتر من المخزن التصويري، بينما حجم أكبر من المخزن يمكن أن يسبب تسربا، مما قد يعطل واجهة الغمر بالزيت للجسم ويؤثر سلبا على أداء التصوير. إذا حدث تسرب، يمكن إزالته بعناية باستخدام مناديل مختبرية. أثناء التركيز، ارفع الهدف تدريجيا من أدنى موضع z. بعد أن ينشط الهدف زيت الغمر، استخدم وضع الضبط الدقيق لتحديد المستوى البؤري الذي يحدث انبعاث جزيء واحد عشوائي متكرر. إذا كانت تجمعات الجل الكبيرة تنتج إشارات مجمعة مع أطياف من الدرجة الأولى متداخلة، اختر منطقة تصوير بديلة.

على الرغم من مزاياه، فإن هذا البروتوكول لديه عدة قيود مهمة يجب أخذها في الاعتبار عند تقييم قابليته للتطبيق والأداء. أولا، يعتمد الاستخلاص الطيفي الدقيق على الفصل المكاني الكافي بين أحداث جزيء واحد منفردة؛ الكثافات العالية في التمركز، مثل تلك الناتجة عن تجمعات هلام الحمض النووي الكبيرة أو التجمعات الجزيئية الكبيرة المكتظة بكثافة يمكن أن تؤدي إلى تداخل آثار طيفية من الدرجة الأولى تعقد أو تمنع إعادة بناء الطيف الموثوقة. ثانيا، الطريقة حساسة للمحاذاة البصرية وثبات التركيز، حيث يمكن أن تؤدي الاختلالات الصغيرة في منشور الإسفين المزدوج أو الانحرافات عن المستوى البؤري الأمثل إلى حدوث أخطاء منهجية في معايرة الطول الموجي وتقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ثالثا، لا يطبق البروتوكول حاليا إزالة الخلط الطيفي، مما يحد من استخدامه في العينات ذات الكثافة الجزيئية العالية أو الأنواع المتداخلة طيفا متعددة. تحدد هذه العوامل بشكل جماعي نظام التشغيل العملي للطريقة ويجب أخذها في الاعتبار بعناية عند توسيع البروتوكول ليشمل أنظمة بيولوجية أكثر تعقيدا أو ازدحاما.

في هذا البروتوكول، يستخدم RainbowSTORM فقط للمعايرة الطيفية، رغم أن البرنامج يوفر أيضا أدوات قوية للمعايرة ثنائية وثلاثية الأبعاد، وتحليل بيانات sSMLM، وإعادة بناء الصور. تعد هذه الأدوات التحليلية مناسبة جدا لربط معلومات تحديد الموقع المكاني مع القراءات الطيفية في التصوير الطيفي فائق الدقة، ويمكن الاستفادة منها في امتدادات مستقبلية لهذا البروتوكول. وأخيرا، يمكن أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتنفيذ لأنواع أخرى من الجزيئات الكبيرة البيولوجية43، 44، 45، مثل RNA، التوبولين، وغيرها. يمكن تغذية الطيف المكتشف إلى نماذج حسابية، مثل نماذج التعلم العميق46، لإجراء التصنيف، وبالتالي التنبؤ بالتسلسل أو البنية الجزيئية من الأطياف الجوهرية تحت إضاءة مختلفة بالإضافة إلى خصائص فوتوفيزيائية مختلفة. كما تمهد هذه الدراسة الطريق لتصوير الكروماتين الجزيئي الخالي من العلامات والخاص بالجزيئات، مما يتجنب الوسم الخارجي أو إزالة الطبيعة للهياكل الأصلية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا البحث بمنح R02CA225002 و U54CA261694 و R01CA289294 و U54CA268084 من المعاهد الوطنية للصحة ومنحة CBET-2430743 من المؤسسة الوطنية للعلوم. نشكر مختبر البروفيسور هاو ف. تشانغ في جامعة نورث وسترن على جهاز المنشور ذو الإسفين المزدوج كجزء أساسي من نظام SMLM الطيفي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فلتر انبعاث 488 نانومتر للتصويرشركة كروما تكنولوجي كورب.ET525/50M
فلتر تمرير النطاق 532 نانومتر للمعايرةثورلابزFL532-3
مرشح انبعاث 532 نانومتر للتصويرشركة كروما تكنولوجي كورب.ET620/60M
فلتر تمرير النطاق 580 نانومتر للمعايرةثورلابزFB580-10
فلتر تمرير النطاق 633 نانومتر للمعايرةثورلابزFL632.8-3
فلتر تمرير النطاق 680 نانومتر للمعايرةثورلابزFB680-10
فلتر تمرير النطاق 750 نانومتر للمعايرةثورلابزFB750-10
بيتا-ميركابتوإيثانول سيغماM6250
مخزن تصوير الطب الحيويNANA7 & mu; إل غلوكس، 7 ومو؛ L بيتا-ميركابتوإيثانول و 690 & mu; مخزن جلوكوز L
كاتالاز من كبد البقرسيغماC100
DABCO (1,4-di-azobicyclo- (2.2.2.)-أوكتان)سيغماD27802
مخزن تصوير DABCONANA65 ملليموتر DABCO+30 ملموتر كبريتات الصوديوم + 30 ملمولار DTT 1 ميلي & nbsp; في الحمض النووي DNAse، المياه منزوعة الأيونات خالية من الحمض النووي الريني. يجب إذابة كبريتات الصوديوم في PBS 10&؛ إلى 1 M قبل إنشاء المخزن التصويري.
استبعاد الحمض النووي للتحليل الطيفي SMLMIDTNAزوج من 20 قاعدة GC_alter و GC_conti و AT_alter و AT_conti.
مثلا GC_alter له كلا الخيطين بطول 5' - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3'; GC_conti لديه خيط واحد بحجم 5 أقدام - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' والآخر ب 5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
جميع العينات موجودة بمعيار HPLC.
أوليغونيوكليوتيدات الحمض النووي (DNA أوليجونكليوتيدات/الحمض النووي مزدوج السلسلةIDTNA
قبطات الحمض النووي للتحليل الطيفي SMLMIDTNA20 قاعدة A، G، C، T؛ سلسلة تيار متردد أحادية السلسلة ذات 40 قاعدة (A1C1، A5C5، A10C10، A20C20)؛   الجوانين أحادي السلسلة 5، 8، 12، 16 قاعدة.
مثلا A10C10 هو
5'- AAAAAAAAACCCC
CCCCCAAAAAAAAA
AACCCCCCCCCC - 3'
جميع العينات في معيار HPLC.
الماء المقطر الخالي من DNase/RNaseإنفيتروجين10977015
DTT (DL-Dithiothreitol)سيغما43816
غلوكسNANA14 ملغ جلوكوز أوكسيداز، 50 & mu; L كاتالازي (17 ملغ/مل) + 200 & mu; مخزن L A، وهو 10 مللي مولار تريس (pH 8.0) و50 مللي مولار NaCl. ؛
مخزن الجلوكوزNANA50 مللي مولار تريس (رقم الهيدروجيني 8.0)، 50 ملليمولار NaCl و10٪ جلوكوز.
داز الجلوكوز أوكسيدازسيغماG7141
الجلوكوز، المسحوقثيرمو فيشر15023021
PBS (10X)ثيرمو فيشرJ62036. K3
PBS (1X)جيبكو10010023
كلوريد الصوديومثيرمو فيشر424290010
كبريتات الصوديوم سيغماS0505
تريس (1M) pH 8.0إنفيتروجينAM9856

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. J., Minton, A. P. Join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  2. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780(1994).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  5. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  6. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. Appl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  7. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  8. Ricci, M., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  9. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), eaau1783(2018).
  10. Matsuda, A., et al. Condensed mitotic chromosome structure at nanometer resolution using PALM and EGFP-histones. PLoS One. 5 (9), e12768(2010).
  11. Bohn, M., et al. Localization microscopy reveals expression-dependent parameters of chromatin nanostructure. Biophys J. 99 (5), 1358-1367 (2010).
  12. Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light Sci Appl. 14, 7(2025).
  13. Almassalha, L. M., et al. Label-free imaging of the native, living cellular nanoarchitecture using partial-wave spectroscopic microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (42), E6372-E6381 (2016).
  14. Beerman, T. A., et al. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst 33258 on topoisomerase II and I mediated activities. Biochim Biophys Acta. 1131 (1), 53-61 (1992).
  15. Cadet, J., Anselmino, C., Douki, T., Voituriez, L. New trends in photobiology. J Photochem Photobiol B. 15 (4), 277-298 (1992).
  16. Dong, B., et al. Superresolution intrinsic fluorescence imaging of chromatin utilizing native, unmodified nucleic acids for contrast. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (35), 9716-9721 (2016).
  17. Vayá, I., Gustavsson, T., Miannay, F., Douki, T., Markovitsi, D. Fluorescence of natural DNA: from the femtosecond to the nanosecond time scales. J Am Chem Soc. 132 (34), 11834-11835 (2010).
  18. Anders, A. DNA fluorescence at room temperature excited by means of a dye laser. Chem Phys Lett. 81 (2), 270-272 (1981).
  19. Plessow, R., Brockhinke, A., Eimer, W., Kohse-Höinghaus, K. Intrinsic time- and wavelength-resolved fluorescence of oligonucleotides: a systematic investigation using a novel picosecond laser approach. J Phys Chem B. 104 (15), 3695-3704 (2000).
  20. Takaya, T., et al. UV excitation of single DNA and RNA strands produces high yields of exciplex states between two stacked bases. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10285-10290 (2008).
  21. Bancaud, A., et al. A fractal model for nuclear organization: current evidence and biological implications. Nucleic Acids Res. 40 (18), 8783-8792 (2012).
  22. Daban, J. R. High concentration of DNA in condensed chromatin. Biochem Cell Biol. 81 (3), 91-99 (2003).
  23. Bohrmann, B., et al. Concentration evaluation of chromatin in unstained resin-embedded sections by means of low-dose ratio-contrast imaging in STEM. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 235-251 (1993).
  24. Dong, B., et al. Stochastic fluorescence switching of nucleic acids under visible light illumination. Opt Express. 25 (7), 7929-7944 (2017).
  25. Gong, R., et al. DNA spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy. Proc SPIE. 13326, 133260F(2025).
  26. Wang, G., et al. Label-free DNA spectroscopic photon-localization nanoscopy. Optica Biophotonic Congress. , (2025).
  27. Eshein, A., et al. Sub-10-nm imaging of nucleic acids using spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy (SICLON). Opt Lett. 43 (23), 5817-5820 (2018).
  28. Song, K. H., et al. Monolithic dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. Nanophotonics. 11 (8), 1527-1535 (2022).
  29. Song, K. H., Sun, C., Zhang, H. F. Design strategy for a dual-wedge prism imaging spectrometer in spectroscopic nanoscopy. Rev Sci Instrum. 94 (2), 023702(2023).
  30. Yeo, W. H., Sun, C., Zhang, H. F. Physically informed Monte Carlo simulation of dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. J Biomed Opt. 29 (S1), S11501(2023).
  31. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM: an open-source ImageJ plug-in for spectroscopic single-molecule localization microscopy (sSMLM) data analysis and image reconstruction. Bioinformatics. 36 (19), 4972-4974 (2020).
  32. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM v2 (MATLAB app). , https://github.com/FOIL-NU/sSMLM-protocol (2020).
  33. Brenner, B., et al. Implementation and calibration of spectroscopic single-molecule localization microscopy. BMC Methods. 2 (1), 2(2025).
  34. sSMLM for DNA intrinsic fluorescence (Python scripts). , Backman Lab. https://github.com/BackmanLab/sSMLM-for-DNA-intrinsic-fluorescence (2025).
  35. N-STORM protocol. , Molecular Vista. Available from: https://www.mvi-inc.com/wp-content/uploads/N-STORM+Protocol.pdf (2014).
  36. Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  37. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys Rev Lett. 82 (20), 4142(1999).
  38. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two‐photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 59 (1), 4-11 (2013).
  39. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Ann Rev Biomed Eng. 17 (1), 415-445 (2015).
  40. Song, J., et al. SNR enhanced high-speed two-photon microscopy using a pulse picker and time gating detection. Sci Rep. 13 (1), 14244(2023).
  41. Luu, P., Fraser, S. E., Schneider, F. More than double the fun with two-photon excitation microscopy. Comm Biol. 7 (1), 364(2024).
  42. Van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  43. Wang, D., et al. Research progress on the luminescence of biomacromolecules. J Mater Sci Technol. 76, 60-75 (2021).
  44. Varejão, N., Reverter, D. Using intrinsic fluorescence to measure protein stability upon thermal and chemical denaturation. Methods Mol Biol. 2581, 229-241 (2023).
  45. Sindrewicz, P., et al. Intrinsic tryptophan fluorescence spectroscopy reliably determines galectin-ligand interactions. Sci Rep. 9 (1), 11851(2019).
  46. Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nat Commun. 10 (1), 4927(2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ThunderSTORM RainbowSTORM

مقالات ذات صلة