بروتوكول ختم جديد لإنتاج أختام محكمة الإغلاق قائمة على السيليكون لأغشية أجهزة رقائق بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS). مخصصة للمختبرات لإعداد نماذج الشرائح وتطوير منصات الشرائح على نطاق صغير. نعرض البروتوكول باستخدام أغشية بلاستيكية وأنسجة طبيعية. يتطلب هذا الإجراء فقط PDMS، والتولوين، والعفن، والغشاء، وغرفة تفريغ.
مقالة منهجية
إجراء إغلاق السيليكون من شريحة إلى غشاء متاح لربط مرن وموثوق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد منصات الأعضاء على الشريحة جانبا سريع النمو في البحث الطبي الحيوي. أدى توسع هذا المجال إلى إنتاج مجموعة من المواد والمنهجيات المختلفة لبنائها وتطبيقها. بينما يستمر عدد الأجهزة المختلفة - سواء المقدمة تجاريا أو المطورة في الأوساط الأكاديمية - في الازدياد، يبقى عادة ما يبقى خطوة كبيرة يجب اتخاذها للباحثين الجدد الذين يدخلون مجال الأورغن على الشريحة. واحدة من القضايا المركزية في تقنيات الشرائح الجديدة والمستمرة لا تزال تنتج نظام إغلاق آمن وخال من التسربات لأجهزة الرقائق. في هذا المقال، نقدم مسارا جديدا لتطوير الرقائق من خلال تقديم سير عمل لختم الرقائق ينتج اتصالات محكمة الإغلاق الموثوقة بين رقائق السيليكون وثلاثة أغشية زراعة من مواد مختلفة. الإجراء المعروض متاح لتطوير الشرائح الجديدة مع مواد إدخال محدودة ويوفر واجهة هواء-سائل (ALI) عضو على شريحة. هذه الشرائح مخصصة لزراعة الخلايا التي تغذى عبر غشاء مسامي وتتعرض للهواء من الطرف، مثل الأمعاء أو الجلد أو، كما هو موضح هنا، مجرى الهواء على الشريحة. نقدم تصميمين ثلاثي الأبعاد لقوالب الرقائق المختلفة، يظهران ارتباطهما بأغشية بلاستيكية متوفرة تجاريا بالإضافة إلى سقالات مصفوفة خارج الخلية (ECM) الخنازيرية. يمكن إنتاج هذا المسار الهوائي على الشريحة داخليا؛ يتم عرض العقبات المختلفة التي قد تواجهها هنا، وعرض لاستخدامها السابق كممر هوائي على شريحة (Airway-on-Chip). تتضمن هذه العملية الجديدة للإغلاق تنظيف ملاط بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) المخفف بالتولوين لإزالة التولوين، مما يؤدي إلى طبقة سيليكون رقيقة وقوية مدمجة في سطح البلاستيك المسامي أو غشاء ECM الأصلي. الميزة الثانية في هذا الإجراء هي معالجة ملاط PDMS بدرجة حرارة الغرفة لمنع اضطراب الأغشية بسبب اختلاف التمدد الحراري في المواد التي يتم تثبيتها معا. يؤدي ذلك إلى تقنية واسعة التطبيق لربط المواد المختبرة، مما ينتج شرائح PDMS متعددة الحجرات مع أغشية زراعة داخلية.
المقدمة
الأجهزة التي تعتمد على العضو على الشريحة أصبحت حجر الزاوية في البحث الطبي الحيوي، مع تطوير مجموعة واسعة من النماذج التجارية ومفتوحة الوصول في مختبرات حول العالم1. ومع تحول هذه النماذج إلى جزء أساسي من البحث، واستمرارها في استبدال النماذج البلاستيكية الثابتة والحيوانيةالتقليدية 2,3، أصبح من المهم بشكل متزايد أن تكون هذه النماذج متاحة بسهولة ومتاحة للباحثين من خلفيات مختلفة حول العالم. جوهر ذلك هو سهولة تحقيق تطوير مخصص وصغير الدفعات، بغض النظر عن تكاليف المدخلات والتصنيع4، خاصة في النماذج غير التجارية أو الأكاديمية1.
واحدة من أكبر التحديات في تقنيات On-Chip هي إنتاج إغلاق آمن للرقائق دون تسرب أثناء التدفق. أظهرت مراجعة حديثة لاختبار التسرب في أجهزة الشريحة أن التسرب بين الغرف أو إلى البيئة هو الوضع الأعلى لفشل النماذج والتجريب، سواء في الصناعة أو الأكاديميا 5,6. هناك عدة أسباب لفشل تحقيق ختم ناجح: صغر حجم الأجهزة، التدفق والضغط المطبق، وأهم حقيقة أن هذه الأجهزة تتكون من مواد مختلفة مختومة معا في طبقات ومرتبطة بعمليات مختلفة6. نطاق المواد المختلفة المستخدمة كأغشية زراعة في منصات الرقائق يمتد إلى نطاق تطبيقاتها، بما في ذلك البولي إيثيلين تيريفثالات (PET)، البولي كربونات (PC)، PDMS، وأغشية ECM1. ونتيجة لذلك، هناك العديد من الإجراءات والعلاجات المختلفة لتوصيل هذه المواد المختلفة في الأجهزة النهائية. تشمل هذه الإجراءات الضغط بالغراء/PDMS، كيمياء السيلان التي تتوسطها البلازما، الوظيفة الكيميائية للهياكل، الدوران الكهربائي، وربط المذيب المبخر، وذلك حسب المواد المستخدمة في النموذج7. حقيقة أن هذه العمليات تتطلب مهارات وبيئات مختبرية مختلفة تفرض بعض القيود على سهولة الوصول الأكاديمي للأبحاث المدرجة على الشريحة. وقد تم تحديد أنه بينما تحد التكاليف والقيود المرتبطة بالمشاركة في الأنظمة التجارية من الوصول الأكاديمي، فإن العمليات الطويلة والمتعددة المراحل لبناء الشرائح والمعدات المطلوبة تحد من تطورها الأكاديمي المستقل 1,8,9. في طليعة هذا البحث، أحد القضايا الحالية هو توحيد والتحقق من صحة النماذج لقابليتها للتكرار10,11. لكن لا يزال هناك فجوة في الوصول إلى هذه المرحلة للعديد من المختبرات التي تحاول البدء في تطوير الرقائق للإجابة على أسئلة بحثية محددة، واستبدال العمل الحيواني، والعمل في نماذج أكثر ارتباطا بيولوجيا12.
في هذا المقال، نقدم سير عمل لإغلاق الشرائح يتطلب فقط المهارات والمعدات المتاحة لمعظم بيئات البحث. ينتج هذا الإجراء واجهات غشاء رقاقة PDMS محكمة ضد الماء لثلاث مواد غشائية مختلفة. تتطلب العملية وقت عمل نشط محدود فقط، ويمكن استخدامها في بيئات مختبرات غير مبنية على رقائق، ويمكن توسيعها من إنتاج شرائح دفعة صغيرة إلى متوسطة.
يمكن إجراء إجراء الإغلاق المعروض باستخدام أغشية بلاستيكية مسامية أو أغشية ECM؛ الشرائح النموذجية المقدمة مبنية مع هذا الإجراء لتطبيقه كجهاز مجرى هوائي على شريحة مع تعرض للهواء. يمكن استخدام هذا الإجراء لأجهزة مماثلة أخرى، بشرط أن تحتوي الأغشية على مسام، وهي ضرورية لهذا العملية. التطبيق الأساسي للشرائح المقدمة هو لزراعة ALI وخلايا الظهارة في مجرى التنفس، ولكن يمكن استخدامها في تطبيقات أخرى ونماذج الزراعة المشتركة مع خلايا الميزنكيمي أو خلايا الأمعاء، مثل 8,13. الشريحة الأولى المقدمة هي مجرى هوائي قياسي على شريحة مع منطقة زراعة واسعة النطاق (92 مم2) مع غرفتي زراعة، بما في ذلك حجرة قمية للتعرض للهواء، مفصولة بغشاء مسامي عن الحجرة القاعدية تحتوي على وسط واختياري نوع آخر من الخلايا المزروعة تحت الماء (مثل الخلايا الليفية، الخلايا البطانية). في تطبيقات ALI، من الضروري أن تكون الخلايا المتلقية في القمة قادرة على الحفاظ على حاجز ضيق لمنع تسرب الوسائط إلى القناة العلوية. الشريحة الثانية لها نفس تصميم الأولى، مع غرفتين إضافيتين على جانبي الغشاء، هنا باستخدام ECM الخنزيري، لتسهيل شد غشاء الزراعة من خلال تطبيق ضغط سلبي، مما يحاكي تمدد مجرى الهواء الأصلي.
عملية الختم لدينا تجمع بين عدة عناصر من مجال تطوير شرائح PDMS مع إضافة شروط جديدة، وهي ذات شقين. أولا، التطبيق السريع للفراغ على ملاط PDMS المخفف بالتولوين، الذي يمنع الهجوم الكيميائي للتولوين على الأغشية، ويعزز تسرب السيليكون إلى المسام أو الخصائص السطحية للغشاء، ويؤدي إلى سطح رقيق مقاوم للإزاحة. يسبب التولوين تورما وتشوها على أسطح PDMS الصلبة، لكنه يعمل كمذيب عند تركيزات عالية، ومن هنا يستخدم لتخفيف PDMS السائل في هذه العملية. بالنسبة للبلاستيك مثل أغشية PC وPET المستخدمة هنا، يسبب التولوين تشوها وتشققات إجهاد إذا لم يتم إزالتها بسرعة. من الضروري توخي الحذر عند تطبيق الملاط يدويا لتطبيقه فقط على جدار نصف الشريحة المبني مسبقا وعدم دخول أي منها داخل منطقة الزراعة، لأن ذلك سيسد أغشية الزراعة وينتج مناطق من PDMS تسبب اضطرابا وتنوعا في قدرة زراعة الخلية. ثانيا، يمنع تصلب ملاط PDMS عند درجة حرارة الغرفة (RT) لأكثر من 72 ساعة من إزاحة الغشاء من نصف الشريحة وكذلك من الملاط، وهو ما قد يحدث مع انكماش المواد إلى درجات مختلفة بعد التمدد الحراري.
نقدم تصميمين لقالب الرقائق يمكن صنعهما باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد أو مطحنة دقيقة (كما هو موضح في الملف التكميلي 1، الملف التكميلي 2)، بالإضافة إلى طريقة صنع ملاط رقيق من PDMS والتولوين14. يتيح استخدام هذه الطريقة إغلاق الأغشية البلاستيكية التجارية (PET، PC) داخل الجهاز. بالإضافة إلى ذلك، اختبرنا مدى تطبيق هذه العملية من خلال إنشاء نفس الشريحة مع غشاء ECM أصلي من الخنازير لإنتاج شريحة بيولوجية ذات قدرة على التمدد الدوري. نظرا لأن العضو-على الشرائح تهدف إلى تكرار الخصائص الفسيولوجية للبيئة الحية ، فإن الممرات الهوائية على الشرائح التي لديها القدرة على إنتاج القوى الميكانيكية التي يشعر بها الجسم أثناء التنفس، مثل إجهادات القص الناتجة عن الهواء الجاري والمشهد الميكانيكي للمجاري الهوائية الضيقة، ذات صلة بيولوجية عالية16. يتكون الغشاء المستخدم من الغشاء القاعدي، الصفيحة الجوية، بالإضافة إلى الكولاجين واللامينين وبروتينات المصفوفة المحيطة الأخرى. حسب علمنا، هذه هي أول شريحة أصلية تعتمد على الغشاء القاعدي، والأولى التي يمكن أن تكون قابلة للتمدد، مما يسهل تقليد الإجهاد الميكانيكي مثلا للتنفس على غشاء ECM غير السيليكون15. يبرز هذا التطبيق الجديد وظيفة عملية الإغلاق لدينا باستخدام البلاستيك وECM. وأخيرا، نقدم تطبيق هذه العملية لإغلاق الرقائق والغشاء كطريقة لاستخدام مجرى الهواء على الشريحة يمكن استخدامها لزراعة خلايا ALI8.
البروتوكول
تم إعفاء هذه الدراسة من موافقة مجلس الأخلاقيات بموجب قانون التجارب على الحيوانات لأن المواد تم الحصول عليها بعد الوفاة ولم تضحى بأي حيوانات لأغراض علمية (Wet op de dierproeven). كان بروتوكول عزل خلايا مجرى الهواء الظهاري الأولية وفقا لكود البحث في مركز الطب الجامعي في خرونينغن (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg تم الوصول إليه في 14 يناير 2025) والإرشادات الوطنية والأخلاقية المهنية حول استخدام مواد جسم الإنسان (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf تم الوصول إليه في 14 يناير 2025). تم إعفاء هذه الدراسة من متطلبات موافقة مجلس الأخلاقيات لأن نسيج القصبة الهوائية كان متبقيا من عمليات الزرع وتم إخفاء هويته بالكامل وفقا للقانون المدني الهولندي وقانون المتبرع (Wet op de orgaandonatie).
1. تحضير نصف الشريحة والغشاء
- إنتاج الرقائق
- تحميل . ملفات تصميم STL للنصفين العلوي والسفلي من الشريحة من الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 من هذه الورقة. ينتج القالب العلوي نصف شريحة بعمق 5 مم، أما القالب السفلي فهو نصف شريحة بعمق 3 مم؛ كلا نصفي الشريحة يحتويان على غرف زراعة بعمق 1 مم. بدلا من ذلك، يمكنك إنتاج تصميم شريحة باستخدام برنامج CAD مناسب.
- جهز إما ملف شرائح للطباعة ثلاثية الأبعاد أو مسار مطحنة لطحن قوالب الرقائق بتقنية الميكرو. القوالب الدقيقة ستكون جاهزة للاستخدام؛ القوالب المطبوعة بالراتنج تتطلب غسلتين على مدار 24 ساعة بنسبة 99.9٪ من الإيثانول قبل الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية لتحضيرها بشكل مناسب للاستخدام كقالب PDMS.
- إنتاج نصف شرائح PDMS (الشكل 1)
- امزج قاعدة PDMS السائل مع عامل المعالجة بنسبة 10:1 وإزالة الغاز في غرفة تفريغ حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء.
- املأ القوالب بحقنة فوهة عريضة، ثم قم بإزالة الغاز لمدة ~10 دقائق في غرفة تفريغ حتى تتم إزالة جميع الفقاعات. ضع القوالب في فرن جاف حتى تجف لمدة ساعتين عند درجة حرارة 65 درجة مئوية.
- قم بإزالة الشرائح الصلبة من القوالب باستخدام مشرط واقطع الفلاشينغ من الحواف. أضف أربعة مداخل إلى النصف العلوي في كل طرف من الحجرة والحلقتين المجاورتين اللتين تظهران موقع مداخل الحجرة السفلية باستخدام ثقب الخزعة.
ملاحظة: للنتائج المقدمة، تم استخدام ثقب خزعة بقطر 2 مم، وتم إدخال أنبوب سيليكون بقطر 2 مم لتدفق الوسط والهواء أثناء الزراعة. تسهل مداخل 1 مم و2 مم بذر الخلايا باستخدام ماصة، والتي تتوافق مع حجم 200 و1000 ميكرومتر على التوالي. يمكن استخدام أحجام ثقوب أخرى لأنظمة أنابيب أو مضخات مختلفة.
- تحضير الغشاء (الشكل 2)
- تحميل . ملفات تصميم STL لقالب الغشاء من الملف التكميلي 3 في هذه الورقة. جهز القلب عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد أو طريقة تصنيع مكافئة لضمان شكل غشاء متسق.
- ضع القلب فوق غشاء PET أو PC، مع تثبيته بإحكام أثناء قطع الغشاء إلى شكل باستخدام المشرط.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تغطية الأغشية ببروتينات مصفوفة لزراعة الخلايا في طبق بتري دون التأثير على ارتباط الغشاء. هذا يضمن أن الغشاء فقط هو الذي يعمل لنمو الخلايا، مما يترك جدران PDMS خالية من الخلايا كما هو موضح سابقا.8.
2. الروابط الغشائية
- تحضير هاون PDMS
- اخلط PDMS السائل (الخطوة 1.2.1) مع التولوين بنسبة 7:5 وامزج جيدا عن طريق الحقن صعودا وهبوطا باستخدام حقنة ذات فوهة عريضة كما هو موضح سابقا14. يكفي 8 قطرات لكل شريحة؛ يوصى ب 1.4 مل PDMS مع 1 مل تولوين لكل دفعة من الهاون ويكفي ل8 شرائح بهذا الحجم. الخلط المتسق بالملاطات مهم لربط الأغشية بشكل موثوق.
تحذير: تولوين متقلب وقابل للاشتعال بشدة. التعرض للمواد يمكن أن يسبب ضررا للجهازين العصبي والجهاز التنفسي. استخدم فقط في غطاء بخار، بعيدا عن أي مصدر إشعال، وتعامل مع التسرب باستخدام مواد ماصة وتهوية. أثناء التعامل، ارتد نظارات واقية للحماية من الرش وقفازات غير منفذة (نيتريل). اترك جميع مواد المختبر (رؤوس الماصات، الحاويات، إلخ) على مدار 24 ساعة في غطاء البخار، وبعدها يتبخر التولوين، ويمكن التخلص من جميع المواد في حاويات معتمدة ومعلمة من خلال خدمات النفايات المتخصصة. لا تتخلص من التولوين في الحوض. راجع ورقة بيانات السلامة (SDS) لمزيد من المعلومات.
ملاحظة: جهز الملاط عند نقطة الاستخدام لمنع تبخر التولوين المبكر وتلوث البلاستيك، في حاوية غير زجاجية، ويفضل أن تكون قابلة للتخلص منها، وتخلص منها مباشرة بعد الاستخدام. سيقوم PDMS بمعالجة سطح الزجاج ويكون جزئيا غير قابل للإزالة؛ التولوين يذيب ويتلف معظم البلاستيك المستخدم عادة في المختبر.
- اخلط PDMS السائل (الخطوة 1.2.1) مع التولوين بنسبة 7:5 وامزج جيدا عن طريق الحقن صعودا وهبوطا باستخدام حقنة ذات فوهة عريضة كما هو موضح سابقا14. يكفي 8 قطرات لكل شريحة؛ يوصى ب 1.4 مل PDMS مع 1 مل تولوين لكل دفعة من الهاون ويكفي ل8 شرائح بهذا الحجم. الخلط المتسق بالملاطات مهم لربط الأغشية بشكل موثوق.
- ملحق غشاء PET/PC (الشكل 2)
- قم بتطبيق الملاط بسرعة على سطح نصف شريحة PDMS حيث سيتم وضع الغشاء بطرف ماصة.
ملاحظة: يجب أن تكون المنطقة تحت الغشاء بأكملها مبللة بالملاط. يجب تطبيق تثبيت قوي مع الطرف لإنتاج أرق طبقة ممكنة. تشير المجهر إلى أن الطبقات تتراوح بين 3 و5 ميكرومتر. - أمسك الغشاء المحضر (الخطوة 1.3) في أحد الأطراف بملقط نظيف، وضع الطرف على الملاط المبلل في الموضع الصحيح للشريحة، ودع الغشاء يسقط في مكانه.
ملاحظة: لا تسمح للغشاء بالتحرك بعد هذه النقطة؛ دخول PDMS الرطب إلى الحجرة سينتج جدرانه غير منتظمة وغير صالحة للاستخدام على الغشاء. إذا حدث تحريك، يغطي السيليكون منطقة الزراعة، مما يؤدي إلى تعطيل جهد زراعة الخلايا على جانبي الغشاء، ثم يتخلص من الغشاء، ويكرر الخطوة السابقة. - ثبت الغشاء بلطف باستخدام الملقط وأعد تطبيق ملاط PDMS فوق قمة الغشاء، مع التحرك بلطف بعيدا عن الحجرة مع كل ضربة لإزالة الفقاعات وتثبيت الغشاء دون تحريكه من وضعه الأصلي.
ملاحظة: احرص على عدم تطبيق PDMS في منطقة الزراعة الداخلية للغشاء؛ وهذا أمر ضروري لأن السيليكون يمنع التصاق الخلايا ويعطل السطح الطبيعي لغشاء الزرعة. - ضع نصفين الرقائق مع الأغشية مباشرة بعد تثبيت الملاط الرطب في غرفة تفريغ ومعالجتها في درجة حرارة الغرفة تحت فراغ 25 مللي بار لمدة 72 ساعة.
ملاحظة: يجب معالجة أنصاف الرقائق مع الأغشية المتصلة بدرجة حرارة الغرفة. تتعرض PET/PC وPDMS لدرجات مختلفة من التمدد الحراري، والمعالجة بالحرارة تسبب تمدد السيليكون ثم انكماش أثناء التبريد، مما ينتج غشاءا منتفخا (الشكل 3).
- قم بتطبيق الملاط بسرعة على سطح نصف شريحة PDMS حيث سيتم وضع الغشاء بطرف ماصة.
- البناء الكامل للرقائق
- يمكن الآن ربط أنصاف الشريحة المغلقة بالغشاء بالنصف الثاني من الشريحة. للحصول على نتائج أكثر ثباتا، عرض كلا النصفين لمعالجة بلازما O2 (320 mBar، 30 ثانية) واضغط عليهما بسرعة تحت ضغط خفيف يدويا.
تحذير: تنتج أفران بلازما الأكسجين بيئات مشبعة بالأكسجين، وأكاسيد خطيرة مثل الأوزون، وإشعاع فوق بنفسجي شديد. يجب تركيب الأفران في منطقة جيدة التهوية أو في غطاء أبخرة. يجب أن تحجب نافذة الفرن كل الأشعة فوق البنفسجية، لكن ينصح باستخدام نظارات واقية. يجب منع دخول المواد والمعادن القابلة للاشتعال إلى منطقة بلازما الأكسجين لمنع الاحتراق المتسارع أو إطلاق الأبخرة السامة. الرجوع إلى وثيقة SDS الخاصة ببلازما الأكسجين أمر ضروري للاستخدام مع أي مواد غير تلك المذكورة في هذا البروتوكول.
ملاحظة: إذا لم يكن فرن البلازما متوفرا، يمكن تحقيق الربط المماثل باستخدام عصا بلازما أو بتطبيق هاون PDMS على النصف الثاني ومعالجة النصفين معا في درجة حرارة الغرفة تحت ضغط خفيف لمدة 72 ساعةو13 ساعة. على الرغم من أن هذه الخيارات أقل فعالية مقارنة بفرن بلازما O2 كامل، إلا أنه يمكن استخدام هذه الخيارات عندما لا تتوفر الأفران.
- يمكن الآن ربط أنصاف الشريحة المغلقة بالغشاء بالنصف الثاني من الشريحة. للحصول على نتائج أكثر ثباتا، عرض كلا النصفين لمعالجة بلازما O2 (320 mBar، 30 ثانية) واضغط عليهما بسرعة تحت ضغط خفيف يدويا.
النتائج
اختبار سلامة ختم الغشاء
لاختبار سلامة الشريحة المختومة، يتم ملء غرفة الزراعة العلوية بنصف الماء الملون بصبغة زرقاء، والأسفل بنصف ماء نقي. تترك الرقائق طوال الليل لتقييم احتمال تسرب الصبغة الزرقاء من الحجرة العلوية حول الغشاء إلى الحجرة السفلية.
يمكن تشويهه بطول الشرائح السيليكونية المجهزة بطريقتنا إلى 35° دون الإخلال بسلامة الغشاء، ويتم تغليفه الآن وربطه بالنصف العلوي بملاط PDMS مرن على كلا الجانبين. تشوه رقائق PDMS هو جزء طبيعي من الاستخدام، على سبيل المثال، عندما تلتصق الشرائح أو الشرائح بطبق بتري.
تم توصيل الشرائح بنظام مضخة حقن ثنائي الاتجاه لاختبار أدائها بالضغط الناتج عن التدفق. يمكن تشغيل الرقائق المزودة بأغشية PET وPC دون تسرب بين الغرف أو تمزق الرقائق حتى 30 كيلو باسكال (أقصى ضغط توفره المضخات). في الدراسات السابقة، تعمل الشرائح بشكل قياسي بسرعة 150 ميكرولتر/ساعة، مما يفرض ضغطا بلغ 0.7 باسكال على غرف كل جهاز8.
تصور ارتباط الغشاء
لتصور تسرب هاون PDMS السائل إلى مسام الغشاء بحجم 0.4 ميكرومتر تحت المجهر نتيجة الختم التفريغي RT، تم صبغ هاون PDMS بلون النيل الأحمر. تم اختيار النيل الأحمر لأنه صبغة كارهة للماء وسيمتزج جيدا مع PDMS في شكله السائل. تم تحضير الصبغة عن طريق خلط 1٪ من أحمر النيل جيدا في PDMS السائل لإنتاج لون أحمر تحت المجهر الضوئي. تم تكرار إجراء المعالجة بتقنية الحقن كما هو موضح أعلاه. تم تضمين الأغشية المزودة بملاط مصبوغ في البارافين وتقسيمها باستخدام ميكروتوم. تم تركيب شرائح الغشاء على شرائح زجاجية وتصويرها باستخدام مجهر ضوئي (الشكل 4). للتحقق من ضرورة تخفيف PDMS إلى ملاط باستخدام التولوين وتطبيق فراغ لدخول PDMS إلى مسام الغشاء، يمكن رؤية مقارنة بين الأغشية مع وبدون هذه الطرق في الشكل التكميلي 3.
اختبار بقاء الخلايا
في دراسة سابقة، تم اختبار السمية الكيميائية المحتملة الناتجة عن استخدام التولوين في بناء الأجهزة. تم تجهيز الرقائق باستخدام وبدون تولوين في هاون PDMS، وتم نمو خلايا Calu-3 الظهارية في سرطان الغدة في الرئة البشرية حتى التقاء على مدى يومين، وزرعت لمدة يوم واحد في الشرائح كما هو موضح سابقا8. تم تقييم موت الخلايا من خلال التلوين الأزرق باستخدام تريبان، حيث أزيل جميع الخلايا من الجهاز، وعد الخلايا الميتة (الزرقاء) مقابل الخلايا الحية غير المصبوغة. تم تقييم الانتشار من خلال حضنة الكواشف في وسط الشريحة قبل إجراء اختبار AlamarBlue، مع قراءة امتصاص الفلورية عبر قارئ اللوحة، والذي يعكس الانتشار (الشكل 5)8.
ملحق غشاء قاعدة ECM
لإظهار التطبيق العام لهذا الإجراء في إنتاج ارتباط قوي ومرن مع مجموعة من الأغشية، تم تكرار البروتوكول باستخدام غشاء قائم على المصفوفة خارج الخلية بالكامل (ECM) (الشكل 6). تم تجهيز غشاء القاعدة الذي يحتوي على سقالات ECM من مثانات بولية خنازير كما هو موضح قبل17. لفترة وجيزة، تم الحصول على مثانات الخنازير البولية من إناث الحيوانات التي تتراوح أعمارها بين 4 و8 أشهر من مسلخ محلي (Kroon Vlees b.v.، خرونينغن، هولندا) ومعالجتها خلال 3 ساعات من الجمع. تمت إزالة الأنسجة الضام والدهون من المثانة، وقلبت المثانة من الداخل إلى الخارج، وتم تشريح طبقة الطهارة بشكل غير حاد، مع الحفاظ على النسيج في PBS بدرجة حرارة الغرفة. تم تجفيف سقالات ECM لإجراء تثبيت الغشاء17. تم قطع السقالات المعدة وربطها بنصف شرائح PDMS كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. تم إنتاج قالب جديد يحتوي على غرف إضافية لتمدد الغشاء داخل الجهاز لإظهار أن الروابط السيليكونية المفروضة يمكنها أيضا تحمل الإجهاد الميكانيكي الأفقي (الملف التكميلي 2).
اختبار سلامة غشاء ECM
تم إجراء اختبار سلامة ختم الغشاء كما سبق. بعد ذلك، تم توصيل شريحة التمدد بمضخات الحقنة، التي كانت تسحب فراغا في الحجرات الجانبية للجهاز لإنتاج 1 مم من التمدد الأفقي على غشاء ECM طوال الليل (الشكل 7).
تمايز خلايا الظهارة وزراعة الخلايا الليفية في مجرى الهواء القياسي مع غشاء PET
للتحقق من أداء الشريحة المقدمة كمجرى هوائي على شريحة لخلايا ALI، تم زراعة خلايا Calu-3 الظهارية لسرطان الغدة في الرئة البشرية (ATCC، ماناساس، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية) لتلتقي وتتعرض للهواء داخل الجهاز، في دراسةسابقة 8. بعد 10 أيام من التعرض للهواء القمي، يمكن رؤية خلايا الظهارة Calu-3 تتمايز إلى خلايا منتجة للمخاط، ويتضح ذلك من إنتاج المخاط، الذي يقاس بصبغة الأزرق الألسي (الشكل 8)8.
للتحقق من إجراءاتنا للتدفق الخالي من التسرب المطول والزراعة المشتركة، يمكن رؤية مثال من منشور سابق؛ للاطلاع على منهجية زراعة الخلايا الكاملة، راجع هذه المقالة8. تم زراعة خلايا مجرى الهواء الظهاري في غرفة الزراعة القمية للشريحة تحت تدفق هواء مستمر لمدة 21 يوما، مع زراعة الخلايا الليفية الأولية في مجرى الهواء رأسا على عقب على الجانب المقابل من الغشاء. باختصار، تم عزل خلايا مجرى الهواء الظهارية الأولية عن طريق علاج البروتيز (0.2 ملغ/مل في HBSS، ساعتان، 37 درجة مئوية)، وكشط الخلايا، وحفظ الخلايا بالتبريد من الأنسجة القصبية القصبية المتبقية من ثلاثة معطين صحيين في الرئة، ولم تتوفر لهم معلومات إضافية. تم عزل الأرومات الليفية في مجرى الهواء البشري (AFs) بنفس الطريقة من نسيج الشعب الهوائية في نسيج رئوي مزروع لمرض الانسداد الرئوي المزروع من متبرع واحد.
في الشكل 9، يمكن رؤية رسم بياني للشريحة وكيف تظهر الخلايا المذكورة أعلاه عبر وعلى طول غرف الجهاز.
زراعة خلايا الظهارة في الزراعة المشتركة مع الخلايا الليفية على غشاء ECM
تسهل السقالة التي تحتوي على الغشاء القاعدي زراعة الخلايا الظهارية والميزنشيمية. تم زرع الخلايا الكيراتينية البشرية الخالدة (خلايا HaCaT) بكثافة 60 × 103 خلايا/سممربع على الجانب الظلائي (الداخلي) من الغشاء، وكانت القدرة على البقاء 95٪ بعد 24 ساعة مقارنة ب 91٪ في قارورة زراعة الخلايا البلاستيكية (الشكل 10A). بعد ذلك، تم زرع الأرومات الليفية MRC-5 الطبيعية في الرئة البشرية بكثافة 60 × 103 خلايا/سممربع إلى الجانب البمثيري (الخارجي) ونمت في الزراعة المشتركة مع خلايا HaCat لمدة 14 يوما لتقييم القدرة طويلة الأمد على الزراعة المشتركة بين الخلايا الظهارية والميزنشمية على غشاء ECM الأصلي (الشكل 10D). شكلت الخلايا الظهارية طبقة أحادية متلاقية على الجانب الداخلي من الغشاء، بينما توزعت الخلايا الليفية بكثافة أقل على السطح الخارجي لغشية ECM لكنها احتفظت بشكلها المميز الشبيه بالمغزل (الشكل 10C). يمكن مشاهدة فيديو إعادة البناء ثلاثي الأبعاد في الملف الإضافي 417.
قدمت الدراسة الحالية إجراء محسنا لإغلاق الغشاء ينتج اتصالا قويا بين PDMS وغشاء، قادر على مقاومة الاضطرابات الناتجة عن التعامل اليدوي مع الشريحة، ويسمح بزراعة الغبار لفترة طويلة تحت التدفق باستخدام ضغوط تصل إلى 0.7 باسكال. أظهرنا أن هذه الأغشية مرتبطة بالسيليكون الذي اخترق أغشية الزراعة عبر مسامها، مما سهل روابط السيلان التساهمية بين نصفي الشريحة وملاط PDMS المفروع. بالإضافة إلى ذلك، لا تسبب الإجراء المعروض سمية خلوية، بشرط تطبيق الهاون بشكل صحيح. علاوة على ذلك، ساهمت الشرائح المنتجة في تسهيل زراعة مرافقة طويلة الأمد في الظهارة الأحادية والميزانشيمية الظهارية. بينما ينطبق هذا الإجراء فقط على الأغشية المسامية، إلا أنه يظل إجراء منخفض الإدخال لإنتاج شرائح ALI الموثوقة والجاهزة لزراعة الخلايا.
الشكل 1. رسومات إنتاج نصف شرائح PDMS وتحضير الغشاء. لإنتاج نصف شرائح PDMS (الخطوة 1.2)، تملأ قوالب الرقائق بأنابيب PDMS سائلة مع حقنة فوهة عريضة، 4.4 مل في القالب العلوي و2.4 مل في القالب السفلي. يتم تجميد أنصاف PDMS لمدة ساعتين عند 65 درجة مئوية، ثم يتم ثقب 4 مداخل في نصف الشريحة العلوي عند أطراف الحجرة والنقاط المشار إليها في القالب. لتحضير الغشاء (الخطوة 1.3)، يتم تثبيت قالب الغشاء المطبوع بقوة على سطح الغشاء. باستخدام شفرة جديدة، يتم قطع حول القالب وإزالة غشاء الشريحة من المادة المحيطة. يمكن تغطية الأغشية لزراعة الخلايا أو استخدامها مباشرة في الخطوة الثانية. تم إنشاؤه في BioRender. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. إجراء ربط الغشاء. يتم خلط هاون PDMS كما هو موضح أعلاه مباشرة قبل الاستخدام. يتم تقطر الملاط على الزوايا الأربع حول غرفة الزراعة وينشر بلطف حول موقع ربط الغشاء باستخدام نهاية الماصنة المائلة. يوضع أحد طرفي الغشاء على الملاط، ثم، بمجرد محاذاته مع غرفة الزرعة، يترك بلطف ليسقط. يعاد تطبيق الملاط بالتنقيط ويطلى على حواف الغشاء بعناية كبيرة حتى لا يلامس أي سيليكون سطح الغشاء داخل منطقة الزراعة. توضع الأغشية المثبتة بنصف الشريحة فورا في غرفة تفريغ لإزالة الفقاعات الدقيقة، وضمان تسرب السيليكون إلى السطح والمسام، وإزالة التولوين لتقليل الهجوم الكيميائي على الغشاء. تم إنشاؤه في BioRender. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. أمثلة على وضع الأغشية. (أ) تثبيت الغشاء بنجاح، التصلب عند الريتين. (ب) ارتباط الغشاء المعالج في الفرن (65 درجة مئوية بدلا من التيار الدقيق)، يمكن ملاحظة أن الغشاء قد انتف داخل الحجرة مع انقباض السيليكون بعد التسخين. (ج) الشرائح الكاملة مع وضع أغشية PET وPC بشكل صحيح. (د) الوضع الخاطئ للغشاء سيؤدي إلى تغير حجم كل جانب من الشريحة مع حركة الغشاء، مما يسبب تدفقا متغيرا، مما يضغط على الخلايا داخل الشريحة وكذلك على المضخات المتصلة بالرقاقة. تم إنشاؤه في BioRender. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. صور المجهر الضوئي لأغشية PET وPC المقطعة والمثبتة. يظهر غزو السيليكون إلى مسام الغشاء نتيجة لعملية المعالجة بالفراغ بالتقنية المغناطيسية اللاسلكية. (أ) صور لنفس الغشاء بدون تطبيق PDMS على الغشاء، يمكن رؤية مسام شفافة، بالإضافة إلى سطح نظيف في الصورة المستقطبة. (ب) تم صبغ ملاط PDMS بلون أحمر النيل، ويمكن رؤية السيليكون باللون الأرجواني أنه غزا المسام بنجاح وغطى السطح بشكل رقيق تحت الفراغ. تم تمييزه بأشكال بيضاء/أرجواني. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5. لم تتغير صلاحية الخلايا في أجهزة الشريحة من خلال البناء سواء كان يحتوي أو بدون تولوين كعامل تخفيف في هاون PDMS. تم زرع خلايا Calu-3 بمعدل 6.5 × 10إلى 4 خلايا في كل شريحة، وعند وصولها إلى نقطة التقاء الجسم، تم حضانها طوال الليل قبل إجراء اختبار AlamarBlue على الفائق وTrypanBlue على الخلايا. تم اختبار الفروق بين المجموعات (n=4) التي أعدت مع وبدون تولوين بواسطة اختبار t الطالب غير المرتبط، p > 0.05 = ns (غير دلالي)8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6. رقائق الغشاء في القبو. (أ) فشلت سلامة الغشاء لأن ملاط PDMS/تولوين لم يتم تنظيفه بسرعة كافية؛ وقد أدى ذلك إلى تلف بروتينات المصفوفة وتسبب في تعطيل إغلاق الشريحة. (ب) نجح ختم الغشاء والشرائح، لكن الغشاء تم إغلاقه في حالة فضفاضة. (ج) إغلاق الأغشية والشريحة بنجاح، تكون الشريحة فعالة للتدفق والتمدد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7. صورتان لشريحة ECM تحت التمدد. (أ) شريحة في حالة راحة. (ب) شريحة تحت تمدد أفقي 1.2 مم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8. تلوين أزرق ألكيان (نوى باللون الأرجواني، مخاط أزرق) لخلايا الظهارة كالو-3 في الرئة البشرية التي نمت في الرقائق بعد التعرض للهواء في الجهاز. تم نمو خلايا Calu-3 حتى تلتقي وزرعت لمدة 10 أيام تحت معدل تدفق مستمر يبلغ 150 ميكرولتر/ساعة في الحجرة القاعدية، وكانت مكشوفة إما في الوسط أو الهواء من الجانب القمي. تم إنتاج التدفق باستخدام مضخة بريستالتية داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2. في نهاية الزراعة، تمت إزالة الأغشية وصبغها. عرض عرضي لتلوين الأزرق الألسي لخلايا Calu-3 التي نمت لمدة 10 أيام مغمورة (A) ومعرضة للهواء (B)8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9. تصور الخلايا الظهارية البشرية الأولية والأرومات الليفية في الزراعة الممتدة داخل الجهاز. تم زرع الأرومات الليفية في مجرى الهواء داخل الجهاز وتركت للالتصاق طوال الليل قبل قلب الجهاز وزرع خلايا ظهارية على الجانب الآخر من الغشاء. تم نمو الخلايا حتى التقاء الجسم، وتعرضها للهواء، وزراعتها لمدة 21 يوما تحت معدل تدفق مستمر يبلغ 150 ميكرولتر/ساعة، تم إنتاجه بواسطة مضخة بريستالية داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تمت إزالة الأغشية بعد الزراعة، وتثبيتها، وتركيبها، وتركيبها على شرائح قبل التلوين. تم صبغ خلايا الظهارة لمادة Mucin 5AC (MUC5AC)18، وهو مكون من المخاط، وبروتين صندوق الشوكة J1 (FOXJ1)19، وهو عامل نسخ يشارك في الإشارات لإنتاج الأهداب. تم صبغ الأرومات الليفية بعرق جرثوم القمح (WGA) لرؤية طبقات الفوسفوليبيد الثنائية الخلوية. تم حضن الخلايا ب 5 ميكروغرام/مل في HBSS لمدة 15 دقيقة وغسلت ثلاث مرات باستخدام PBS قبل التصوير. تم تصور جميع أنوية الخلايا باستخدام DAPI. (أ) عرض مقطع عرضي: يتم إنتاجه من إسقاط مكدس Z لصور (B) و (C). (ب) صبغة ظهارية MUC5AC/FOXJ1/DAPI على غشاء شرائح. (ج) البنية الخارجية الكاملة لطبقة الأرومات الليفية في الحجرة القاعدية8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10. القدرة على الخلية والزراعة المشتركة على سقالة الغشاء القاعدي. (أ) حيوية أو ميتة لخلايا HaCaT المزروعة على الجانب الطلائي، تم اختبار 3 عينات مستقلة، وتم التقاط 3 حقول عشوائية من كل عينة (n = 3). تم إجراء اختبار ANOVA عادي أحادي الاتجاه مع تصحيح توكي. يوضح الرسم البياني المتوسط مع الانحراف المعياري. الزراعة المشتركة لخلايا (B) HaCaT على الجانب الطلائي، و(C) الخلايا الليفية الرئوية MRC-5 على الجانب البتكسي من الغشاء القاعدي المحاط بألياف الكولاجين، وقضبان القشور بحجم 50 ميكرومتر. (D) عرض ثلاثي الأبعاد للزراعة المشتركة من المنظور الإيزومتري العلوي والأسفلي، أشرطة المقياس بحجم 100 ميكرومتر، ويمكن العثور على تصور متحرك في الشكل التكميلي 4. (ه) سماكة غشاء القاعدة قبل وبعد إزالة الخلايا الداخلية، تم قياس 14 مخاطية، ومن بينها تم أخذ 6 (ممثلة بالمثلثات) لإزالة الخلية. في كل عينة تم مسح ثلاثة حقول عشوائية وتمقياس 17 نقطة على الأقل 10 نقاط لكل حقل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 1 الإضافي. تصاميم قوالب الشريحة للنصفين العلوي والسفلي من شريحة PET/PC القياسية. (أ) صورة لقالب الشريحة السفلي الذي يمكن إنتاجه من . STL في الملف التكميلي 1. (ب) صورة للقالب العلوي للشريحة التي يمكن إنتاجها من . STL في الملف الإضافي 2. (ج) صورة لقالب الغشاء المستخدم في قطع أغشية الشريحة التي يمكن إنتاجها من . STL في الملف التكميلي 3. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل الإضافي 2. تصاميم قوالب الشريحة للنصفين العلوي والسفلي من شريحة غشاء ECM المطاطية. (أ) صورة لقالب الشريحة السفلي الذي يمكن إنتاجه من . STL في الملف التكميلي 4. (ب) صورة للقالب العلوي للشريحة التي يمكن إنتاجها من . STL في الملف التكميلي 5. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل الإضافي 3. التحقق من إجراءات الإغلاق: مقارنة تسرب PDMS في المسام بدون تولوين لتقليل لزوجة الملاط ومعالج عند RT بدون فراغ. جميع الحالات مع أغشية PET (مسام 0.4 ميكرومتر)، وبعد معالجة PDMS (نيل ريد 1٪) تم دمج الأغشية في البرافين قبل التركيب وتصوير المجهر الضوئي. (أ) PDMS غير مخفف تم شفطه على غشاء PET. يمكن رؤية طبقة سميكة من PDMS على سطح الغشاء، بينما لا يمكن ملاحظة دخول أي PDMS إلى المسام (مع تمييز بصناديق بيضاء). (ب) هاون PDMS مخفف تم شفطه على غشاء PET. يمكن رؤية طبقة من PDMS على سطح الغشاء، بينما لا يمكن ملاحظة دخول أي PDMS إلى المسام (مع تمييز بصناديق بيضاء). (ج) هاون PDMS مخفف تم شفطه على غشاء PET. يمكن رؤية طبقة رقيقة من PDMS على سطح الغشاء بالإضافة إلى تسرب إلى المسام على طول الغشاء (تبرز بصناديق بيضاء). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4. 3D تصور خلايا HaCat (ظهارية) وMRC-5 (السترومال) في الزراعة المشتركة على هيكل ECM الخنزيري. عرض ثلاثي الأبعاد متحرك للثقافة المشتركة من مشاهد متساوية القياس من الأعلى والأسفل، يمكن رؤية صور له في الشكل 10D، أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف إضافي 1. 3D. ملف STL للقالب السفلي. يمكن استخدام القالب لإنتاج النصف السفلي من الشريحة القياسية عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد أو طريقة تصنيع مماثلة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف إضافي 2. 3D. ملف STL للقالب العلوي. يمكن استخدام القالب لإنتاج النصف العلوي من الشريحة القياسية عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد أو طريقة تصنيع مكافئة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف تكميلي 3. 3D. ملف STL لقالب الغشاء. يمكن استخدام القناع لإنتاج أغشية بالحجم المناسب للشريحة المقدمة، ويمكن إنتاجه بالطباعة ثلاثية الأبعاد أو طريقة تصنيع مكافئة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف إضافي 4. 3D. ملف STL من القالب السفلي لشريحة التمدد. يمكن استخدام القالب لإنتاج النصف السفلي من شريحة التمدد عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد أو طريقة تصنيع مكافئة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف إضافي 5. 3D. ملف STL للقالب العلوي لشريحة التمدد. يمكن استخدام القالب لإنتاج النصف العلوي من شريحة التمدد عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد أو طريقة تصنيع مماثلة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
يمثل بروتوكول ختم الرقائق الذي نقدمه هنا طريقة جديدة لإنتاج أختام رقاقة غشائية PDMS محكمة ضد الماء صالحة للزراعة طويلة الأمد تحت التدفق، ويمكن إنتاجها بمعدات محدودة، ولا تتطلب مهارات متخصصة للاقتراب. نعرض طريقة إنتاج رقائق الرقائق ذات الأغشية (PET، PC، ECM) ملتصقة بالسطح بواسطة ملاط السيليكون، وأظهرنا أن التطبيق السريع للتفريغ يسهل تسرب PDMS إلى المسام وعبر سطح الأغشية البلاستيكية. كما نظهر أن الرقائق الناتجة محكمة الإغلاق وقادرة على تنفيذ مجموعة واسعة من تطبيقات الزراعة.
هناك عدة طرق مختلفة للتعامل مع الروابط البلاستيكية مع PDMS، وهي استراتيجية ربط شائعة بسبب الخصائص المفيدة لزراعة الخلايا في PDMS، مثل نفاذية الغاز أو قابلية النمط، والأغشية البلاستيكية لجدواها لجدواها لزراعة الخلايا7. تشمل هذه التنشيط السطحي باستخدام بلازما O2 ، أو معالجة كورونا، أو الأوزون، التي تسهل تكوين الروابط التساهمية بين السيليكون أو الزجاج20. بخلاف ذلك، تستخدم تقنيات اللصق الكيميائي باستخدام عضويات مثل APTES ((3-أمينوبروبيل) ترايثوكسيسيلان) أو MPTMS ((3-ميركابتوبروبيل) تريميثوكسيسيلان) لجعل سطح المادتين وظيفيا بإضافة مجموعات تفاعلية21. بدلا من ذلك، يمكن لصق PDMS والركائز البلاستيكية بطريقة لاصقة تتضمن الإيبوكسي أو المواد اللاصقة الأخرى22. نقدم مزيجا بين تنشيط السطح واللصق الكيميائي، مع استخدام الأغشية المسامية والفراغ لإنتاج اتصال فيزيائي عبر الغشاء يمكن ربطه من خلال تنشيط سطح البلازما O2 فقط. من خلال تخفيف PDMS بالتولوين، نسمح بغزو PDMS عبر مسام الغشاء تحت الفراغ، مما يسمح بربط أغشية مختلفة تساهميا عبر روابط PDMS-PDMS عبر نصفي الشريحة والغشاء المدمج في الملاط. من خلال إنتاج شبكة سيليكون مادية عبر هذه المسام، نتجنب الحاجة إلى معالجة كيميائية سطحية أو الحرارة والضغط التي توفرها آلة النقش الساخن، والتي غالبا ما تساعد هذه التقنيات23.
في الدراسة الحالية، تم توفير شريحة ذات حجرتين واسعة النطاق (الملف التكميلي 1) يمكن أن تحتوي على مجموعة من الوظائف. ثانيا، شريحة قادرة على التمدد الأفقي الدوري (الملف التكميلي 2). تعمل هذه الأجهزة كجهاز Airway-on-Chip، بينما يمكن أيضا استخدام النموذج كجهاز معائي على شريحة، كما ظهرسابقا 13. في الأساس، يتم توفير دليل خطوة بخطوة يحتوي على عدد من الخيارات المختلفة لإنتاج القوالب، وتحضير الغشاء، وبناء الرقائق التي يمكن تطبيقها على منصات رقائق جديدة إضافية حسب التطبيق المطلوب للباحثين. ينصح باستخدام فرن بلازما O2 للإغلاق النهائي. ومع ذلك، فقد لوحظ أن جهاز بلازما محمول أو ضغط يدوي باستخدام هاون PDMS كان ناجحا أيضا لهذه الخطوة24. في هذا البروتوكول الخاص بإجراء الإغلاق هذا، تم تسليط الضوء على العقبات الرئيسية والمواصفات في كل نقطة. تشمل هذه الخيارات خيار تغطية الأغشية مسبقا، وأهمية الاستخدام الفوري لماطين PDMS/التولوين، وأهمية عدم دخول الملاط إلى منطقة الزراعة، وأهمية عدم تحرك الغشاء بعد الاتصال بالملاط.
تم تكرار عملية الإغلاق هذه مرارا من قبل المحققين باستخدام بروتوكول مكتوب؛ لم تكن هناك حاجة سوى التوضيحات التالية لنجاح الإغلاق في محاولة ثانية. عند حدوث تسربات أثناء اختبار الإجهاد أو زراعة الخلايا الممتدة، يمكن استكشاف بعض الخيارات. أولا، يجب على الباحث التأكد من أن الهاون مصنوع طازجا من سائل PDMS لم يبدأ في التجميد وأنه ممزوج جيدا بالتولوين. اللزوجة المنخفضة للمونة هي ما يسمح بطبقة رقيقة وناعمة يمكن أن تتدفق إلى مسام الغشاء أثناء تفريغ الهواء. ثانيا، يجب تطبيق كمية كافية من الملاط لتغطية كامل الجزء السفلي والعلوي من الغشاء، بينما الكمية الزائدة ستؤدي إلى تدفقه إلى منطقة الزراعة تحت الضغط، فإن القليل جدا منها سيترك فجوات توفر مسارا للتسرب بين الغرف. ثالثا، يجب أن تكون الأغشية مستوية قبل وأثناء الالتصاق. وأخيرا، رغم الجهد اليدوي المتطلب، يجب أن تبقى الرقائق خالية إلى حد كبير من الأوساخ لضمان الالتصاق النهائي الكامل، لذا فإن العمل بسرعة ونظافة أمر ضروري.
بينما أظهرنا في هذه الورقة الاقتراب من ثلاثة أنواع مختلفة من الأغشية المسامية، لا يمكن التنبؤ بوظيفة هذه الطريقة للأغشية الأخرى. وذلك لأن المقاومات الكيميائية المختلفة للتولوين، بالإضافة إلى الكثافات والأحجام الأخرى للمسام، تؤثر على نتيجة عملية الإغلاق هذه. ومع ذلك، نظهر أول ربط غشائي قابل للتمدد بالكامل يعتمد على ECM، مما يشير إلى مرونة عالية للبروتوكول. ومع ذلك، لم يتم فحص ثبات أداء التمدد بشكل موثوق، حيث أن مناطق الأغشية القاعدية المختلفة، والأعضاء، والمصادر ستنتج اختلافات ميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك، فإن جدوى زراعة الخلايا لأغشية ECM عرضة للتغير مع مرور الوقت، سواء في الزراعة أوفي التخزين. بينما تعمل هذه الطريقة مع الأغشية المختلفة وتركيبات الشيك، إلا أنها تتطلب أن يكون الطلاء يدويا للملاط فعالا، وهو ما يتطلب وقتا قليلا نسبيا لكنه سينجح غالبا مع النماذج الأكبر مثل التي نوفرها. أخيرا، بينما تتطلب عملية ربط الغشاء فقط PDMS، والتولوين، وغشاء، وغرفة تفريغ، فإن الإغلاق النهائي للشريحة يعتمد على تطبيق بلازما O2 ، والتي ليست متوفرة عالميا.
رغم القيود، فإن البروتوكول المقدم جديد ولا يتطلب مهارة متخصصة للاقتراب منه. حسب علمنا، فإن إنتاج شبكات السيليكون عبر مسام الغشاء عن طريق شفط ملاط PDMS منخفض اللزوجة هو الأول من نوعه. على عكس الجسور الكيميائية أو الميكانيكية الوظيفية الأخرى بين المواد المختلفة التي تقوم عليها الشريحة الوظيفية، فإن هذا الحل ممكن في معظم بيئات المختبر.
الإفصاحات
لا يوجد تضارب مصالح لدى المؤلفين.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل اتحاد الطب الدقيق لمزيد من الأكسجين (P4O2) بالإضافة إلى تمويل من Stichting Proefdiervrij. أعمق امتناني لإيزادورا كراجولجاك على فكرة استخدام صبغة النيل الحمراء، لأنها ستمتزج مع أجهزة PDMS لتصوير شبكات السيليكون، ولمرجان رايندرز-لوينج على موهبتها في تقطيع وتركيب الأغشية. يعبر المؤلفون عن أعمق شكرهم لقسم التحليل الدوائي وسابيث فيربورتي على توفير الوصول إلى فرن بلازما الأكسجين الخاص بهم، ولم تكن العملية لتحدث بدونه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حقنة واسعة الأنف 2 مل | بي دي إميرلد | 307727 | |
| ثقب خزعة 2 ملم | كاي الطبية | BP-20F | |
| خط خلية كالو-3 | ATCC | HTB-55 | RRID: CVCL_0609 |
| HBSS (محلول الملح المتوازن هانكس) | جيبكو | 14170112 | |
| O2 فرن البلازما | هاريك بلازما | PDC-002 | |
| أغشية زراعة الخلايا المحفورة بمسار PC | ipCELLCULTURE | 1000M25/620N403/47 | |
| أغشية زراعة الخلايا المحفورة بتتبع PET | ipCELLCULTURE | 2000M23/610N403/47 | |
| بولي ديميثيل سيلوكسان/سيلغارد 184 السيليكون الإيلاستومر الأساسي وعامل التجفيف | داو كورنينغ | DOWC25100445 | |
| بولي ميثيل ميثاكريلات (8 ملم) | كولتيك | لا يوجد | |
| راتنج فوتوبوليمر قياسي (رمادي)(1 كجم) | إليغو | لا يوجد | |
| تولوين | ميرك | 1,08,325 | |
| غرفة التفريغ | فيشر ساينتفيك | 12080253 |
المراجع
- Ugodnikov, A., Persson, H., Simmons, C. A. Bridging barriers: advances and challenges in modeling biological barriers and measuring barrier integrity in organ-on-chip systems. Lab Chip. 24 (13), 3199-3225 (2024).
- Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
- Reardon, S. Beyond lab animals. Science. 389 (6761), 676-679 (2025).
- Qiu, J., Li, J., Guo, Z., Zhang, Y., Nie, B., Qi, G., et al. 3D Printing of Individualized Microfluidic Chips with DLP-Based Printer. Materials (Basel). 16 (21), 6984(2023).
- Survey on reliability of microfluidics-based devices and components. , The Microfluidics Association. https://microfluidics-association.org (2025).
- Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. , (2022).
- Nahak, B. K., Mishra, A., Preetam, S., Tiwari, A. Advances in organ-on-a-chip materials and devices. ACS applied bio materials. 5 (8), 3576-3607 (2008).
- Rae, B., Vasse, G. F., Mosayebi, J., van den Berge, M., Pouwels, S. D., Heijink, I. H. Development of a Widely Accessible, Advanced Large-Scale Microfluidic Airway-on-Chip. Bioengineering (Basel). 12 (2), 182(2025).
- Nizamoglu, M., Joglekar, M. M., Almeida, C. R., Larsson Callerfelt, A. K., Dupin, I., et al. Innovative three-dimensional models for understanding mechanisms underlying lung diseases: powerful tools for translational research. Eur Respir Rev. 32 (169), 230042(2023).
- Piergiovanni, M., Leite, S. B., Corvi, R., Whelan, M. Standardisation needs for organ on chip devices. Lab Chip. 21 (15), 2857-2868 (2021).
- Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958582(2022).
- Cameron, T. C., Randhawa, A., Grist, S. M., Bennet, T., Hua, J., Alde, L. G., et al. PDMS Organ-On-Chip Design and Fabrication: Strategies for Improving Fluidic Integration and Chip Robustness of Rapidly Prototyped Microfluidic In Vitro Models. Micromachines (Basel). 13 (10), 1573(2022).
- Rae, B., Bood, V., Dijk, H. J., Vasse, G. F., Melgert, B. N., Nagelkerke, A., et al. Interorgan Communication Between Lung and Colorectal Epithelial Cells Studied Using a Novel Multi-Organ-On-Chip System. Compr Physiol. 15 (5), e70051(2025).
- van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., et al. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J Vis Exp. (127), e56334(2017).
- Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Mater Today Bio. , (2022).
- Nawroth, J. C., et al. Breathing on chip: Dynamic flow and stretch accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. Materials Today Bio. 21, 100713(2023).
- Ramirez, J. A., Estrada, S., Harmsen, M. C., Sharma, P. K. Development of an in vitro platform for epithelial-stromal interactions: A basement membrane-containing scaffold from decellularized porcine bladders. Matrix Biol Plus. 26, (2025).
- Bonser, L. R., Erle, D. J. Airway mucus and asthma: the role of MUC5AC and MUC5B. Journal of clinical medicine. 6 (12), 112(2017).
- Yu, X., et al. Foxj1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic program. Nature genetics. 40 (12), 1445-1453 (2008).
- Lu, C. Surface modification of polyimide fibers for high-performance composite by using oxygen plasma and silane coupling agent treatment. Textile Research Journal. 92 (23-24), 4899-4911 (2022).
- Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. F. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
- Borók, A., Kristóf, L., Attila, B. PDMS bonding technologies for microfluidic applications: A review. Biosensors. 11 (8), 292(2021).
- Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
- Young, A. T., et al. Simple design for membrane-free microphysiological systems to model the blood-tissue barriers. Organs-on-a-Chip. 5, 100032(2023).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
