مقالة منهجية

سير عمل عملي لتحليل بيانات النسخ المكانية: من الحصول على البيانات إلى التحليلات المتقدمة

75 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70188

⸱

أغسطس 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Rehabilitation Medicine, Nanjing Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول سير عمل قابلاً للتكرار لتحليل بيانات النسخ المكانية (spatial transcriptomics)، حيث يرشد المستخدمين بدءاً من الحصول على البيانات العامة ومراقبة الجودة القائمة على Seurat، مروراً بالتكامل، والكشف عن السمات المكانية، وفك التلافيف لأنواع الخلايا (cell-type deconvolution)، وتوصيف مناطق الاهتمام، وتحليل التواصل بين الخلايا، مع نقاط تفتيش عملية تدعم التنفيذ الشفاف.

الملخص

يحدد تحليل النسخ المكاني (ST) أنماط التعبير الجيني على مستوى الجينوم بالكامل مع الحفاظ على السياق المكاني ثنائي الأبعاد لجزيئات mRNA داخل أقسام الأنسجة، مما يتيح دراسة بنية الأنسجة والبيولوجيا المرتبطة بالبيئة الدقيقة. ومع ذلك، لا يزال تحليل ST يشكل تحدياً لأن استيراد البيانات، ومراقبة الجودة، والتكامل، وفك الالتفاف (deconvolution)، والإحصاءات المكانية، والتصور غالباً ما تتطلب بيئات برمجية متعددة واختيارات دقيقة للمعلمات لضمان قابلية إعادة الإنتاج. يقدم هذا البروتوكول سير عمل حوسبي عملي لمجموعات بيانات ST العامة في لغة R، بدءاً من الحصول على البيانات وإعداد البرامج، وصولاً إلى تحميل البيانات باستخدام Seurat، ومراقبة الجودة، والتطبيع (normalization)، وتكامل العينات المتعددة، والتجميع (clustering)، وتحليل الجينات المتغيرة مكانياً. ثم يطبق سير العمل استراتيجيات فك التفاتاف تكميلية، بما في ذلك تحليل SPOTlight الموجه بالمرجع ونمذجة المواضيع غير الخاضعة للإشراف عبر STdeconvolve، يليه تحليل التواصل المكاني بين الخلايا باستخدام Giotto واختيار تفاعلي للمناطق ذات الاهتمام (ROI) باستخدام تطبيق Python Dash مخصص. ومن خلال التركيز على التنفيذ القائم على البرمجيات النصية (scripts)، والمبررات الصريحة للمعلمات، والمخرجات المتوقعة، ونقاط فحص استكشاف الأخطاء وإصلاحها، يوفر البروتوكول إطاراً قابلاً للتكيف لمجموعات بيانات ST القياسية القائمة على المصفوفات والمنصات ذات الصلة بعد تقييم المعلمات الخاصة بكل مجموعة بيانات ومنصة.

المقدمة

تعد الترانسكريبتوميات المكانية (ST) مجموعة تحويلية من التقنيات التي تقيس التعبير الجيني على نطاق الجينوم بالكامل مع الاحتفاظ بالإحداثيات المكانية لجزيئات الحمض الريبي النووي المرسال (mRNA) داخل المقاطع النسيجية. وتشمل طرق الترانسكريبتوميات المكانية نهجاً قائمة على التسلسل تستخدم مصفوفات ذات رموز شريطية موضعية، ونهج تصوير in situ التي ترسم خرائط الإشارات النسخية داخل البيئات الدقيقة للأنسجة السليمة1,2. ومن خلال الحفاظ على السياق المكاني، تتيح الترانسكريبتوميات المكانية تحليل بنية الأنسجة، وتنظيم الجوار الخلوي، والتواصل بين الخلايا، والعمليات البيولوجية المرتبطة بالبيئة الدقيقة التي لا يمكن تحليلها بشكل كامل بعد تفكيك الأنسجة3.

لقد أوجد النمو السريع لمستودعات بيانات النسخ المكانية (ST) العامة فرصًا غير مسبوقة للتحليل الثانوي وتطوير المنهجيات3. وتقوم موارد مثل قاعدة بيانات CROST بتنظيم مئات من مجموعات بيانات النسخ المكانية عبر أنواع متعددة ومنصات تكنولوجية متنوعة، بينما تركز مجموعات متخصصة مثل STOmicsDB على منهجيات محددة مثل Stereo-seq4,5. وبالرغم من وفرة هذه البيانات، لا يزال التحليل الحسابي يمثل تحديًا بسبب تعقيد هياكل البيانات المكانية، وتنوع الأدوات التحليلية، والعقبات التقنية في تنفيذ سير عمل قابل للتكرار6,7,8,9,10,11.

لمعالجة القصور الناتج عن الاعتماد على بيئة برمجية واحدة، يتم تقديم سير عمل حوسبي متكامل يستخدم أدوات تحليلية تكميلية هنا. تشتمل الأنظمة البيئية الشاملة الحالية لتحليل النسخ المكانية (ST) بشكل أساسي على Seurat وGiotto وأطر عمل قائمة على لغة Python مثل Squidpy6,7,12. ورغم أن الأدوات القائمة على لغة Python مثل Squidpy توفر وظائف واسعة لتحليل الرسوم البيانية المكانية، فإن دمج خط المعالجة الحوسبية الأساسي ضمن بيئة لغة برمجة واحدة يقلل من العقبات التقنية الناتجة عن تعدد اللغات. وبناءً على ذلك، تم تنفيذ خط المعالجة الأساسي بشكل رئيسي في لغة R لتقليل هذه العقبات التقنية. وضمن سير العمل القائم على لغة R، تُستخدم Seurat لتحميل البيانات، ومراقبة الجودة، والتطبيع (normalization)، وتقليل الأبعاد، والتصوير المرئي، وتكامل العينات المتعددة، مما يعكس استخدامها الشائع في سير عمل النسخ أحادي الخلية والمكاني. ثم تُستخدم Giotto لبناء الشبكات المكانية وتحليل التواصل بين الخلايا القائم على نظام الربيطة والمستقبل (ligand-receptor). وبالتالي، يربط خط المعالجة هذا بين عمليات المعالجة المسبقة والتكامل القائمة على Seurat وبين التحليل المكاني القائم على Giotto، مع الحفاظ على نقل البيانات بين مجموعتي الأداتين بشكل صريح وقابل للتكرار.

في هذا الإطار، تم تطبيق استراتيجيتين متكاملتين لفك الالتفاف (deconvolution): استراتيجية SPOTlight، وهي طريقة موجهة بالمرجع تستخدم بيانات scRNA-seq لتقدير نسب أنواع الخلايا، واستراتيجية STdeconvolve، وهي طريقة لنمذجة المواضيع غير خاضعة للإشراف تحدد الأنماط النسخية الكامنة8,11. وتوفر المخرجات رؤى متكاملة حول عدم التجانس الخلوي المكاني، ولكن لا يتم التعامل معها كتحقق تبادلي كمي ما لم يقم المستخدمون بإجراء تحليل التطابق الاختياري الموضح في البروتوكول. كما تم دمج تطبيق Python Dash مخصص، يسمى Select Spatial Spots، لتحديد المناطق ذات الأهمية (ROI) بشكل تفاعلي، ويقوم بتصدير ملفات تعليق توضيحية قياسية قائمة على الإحداثيات يمكن استخدامها في التحليلات اللاحقة.

فيما يتعلق بالتطبيق العملي، فإن سير العمل هذا مخصص في المقام الأول لبيانات النسخ المكاني (ST) القياسية القائمة على المصفوفات (على سبيل المثال، Visium بدقة 55 µm)، ويمكن تكييفه مع أنواع أخرى من الأنسجة بعد تقييم المعايير. ويجب مراعاة القيود الرئيسية قبل البدء في التحليل؛ أولاً، تعتمد وحدة فك الالتفاف الموجهة بالمرجع على مرجع scRNA-seq عالي الجودة ومطابق للنسيج. ثانياً، قد تتطلب المنصات ذات الدقة دون الخلوية أو القريبة من الخلية الواحدة معالجة مسبقة معدلة، أو تجميع الخانات المكانية، أو تجزئة الخلايا القائمة على الصور قبل التكامل2. وتُستخدم مجموعة بيانات قولون الفأر التمثيلية كحالة توضيحية لإظهار كيف يمكن لسير العمل تقييم النطاقات المكانية وتنظيم الأنسجة المحدد بواسطة العلامات، وليس كدليل على التوافق الشامل مع جميع المنصات.

البروتوكول

جميع المجموعات البيانية البيولوجية التي تم تحليلها في هذا البروتوكول متاحة للعامة وتستخدم حصرياً لأغراض التوضيح. تم توفير أرقام الوصول المحددة للبيانات والمستودعات المصدرية في الخطوات ذات الصلة. وقد تم إنتاج المجموعات البيانية الأصلية من قبل الباحثين الأصليين وفقاً للإرشادات الأخلاقية المؤسسية المطبقة على كل دراسة مصدرية. يرجى مراجعة جدول المواد للتحقق من جميع إصدارات البرامج وحزم R المطلوبة.

متطلبات الأجهزة: تتناسب الذاكرة الحسابية المطلوبة لسير العمل هذا مع عدد العينات والنقاط التي يتم تحليلها. بالنسبة لمجموعة بيانات النسخ المكانية النموذجية (على سبيل المثال، حوالي 3,000 نقطة لكل عينة عبر ما يصل إلى ثلاث عينات)، تكفي محطة عمل قياسية بذاكرة وصول عشوائي (RAM) لا تقل عن 16 GB لتشغيل خط المعالجة. ومع ذلك، يوصى بشدة باستخدام 32 GB من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) أو أكثر لضمان الأداء الأمثل والاستقرار، لا سيما خلال الخطوات الحسابية التي تتطلب ذاكرة مكثفة مثل تسوية SCTransform وتحليل المصفوفات أثناء عملية فك الالتفاف (deconvolution).

1. جمع البيانات وإعداد هيكل المجلدات

  1. الحصول على مجموعات بيانات الترانسكريبتوميات المكانية العامة (على سبيل المثال، رقم الدخول في GEO هو GSE169749، بتاريخ تقديم 26 مارس 2021، وتاريخ آخر تحديث 6 مارس 2022) وبيانات مرجعية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية single-cell RNA-seq (على سبيل المثال، رقم الدخول في GEO هو GSE264408، بتاريخ تقديم 19 أبريل 2024، وتاريخ آخر تحديث 10 ديسمبر 2024).
  2. تنزيل أرشيف البيانات الخام (على سبيل المثال، GSE169749_RAW.tar) من المستودع وفك ضغط الأرشيف.
    ملاحظة: بالنسبة لمجموعة البيانات التمثيلية المستخدمة في هذا البروتوكول، يحتوي الدليل المستخرج على ملفات متعددة لكل عينة، وعادة ما تدمج أسماء الملفات رقم دخول العينة في GEO (على سبيل المثال، GSM5213483).
  3. تنظيم الملفات في هيكل دليل معياري متوافق مع دالة Seurat Load10X_Spatial.
    1. إنشاء دليل بيانات رئيسي (على سبيل المثال، ./data/).
    2. إنشاء دليل فرعي مخصص لكل عينة (على سبيل المثال، ./data/sample_A1/).
    3. نقل (نسخ أو نقل) الملفات الأساسية التالية لكل عينة إلى الدليل الفرعي المقابل.
      1. وضع ملف filtered_feature_bc_matrix.h5 في الدليل الفرعي الرئيسي للعينة.
      2. إنشاء مجلد فرعي باسم spatial/ داخل دليل كل عينة.
      3. وضع الملفات التالية في المجلد الفرعي spatial/: tissue_positions_list.csv.gz، وscalefactors_json.json.gz، وtissue_hires_image.png.gz.
    4. فك ضغط ملفات .gz في مجلد spatial/. التأكد من بقاء أسماء الملفات الأصلية تماماً كما تطلبها دالة Load10X_Spatial (على سبيل المثال، tissue_positions_list.csv).
      ملاحظة: يجب أن يتبع الهيكل النهائي المنظم للتحميل السلس هذا النمط، باستخدام العينة A1 كمثال:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. إعداد بيئة البرمجيات

  1. قم بتثبيت R (الإصدار 4.4.3 أو أعلى).
  2. احصل على برامج التحليل النصية (من 1_ReadSpatialData.R إلى 8_Giotto_Communication.R) من مستودع GitHub (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow، عند رمز الالتزام 2d85e18 لضمان إمكانية التكرار).
  3. قم بتثبيت حزم R المطلوبة من CRAN وBioconductor عن طريق تنفيذ البرنامج النصي setup.R.
    ملاحظة: تتوفر قائمة شاملة بإصدارات الحزم المحددة المستخدمة في سير العمل هذا في جدول المواد (Table of Materials) كما تتوفر أيضاً في ملف session_info.txt داخل مستودع GitHub المرتبط (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
  4. قم بتثبيت Giotto Suite عن طريق تنفيذ أوامر التثبيت الموضحة في التوثيق الرسمي.
    1. انتقل إلى رابط التثبيت الرسمي للحصول على برامج الإعداد النصية: https://giottosuite.com/articles/installation.html
    2. قم بتهيئة بيئة Python المطلوبة وتبعيات النظام وفقاً للإرشادات الموضحة خطوة بخطوة.
  5. قم بتثبيت حزم إضافية لتحسين التصوير المرئي.
    1. نفذ الأمر: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
  6. قم بتثبيت أداة Select Spatial Spots المخصصة. تأكد من أن نظام التشغيل هو Windows أو macOS أو Linux، وأن إصدار Python 3.8 أو أعلى مثبت. هذه الخطوة اختيارية.
    1. احصل على الأداة من خلال الانتقال إلى مستودع GitHub (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots، عند رمز الالتزام d20946e لضمان إمكانية التكرار) وتنزيل الكود المصدري.
    2. انتقل إلى دليل الأداة وقم بتثبيت تبعيات Python: pip install -r requirements.txt
  7. قم بتثبيت حزمة glmGamPoi عن طريق تنفيذ BiocManager::install("glmGamPoi") لتسريع عملية تطبيع SCTransform.
    ملاحظة: يتطلب سير العمل الأساسي فقط الحزم المدرجة في الخطوات 2.1–2.3 و2.6. تُستخدم الحزمة Rfast2 لتسريع حساب إحصائية Moran's I. أما الحزم الاختيارية في الخطوة 2.5 فهي مخصصة لإنشاء مخططات جاهزة للنشر بنمط prism (ggprism) وللوصول إلى لوحة ألوان مناسبة للمصابين بعمى الألوان (colorBlindness). تتيح الأداة في الخطوة 2.6 وظيفة الاختيار التفاعلي للبقع. نفذ الأمر sessionInfo() واحفظ مخرجات وحدة التحكم الكاملة في ملف نصي؛ حيث يوثق ذلك إصدارات البرامج الدقيقة وتبعيات الحزم، وهو أمر بالغ الأهمية لضمان إمكانية التكرار على المدى الطويل.

3. تحميل البيانات المكانية ومراقبة الجودة (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

  1. اقرأ البيانات المكانية في كائنات Seurat.
    1. استخدام صورة_قراءة10X لتحميل صورة النسيج عالية الدقة يدويًا، مع تحديد الـ مسار الصورة واسم الصورة.
    2. استخدام تحميل_10X_المكاني مع الـ صورة يتم تعيين المعلمة إلى كائن الصورة الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1.1 لإنشاء كائن Seurat.
  2. حساب مقاييس ضبط الجودة.
    1. احسب النسبة المئوية للقراءات الميتوكوندرية باستخدام مجموعة ميزات النسبة المئوية وفقاً للنمط ^mt-.
  3. تصوير البيانات وتفسيرها بناءً على مقاييس مراقبة الجودة.
    1. إنشاء مخططات الكمان لـ عدد الخلايا المكانية (nCount_Spatial), nFeature_Spatial، و النسبة المئوية للميتوكوندريا باستخدام مخطط الكمان (VlnPlot).
    2. قم بإنشاء مخططات الميزات المكانية لهذه المقاييس باستخدام مخطط الميزات المكانية (SpatialFeaturePlot) لتحديد البقع الواقعة خارج منطقة النسيج.
      ملاحظة: نقطة فحص بصرية: عادةً ما تظهر البقع الموجودة خارج منطقة النسيج أعدادًا منخفضة من الـ UMI (عدد الخلايا المكاني (nCount_Spatial) < 500) وانخفاض الكشف عن الجين (عدد الميزات المكانية (nFeature_Spatial) < 200)
    3. لأغراض التوضيح، يتم تطبيق المرشحات لإزالة البقع منخفضة الجودة (على سبيل المثال، subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial) > 200 & عدد_الخلايا_المكانية > 500)). هذه خطوة اختيارية.
      ملاحظة: الهدف الأساسي من مراقبة الجودة (QC) في ترانسكريبتوميات الفضاء (spatial transcriptomics) هو تحديد وتوصيف الشوائب التقنية، مثل البقع الواقعة خارج النسيج. بالنسبة لبيانات Visium الخاصة بالقولون المستخدمة في العرض التوضيحي، فإن nFeature_Spatial > 200 و nCount_Spatial > 500 إزالة البقع ذات التعقيد المنخفض أو بقع الخلفية. بالنسبة للأنسجة ذات المحتوى المنخفض من الـ RNA أو المقاطع المتلللهة، يجب فحص مخططات الكمان (violin plots) ومخططات الميزات المكانية (spatial feature plots) قبل رفع العتبات؛ أما بالنسبة للأنسجة الكثيفة أو ذات الـ UMI العالي، فقد تكون العتبات الأكثر صرامة هي المناسبة. تجنب التصفية بناءً على قيم التعبير العالية فقط ما لم تكن هناك ثنائيات (doublets)، أو طيات نسيجية، أو شوائب واضحة. غالبًا ما لا يُنصح بالتصفية لأنها تزيل المواقع المكانية ماديًا، مما قد يؤدي إلى قطع استمرارية البنية النسيجية في التحليلات المكانية اللاحقة.

4. المعالجة المسبقة للبيانات ودمجها وتجميعها (3_IntegrationAndClustering.R)

  1. تطبيع ومعالجة العينات الفردية مسبقًا.
    1. تطبيق تطبيع SCTransform على كل عينة بشكل منفصل مع assay = Spatial.
  2. دمج عينات متعددة.
    1. تجهيز قائمة الكائنات المطببعة بواسطة SCT للدمج. التأكد من أن كل كائن يحتوي على assay من نوع "RNA" عن طريق نسخ assay من نوع "Spatial": spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​ملاحظة: يعمل نسخ assay من نوع "Spatial" إلى فتحة assay قياسية من نوع "RNA" كحل بديل ضروري لضمان التوافق مع وظائف الدمج اللاحقة المصممة أصلاً لكائنات Seurat أحادية الخلية.
    2. استخدام SelectIntegrationFeatures و PrepSCTIntegration لتحديد الميزات المتغيرة المشتركة.
    3. إيجاد مراسي الدمج باستخدام FindIntegrationAnchors مع normalization.method = "SCT".
    4. دمج البيانات باستخدام IntegrateData مع normalization.method = "SCT".
  3. إجراء تقليل الأبعاد والتجميع على الـ assay المدمج.
    1. تشغيل PCA على البيانات المدمجة باستخدام RunPCA.
    2. تحديد العدد الأمثل للمكونات الرئيسية (PCs) للتحليلات اللاحقة عن طريق حساب التباين التراكمي المفسر. تحديد نقطة المرفق (elbow point) برمجياً (على سبيل المثال، النقطة التي يتجاوز فيها التباين التراكمي 90% وينخفض فيها الربح الهامشي إلى أقل من 0.1%)، باستخدام الكود الموجود في 3_IntegrationAndClustering.R، الأسطر 36-38. يُشار إلى عدد الـ PCs الناتج فيما يلي باسم pc.use.
    3. تشغيل RunUMAP مع dims = 1:pc.use.
    4. تجميع الخلايا باستخدام FindNeighbors مع dims = 1:pc.use و FindClusters مع resolution = 0.5. يتم تعديل الدقة (resolution) فقط بعد فحص استقرار التجمعات وتماسك الجينات العلامة.
    5. إجراء تحليل التعبير التفريقي بين المجموعات المستهدفة (على سبيل المثال، "B1_colon_d14" مقابل "A1_colon_d0") باستخدام وظيفة FindMarkers.
      ​ملاحظة: نقطة تفتيش بصرية: سيظهر الدمج الناجح خلطاً مناسباً للعينات في مخطط UMAP مع الحفاظ على تجمعات متميزة بيولوجياً.
  4. تحديد الجينات المتغيرة مكانياً.
    1. لكل عينة أصلية، تشغيل FindSpatiallyVariableFeatures باستخدام طريقة "moransi" على assay من نوع "SCT" لحساب الارتباط الذاتي المكاني.

5. المعالجة المسبقة لبيانات المرجع أحادية الخلية (4_scDataPreProcessing.R)

  1. اقرأ مصفوفة تعداد تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (single-cell RNA-seq count matrix) باستخدام Read10X وأنشئ كائناً من نوع Seurat.
  2. قم بإجراء مراقبة الجودة القياسية (QC)، والتطبيع (normalization)، والتجميع (clustering).
    1. احسب النسبة المئوية للقراءات الميتوكوندرية (percent.mt) وقم بتصفية الخلايا (على سبيل المثال: nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
    2. قم بتطبيع البيانات باستخدام SCTransform، مع تعيين vars.to.regress = "percent.mt".
    3. قم بتشغيل PCA وUMAP وتجميع الخلايا باستخدام طريقة اختيار المكونات الرئيسية الديناميكية الموضحة في الخطوة 4.3.2.
  3. قم بتصنيف أنواع الخلايا.
    1. احسب درجات الوحدة (module scores) لجينات العلامات المميزة لأنواع الخلايا التقليدية باستخدام AddModuleScore.
    2. قم بتصنيف المجموعات بناءً على درجات الوحدة والبيولوجيا المعروفة. بدلاً من ذلك، استورد التصنيفات المحسوبة مسبقاً من البيانات الوصفية (metadata).

6. فك الالتفاف الموجه بالمرجع باستخدام SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

  1. تجهيز البيانات لـ SPOTlight.
    1. تحويل كائن Seurat الخاص بالخلايا المفردة والموسوم وكائن Seurat المكاني إلى كائنات SingleCellExperiment.
    2. إجراء التطبيع اللوغاريتمي (Log-normalize) لبيانات الخلايا المفردة باستخدام logNormCounts.
  2. تشغيل عملية فك الالتفاف (deconvolution) بواسطة SPOTlight.
    1. تحديد الجينات مفرطة التباين (HVGs) في بيانات الخلايا المفردة باستخدام modelGeneVar و getTopHVGs.
    2. حساب الجينات الواسمة لأنواع الخلايا باستخدام scoreMarkers وتصفيتها للحصول على واسمات عالية الجودة (على سبيل المثال، mean.AUC > 0.8).
    3. تقليل حجم عينة مرجع الخلايا المفردة لكل نوع من الخلايا إلى عدد يمكن التعامل معه (على سبيل المثال، 50 خلية) لتقليل وقت الحوسبة.
    4. تنفيذ فك الالتفاف باستخدام دالة SPOTlight مع weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", and gene_id = "gene".
  3. تصوير وتصدير النتائج.
    1. استخراج مصفوفة نتائج فك الالتفاف (نسب أنواع الخلايا لكل بقعة).
    2. استخدام plotSpatialScatterpie لتصوير التركيب الخلوي على الإحداثيات المكانية.
    3. إضافة نتائج فك الالتفاف إلى البيانات الوصفية (metadata) لكائن Seurat المكاني باستخدام AddMetaData. المخرجات المتوقعة: مصفوفة فك الالتفاف التي تحتوي على أعمدة نسب أنواع الخلايا لكل بقعة مكانية، ومخططات scatterpie مكانية تظهر التركيب الخلوي المحلي، وكائن Seurat يحتوي على نسب فك الالتفاف كبيانات وصفية.

7. فك الالتفاف بدون مرجع باستخدام STdeconvolve(7_STdeconvolve.R)

  1. تحضير البيانات المكانية.
    1. استخراج مصفوفة العد الخام من كائن Seurat المكاني باستخدام GetAssayData with slot = "counts".
    2. إزالة البقع والجينات منخفضة الجودة باستخدام cleanCounts من STdeconvolve (على سبيل المثال، min.lib.size = 100).
  2. تحديد أنواع الخلايا الكامنة.
    1. تصفية مجموعة البيانات بشكل إضافي للجينات التي يتم التعبير عنها في حد أدنى من نسبة البقع باستخدام restrictCorpus (على سبيل المثال، removeAbove=1.0، removeBelow = 0.05).
    2. ملاءمة نموذج تخصيص ديريكليه الكامن (LDA) عبر نطاق من أعداد المواضيع المحتملة (K) (على سبيل المثال، Ks = seq(2, 9, by = 1)) باستخدام fitLDA.
    3. اختيار النموذج الأمثل بناءً على الحد الأدنى من الحيرة (perplexity) باستخدام optimalModel with opt = "min".
  3. تحليل النتائج وتصورها.
    1. استخراج نسب أنواع الخلايا (المواضيع) (theta) وملفات الجينات التعريفية (beta) من النموذج الأمثل باستخدام getBetaTheta.
    2. للمساعدة في التفسير البيولوجي للمواضيع المفككة، استورد تعليقات المنطقة ذات الأهمية (ROI) التي تم إنشاؤها بواسطة أداة "Select Spatial Spots" (انظر الخطوة 9.3.3). استخدم هذه التعليقات كمعلمة المجموعات (groups) في دالة vizAllTopics لإسقاط نسب أنواع الخلايا المفككة مرة أخرى على الإحداثيات المكانية وتلوين البقع وفقاً لمنطقة الأهمية الخاصة بها. هذه الخطوة اختيارية.
      ملاحظة: المخرجات المتوقعة: يجب أن يعيد STdeconvolve قيم theta التي تمثل نسب المواضيع لكل بقعة وقيم beta التي تمثل ملفات الجينات التعريفية لكل موضوع. إذا رغب المستخدمون في مقارنة نتائج STdeconvolve غير الموجهة كمياً مع مخرجات SPOTlight الموجهة بالمرجع (من الخطوة 6)، يمكنهم تصدير كلتا مصفوفتي النسب (theta من STdeconvolve ومصفوفة SPOTlight) وحساب مقاييس الارتباط أو التطابق لكل بقعة (على سبيل المثال، ارتباط Pearson أو Spearman) باستخدام دوال R القياسية. المقارنة الكمية بين SPOTlight وSTdeconvolve اختيارية وليست مطلوبة لتنفيذ سير العمل الأساسي؛ ومع ذلك، فإن مصفوفات المخرجات ذات الصلة متاحة من الخطوتين 6.3.1 و7.3.1 للمستخدمين الذين يرغبون في إجراء مثل هذا التحليل.

8. التواصل الخلوي المكاني باستخدام Giotto(8_Giotto_Communication.R)

  1. تحويل كائن Seurat إلى كائن Giotto.
    1. استخدام دالة createGiottoObject، مع توفير مصفوفة العد الخام والإحداثيات المكانية.
  2. المعالجة المسبقة لكائن Giotto وإضافة نتائج فك الالتفاف (deconvolution).
    1. تطبيع البيانات باستخدام normalizeGiotto.
    2. إضافة تعليقات توضيحية لنوع الخلية (على سبيل المثال، نوع الخلية الرئيسي من فك الالتفاف باستخدام SPOTlight) إلى البيانات الوصفية للخلايا باستخدام addCellMetadata.
  3. استنتاج التواصل بين الخلايا المستند إلى المعلومات المكانية.
    1. إنشاء شبكة مكانية باستخدام createSpatialNetwork مع تعيين method = "Delaunay" و name = "Delaunay_network".
    2. تحميل قاعدة بيانات الربيطة والمستقبل (ligand-receptor) في بيئة R. التأكد من تنسيق الكائن المحمل كإطار بيانات (data frame) يحتوي على عمودين متميزين يمثلان رموز جينات الربيطة والمستقبل (على سبيل المثال، شبكة الفأر المجمعة مسبقاً من Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content، الإصدار v6، المنشور في 7 أبريل 2025).
    3. تشغيل exprCellCellcom مع تعيين cluster_column = "celltype_major" لتحديد تفاعلات الربيطة والمستقبل ذات الدلالة بين أنواع الخلايا الموجودة في تقارب مكاني. المخرجات المتوقعة: جدول نتائج يحتوي على أزواج الربيطة والمستقبل، وتوليفات أنواع الخلايا المصدر والهدف، وقيم log2 fold-change، وقيم P المعدلة؛ يتم الاحتفاظ بالتفاعلات ذات الدلالة (على سبيل المثال، p.adj < 0.05) لغرض التصوير البياني.

9. اختيار البقع التفاعلي باستخدام select spatial spots (6_SelectSpatialSpots.R)

  1. تجهيز البيانات للأداة التفاعلية.
    1. استخراج الإحداثيات المكانية من كائن Seurat باستخدام GetTissueCoordinates.
  2. تنسيق البيانات وتصديرها.
    1. تنسيق إطار بيانات الإحداثيات بحيث يحتوي على رؤوس أعمدة دقيقة وهي: CELL_ID, X, and Y.
    2. تصدير إطار البيانات المنسق إلى ملف CSV.
  3. إجراء تحليل المنطقة المحددة (ROI).
    1. تشغيل تطبيق Dash المخصص Select Spatial Spots وتحميل ملف CSV.
    2. تحديد البقع تفاعلياً بناءً على الموقع المكاني.
    3. تصدير قائمة البقع المختارة وتصنيفات المجموعة/المنطقة المحددة المعينة لها في ملف CSV جديد. المخرج المتوقع: ملف CSV يحتوي على معرفات البقع، وإحداثيات X/Y، وتصنيفات المجموعة/المنطقة المحددة التي يمكن مطابقتها مجدداً مع كائن Seurat عبر CELL_ID.

النتائج

يوضح تنفيذ سير العمل وتكامل البيانات السمات الرئيسية للأنسجة

تم تطبيق سير العمل الحسابي على بيانات النسخ المكاني لقولون الفأر لتوضيح المخرجات المتوقعة عبر المراحل التحليلية. وكما هو موضح في المخطط التوضيحي لسير العمل (الشكل 1)، بدأ المسار بعملية الحصول على البيانات ومراقبة الجودة، حيث حددت مخططات الميزات المكانية حدود الأنسجة (الشكل 2A,B). بعد ذلك، استُخدم سير عمل التكامل القائم على المراس (anchor-based integration) من Seurat لتقليل تأثيرات الدفعات التقنية مع الحفاظ على التباين البيولوجي القابل للتفسير. وأظهرت تصورات UMAP محاذاة العينات وأنماط التجميع المكاني بعد التكامل (الشكل 2C,D). كما تم تنفيذ الاختيار الديناميكي الكمي للمكونات الرئيسية (PCs) بناءً على التباين التراكمي لتوجيه خفض الأبعاد والتجميع اللاحق (انظر الشكل التكميلي 1). وأظهر تحليل الخريطة الحرارية للجينات الواصمة ملامح نسخية متميزة كامنة في المجموعات المكانية (الشكل 2E).

لتقييم ما إذا كانت العناقيد الحسابية تتوافق مع البنية التشريحية المعروفة لنسيج القولون، تم تقييم ملفات تعبير الجينات الواسمة النموذجية الخاصة بكل طبقة. أظهرت طبقة الظهارة المخاطية تعبيراً عن واسمات الخلايا الظهارية، بما في ذلك Epcam وKrt8، إلى جانب واسم الخلايا الكأسية Muc2. بينما ميزت واسمات الخلايا الميزنشيمية والسدوية مثل Col1a1 وVim مناطق الصفيحة المخصوصة والمناطق تحت المخاطية، في حين أشارت طبقة العضلات الخاصة الخارجية من خلال جينات هيكلية للعضلات الملساء مثل Acta2 وTagln. ويدعم التقييد المكاني لهذه الواسمات المرتبطة بالسلالات الاستنتاج بأن سير عمل التكامل والعنقذة قد حافظ على التصفائح النسيجية الرئيسية لأنسجة القولون على طول المحور الممتد من المخاطية إلى العضلات (انظر الشكل التكميلي 2).

بعد التحقق من صحة العناقيد، تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي اللاحق لتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) بين الظروف التجريبية (الشكل 2F،G). علاوة على ذلك، تم تحديد الجينات المتغيرة مكانياً باستخدام إحصائية Moran's I، مما سلط الضوء على الجينات التي تظهر توزيعاً مكانياً غير عشوائي وبدلالة إحصائية عبر النسيج (الشكل 2H).

تكشف عملية فك الالتفاف الخلوي وشبكات التفاعل المكاني عن التنظيم الدقيق للأنسجة

أدت معالجة البيانات المرجعية لـ single-cell RNA-seq إلى الحصول على تعليقات توضيحية مدعومة بفلترة مراقبة الجودة (الشكل 3A)، والتجميع غير الموجه (الشكل 3B)، والتحقق من صحة الجينات العلامة (الشكل 3C)، والتوافق مع تعليقات توضيحية مستقلة (الشكل 3D). وقد وجه التركيب الخلوي (الشكل 3E) استراتيجية تقليل العينات لعملية فك الالتفاف. وقام SPOTlight بتقدير نسب أنواع الخلايا الموجهة مرجعياً عبر البقاع المكانية (الشكل 4A,B)، بينما قدم STdeconvolve رؤية قائمة على نمذجة المواضيع غير الموجهة للأنماط الخلوية المكانية (الشكل 5B). ووفرت أداة Select Spatial Spots المخصصة سياقاً نسيجياً لهذه الأنماط (الشكل 5A). وأخيراً، باستخدام تعيينات أنواع الخلايا التي تم فك التفافها، حدد تحليل التواصل المكاني تفاعلات الربيطة-المستقبل بين مجموعات أنواع الخلايا المتقاربة مكانياً (الشكل 6A,B).

ملاحظات استكشاف الأخطاء وإصلاحها من تحسين البروتوكول

خلال عملية تحسين البروتوكول، تم تحديد العديد من المشكلات التي ساهمت في وضع نقاط تفتيش عملية. فقد ظهرت نتائج غير مثالية لعملية فك الالتفاف (deconvolution) عندما كانت مراجع الخلية الواحدة غير متوافقة بشكل جيد مع سياق النسيج، مما يشير إلى ضرورة استخدام بيانات scRNA-seq متوافقة مع النسيج والنوع عند توفرها. كما أن محاولات التجميع الأولية باستخدام المعايير الافتراضية لم تنجح دائمًا في تحديد البنى البيولوجية المتوقعة؛ وقد ساعد فحص اختيار المكونات الرئيسية (PC selection)، ودقة التجميع (clustering resolution)، وتماسك الجينات المرجعية (marker gene coherence) في تحديد نطاقات قابلة للتفسير مكانيًا وتتماشى مع تشريح النسيج. وتوفر هذه الملاحظات أمثلة عملية حول كيفية تشخيص المستخدمين للمشكلات التحليلية الشائعة أثناء تنفيذ سير العمل.

مخطط سير عمل تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). العمليات: التسوية، التكامل، التجميع.
الشكل 1مخطط سير العمل للتحليل المتكامل للترانسكريبتوميات المكانية. تمثيل تخطيطي لمسار التحليل، بدءاً من اكتساب البيانات ومعالجتها الأولية وصولاً إلى التحليلات المكانية المتقدمة. وتشمل الخطوات الرئيسية ما يلي: (1) تحميل البيانات، ومراقبة الجودة، وتكامل العينات المتعددة باستخدام Seurat؛ (2) التجميع المكاني والكشف عن الجينات المتغيرة مكانياً؛ (3) فك التلافيف لأنواع الخلايا. عبر الطرق القائمة على المراجع (SPOTlight) والطرق غير الخاضعة للإشراف (STdeconvolve)؛ (4) تحليل التواصل المكاني بين الخلايا باستخدام Giotto واختيار تفاعلي للمناطق ذات الأهمية باستخدام أداة مخصصة، تحديد البقع المكانيةتُدمج النتائج المستخلصة من جميع الوحدات لاستنباط رؤى بيولوجية حول بنية الأنسجة والبيئة الخلوية الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل الترانسكريبتوميات المكانية باستخدام مخططات الكمان، وتجميع t-SNE، ومخطط البركان، وبيانات الخريطة الحرارية.
الشكل 2تكامل البيانات، والتجميع العنقودي، وتحليل التعبير التفاضلي. (أ، بمقاييس مراقبة الجودة للعينات المكانية A1 وB1، والتي توضح توزيعات أعداد الجينات، وأعداد الـ UMI، ونسب الجينات الميتوكوندرية.سيتصوير UMAP لبيانات الترانسكريبتوميات المكانية المتكاملة، ملونة حسب مصدر العينة (يساراً) وهويّة التجميع (يميناً).د(الإسقاط المكاني لهويات العناقيد على مقاطع نسيجية).هـخريطة حرارية لأبرز الجينات الواصمة لكل عنقود مكاني.فمخطط بركاني (Volcano plot) يعرض الجينات ذات التعبير التفاضلي بين الحالتين A1_colon_d0 وB1_colon_d14.ج) أنماط التعبير المكاني لجينات ممثلة ذات تعبير تفاضلي عبر مقاطع نسيجية. (هـخرائط التعبير المكاني لأبرز الجينات المتغيرة مكانياً التي تم تحديدها عن طريق إحصائية Moran's I، حيث تعرض اللوحتان اليسريان الجينات من العينة A1_colon_d0، بينما تعرض اللوحتان اليمنى الجينات من العينة B1_colon_d14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل scRNA-seq: مخططات الكمان، وتجمعات UMAP، ودرجات أنواع الخلايا، وتوزيع المخطط الشريطي.
الشكل 3: معالجة وتوصيف البيانات المرجعية للخلايا المفردة. (A) مقاييس مراقبة الجودة لبيانات scRNA-seq المرجعية قبل التصفية وبعدها. (B) تصور UMAP لبيانات scRNA-seq ملونة حسب التجمعات غير الخاضعة للإشراف. (C) مخطط نقطي يوضح درجات تعبير الجينات العلامة النموذجية لأنواع الخلايا عبر التجمعات. (D) تصور UMAP موصّف لبيانات scRNA-seq مع تسمية أنواع الخلايا الرئيسية. (E) التركيب الخلوي لمجموعة بيانات scRNA-seq المرجعية. يشير الخط الأحمر المتقطع إلى عتبة تقليل العينات (n = 50 خلية لكل نوع) المطبقة أثناء عملية فك الالتفاف باستخدام SPOTlight لتحقيق التوازن بين الكفاءة الحسابية وتمثيل أنواع الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

توزيع أنواع الخلايا، صور مجهرية؛ تحليل خلايا B، والخلايا البطانية، والأرومات الليفية في الأنسجة.
الشكل 4: فك الالتفاف المكاني للتغاير الخلوي. (A,B) مخططات scatterpie المكانية من فك الالتفاف باستخدام SPOTlight، وتوضح التركيب النسبي لأنواع الخلايا الرئيسية في كل بقعة للعينات A1 (A) و B1 (B). (C) التوزيع المكاني التمثيلي لخلايا B في العينتين A1 (يساراً) و B1 (يميناً)، مما يوضح أنماط التوطن المحددة مكانياً لمجموعة معينة من الخلايا المناعية التي تم تحديدها من خلال فك الالتفاف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل التعبير الجيني المكاني، مخطط يوضح أنواع الخلايا ومجموعات البكسل في مقطع نسيجي.
الشكل 5: تحليل تفاعلي لمنطقة الاهتمام ومقارنة لفك الالتفاف غير الخاضع للإشراف. (أ) واجهة أداة "Select Spatial Spots" المخصصة التي تظهر الاختيار التفاعلي للمناطق المقابلة للقولون الداني، والقولون القاصي، ونطاقات نسيجية أخرى. (ب>) تصور مبعثر دائري مكاني لنتائج فك الالتفاف غير الخاضع للإشراف (STdeconvolve) للعينة A1، مع تلوين البقع وفقاً للمناطق التي تم تحديدها يدوياً في (أ)، مما يوضح التطابق بين التوصيف القائم على علم الأنسجة وتوزيعات مواضيع الخلايا المستمدة حاسوبياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط للتواصل بين الخلايا يوضح التفاعلات بين الربيطة والمستقبل وقيم log2fc؛ مخطط فقاعي.
الشكل 6: شبكات التواصل بين الخلايا الموجهة مكانيًا. (A,B) شبكات تفاعل الربيطة والمستقبل المستنتجة بواسطة Giotto للعينات A1 (A) و B1 (B). تمثل العقد أنواع الخلايا، وتمثل الحواف أزواج الربيطة والمستقبل ذات الدلالة الإحصائية (FDR < 0.05)، ويتناسب سمك الحافة مع قوة التفاعل. ولضمان القابلية للمقارنة ووضوح التصوير، تم تطبيق حد دلالة موحد (FDR < 0.05) عبر جميع العينات، وعُرضت أفضل 20 تفاعلاً مرتبة حسب log2FC لكل حالة. تبرز الشبكات أنماط التواصل الخاصة بأنواع الخلايا ضمن السياق المكاني لأنسجة القولون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: التقييم الكمي لتحسين المعاملات لتقليل الأبعاد. يوضح مخطط المرفق (elbow plot) النهج البرمجي لسير العمل في الاختيار الديناميكي للعدد الأمثل من المكونات الرئيسية (PCs). ويتم حساب هذا الاختيار بناءً على الانحراف المعياري التراكمي وعتبات التباين الهامشي، والتي يمثلها الخط الرأسي الأحمر، وذلك لالتقاط التباين البيولوجي مع التخفيف من الضوضاء التقنية قبل عملية التجميع (clustering) اللاحقة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: التحقق من التجميع المكاني باستخدام علامات محددة لطبقات القولون النموذجية. (A) مخطط نقطي يوضح التعبير المخصب لعلامات الخلايا الظهارية، والسدى، والعضلات الملساء عبر المجموعات الحسابية. (B) مخططات الميزات المكانية التي تربط العلامات التمثيلية (Epcam, Col1a1, Acta2) بإحداثيات النسيج.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول سير عمل حاسوبي شامل لتحليل بيانات النسخ المكانية (spatial transcriptomics) يوازن بين العمق التحليلي وسهولة التطبيق العملية. ويوجه هذا النهج التدريجي الباحثين عبر المسار التحليلي الكامل، بدءاً من الحصول الأولي على البيانات وصولاً إلى التحليلات المكانية المتقدمة، مع التركيز على نقاط اتخاذ القرار الحرجة والعقبات المحتملة.

تتطلب عدة خطوات في البروتوكول اهتماماً خاصاً نظراً لتأثيرها على النتائج اللاحقة. يجب مواءمة عتبات مراقبة الجودة والترشيح بدقة وفقاً لأنواع الأنسجة ومنصات التقنيات المستخدمة، حيث قد يؤدي الترشيح الصارم للغاية إلى إزالة بقع ذات صلة بيولوجية، بينما قد تؤدي العتبات المتساهلة إلى إدخال ضوضاء تقنية. كما يؤثر اختيار طريقة التسوية بشكل كبير على نتائج التجميع والتعبير التفاضلي اللاحقة. على سبيل المثال، يستخدم مسار العمل SCTransform بدلاً من التسوية اللوغاريتمية القياسية لأن التقارير أشارت إلى أن SCTransform يقوم بنمذجة وتقليل التباين التقني المرتبط بعمق التسلسل والتأثيرات التقنية الأخرى في سير عمل الخلايا المفردة والتدفقات المكانية14,15. وأثناء عملية التكامل، يتطلب اختيار ميزات التكامل ومعلمات الدقة دراسة متأنية لتحقيق التوازن بين قوة التكامل والحفاظ على الإشارة البيولوجية. أما بالنسبة لتحديد الجينات المتغيرة مكانياً، فقد تم اختيار Moran's I نظراً لقابلية التوسع الحسابي وملاءمته لتحليل الارتباط الذاتي المكاني في البيانات القائمة على المصفوفات، على الرغم من إمكانية النظر في استخدام أدوات تحديد بديلة مثل SPARK اعتماداً على حجم مجموعة البيانات وأهداف الدراسة16.

يركز مكون استكشاف الأخطاء وإصلاحها في سير العمل هذا على مشكلات التوافق التشغيلي الشائعة التي تحدث عند تمرير المخرجات من حزمة برمجية إلى أخرى. وبدلاً من الاعتماد على خطوة تحويل عامة واحدة، يستخدم سير العمل عمليات تحويل تنسيقات مخصصة عند كل واجهة برمجية: حيث يتم نسخ بيانات العد المكاني في فتحة مقايسة RNA قياسية قبل التكامل باستخدام Seurat؛ وتُحول كائنات Seurat وكائنات المرجعية أحادية الخلية إلى كائنات SingleCellExperiment من أجل SPOTlight؛ ويتم إعادة تنسيق مصفوفات العد المكاني لصالح STdeconvolve؛ كما تُحول البيانات المعدودة والإحداثيات والبيانات الوصفية لأنواع الخلايا المشتقة من Seurat إلى كائن Giotto لتحليل التواصل بين الخلايا؛ وتُصدّر تعليقات منطقة الاهتمام (ROI) من Select Spatial Spots كملفات CSV تحتوي على CELL_ID وإحداثيات X/Y وتسميات المجموعات بحيث يمكن ربطها مرة أخرى بكائن Seurat. وتساعد هذه الخطوات المستخدمين على تحديد وتصحيح المشكلات الشائعة مثل فتحات المقايسة غير المتوافقة، ومعرفات البقع غير المتطابقة، وأعمدة البيانات الوصفية المفقودة، وتنسيق الإحداثيات غير الصحيح، وعدم تطابق رموز الجينات للمستقبلات والروابط.

تتمثل ميزة إضافية لسير العمل هذا في استخدام استراتيجيتين متكاملتين لفك الالتفاف (deconvolution) بدلاً من الاعتماد على خوارزمية واحدة؛ حيث يستخدم SPOTlight مراجع scRNA-seq مسبقة لتقدير نسب أنواع الخلايا بتوجيه من المرجع، بينما يتيح STdeconvolve اكتشاف موضوعات نسخية كامنة دون الحاجة إلى مرجع. وفي مجموعة البيانات التجريبية، تماشَت موضوعات STdeconvolve مع المناطق المحددة نسيجياً (الشكل 5B)، مما يدعم القابلية للتفسير البيولوجي. ولم يتم إجراء مقارنة كمية مباشرة بين الطريقتين في هذا البروتوكول؛ ويمكن للمستخدمين الراغبين في إجراء مقارنة معيارية لهما باستخدام بياناتهم الخاصة اتباع الإطار الموضح في خطوة البروتوكول 7.3.2. علاوة على ذلك، يدعم البروتوكول سهولة الاستخدام وقابلية التتبع من خلال استخدام النصوص البرمجية (scripts) للوظائف الأساسية، مع توفير واجهة رسومية (Select Spatial Spots) لعزل المناطق ذات الاهتمام (ROI) بشكل حدسي.

يتيح الربط بين Seurat وGiotto لسير العمل الجمع بين المعالجة المسبقة والتكامل المعتمدين على Seurat مع الإحصائيات المكانية وتحليل الشبكات المعتمدين على Giotto. يوفر Seurat بيئة راسخة للباحثين ذوي الخبرة في scRNA-seq ويدعم تكامل العينات المتعددة، بينما يتيح نقل البيانات المنسقة إلى Giotto بناء الشبكات المكانية وتحليل الرابط-المستقبل. يسمح هذا التصميم للمستخدمين بالاستفادة من نقاط القوة الموثقة لكلتا المنصتين دون الإشارة إلى أنه قد تم قياس أدائهما هنا مقارنة بـ Squidpy أو أطر عمل أخرى. وفيما يتعلق بالتواصل بين الخلية والخلية، تم استخدام استنتاج الرابط-المستقبل القائم على شبكة Delaunay في Giotto لأنه يدمج المجاورة المكانية ضمن نفس بيئة التحليل؛ بينما توفر أطر عمل مثل CellChat قواعد بيانات إشارات واسعة ولكنها غير مقيمة في هذا البروتوكول17.

يجب مراعاة عدة قيود. يعتمد نهج فك الالتفاف القائم على المراجع (reference-based deconvolution) بشكل أساسي على توفر مراجع عالية الجودة ومتطابقة للخلايا المفردة. علاوة على ذلك، تعتمد الافتراضات الأساسية وراء تحليل التواصل بين الخلايا على التعبير المشترك للنسخ (transcript co-expression) كبديل للتفاعل البروتيني الفيزيائي، مما يتطلب تحققاً تجريبياً لاحقاً. وأخيراً، تم تطوير سير العمل هذا بشكل أساسي حول مجموعات بيانات Visium القياسية. ومع تقدم المجال نحو تقنيات ذات دقة تقترب من دقة الخلية المفردة مثل Visium HD، ستتغير الاعتبارات التحليلية؛ حيث قد تتطلب البيانات ذات الدقة العالية معاملات معالجة مسبقة مختلفة وتقلل من الضرورة المطلقة لفك الالتفاف النقطي. ولتكييف سير العمل هذا مع مجموعات بيانات Visium HD، يمكن تجميع الصناديق (bins) عالية الدقة حسابياً إلى صناديق مكانية أكبر، أو يمكن تجاوز وحدات فك الالتفاف النقطي لصالح تقسيم الخلايا القائم على الصور18.

تشير هذه الميزات إلى إمكانية التطبيق عبر مختلف المجالات البيولوجية، بما في ذلك بيولوجيا التطور، وعلوم الأعصاب، وأبحاث السرطان، وعلم المناعة19,20,21,22. ويسمح التصميم التركيبي للباحثين بتكييف مكونات محددة وفقاً لاحتياجاتهم، سواء كان التركيز منصباً على تحديد النطاق المكاني، أو التواصل الخلوي، أو التخصص الإقليمي. ومع استمرار تطور التقنيات المكانية وتوسع مجموعات البيانات، يوفر هذا البروتوكول أساساً يمكن توسيعه لدمج طرق تحليلية جديدة ومعالجة الأسئلة البيولوجية الناشئة.

الإفصاحات

يقر المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح المالية.

شكر وتقدير

يتوجه المؤلفون بالشكر لمطوري ومسؤولي صيانة حزم Seurat وGiotto وSPOTlight على دعمهم وتوثيقاتهم. كما يقرون بامتنان مساهمات مستودعات البيانات العامة والباحثين الذين شاركوا مجموعات بياناتهم بسخاء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ggplot2Posit Software, PBCv4.0.0(CRAN)التصور المتقدم للبيانات
GiottoDries Labv4.2.2 (GitHub)تحليل الشبكات المكانية والتواصل بين الخلايا
patchwork Thomas Lin Pedersenv1.3.2 (CRAN)تكوين الرسوم البيانية وترتيبها
R software R Foundation for Statistical Computingv4.4.3بيئة التنفيذ الأساسية (macOS aarch64)
scaterDavis McCarthy et al.v1.34.1 (Bioconductor)مراقبة الجودة والتصور للخلية الواحدة
scranAaron Lun et al.v1.34.0 (Bioconductor)نمذجة التباين وكشف العلامات للخلية الواحدة
Select Spatial Spots (Custom Python Tool)LeafLightv1.0.0 (GitHub)الاختيار التفاعلي للمنطقة المكانية ذات الاهتمام (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat Satija Labv5.3.0 (CRAN)المعالجة المسبقة للبيانات المكانية ودمجها وتجميعها
SeuratObject Satija Labv5.2.0 (CRAN)هياكل البيانات لبيانات الخلية الواحدة والبيانات المكانية
SingleCellExperimentBioconductor Core Teamv1.28.1 (Bioconductor)حاوية بيانات موحدة لـ scRNA-seq
SPOTlightMarc Elosua-Bayes et al.v1.10.0 (Bioconductor)فك الالتفاف المكاني الموجه بالمرجع
StdeconvolveJean Fan Labv1.3.2 (Bioconductor)نمذجة المواضيع الكامنة غير الخاضعة للإشراف
tidyversePosit Software, PBCv2.0.0 (CRAN)مجموعة الأدوات الأساسية لمعالجة وتنسيق البيانات

المراجع

  1. Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
  2. Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
  3. Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
  4. Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933
  5. Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.
  6. Chen JG, Chávez-Fuentes JC, O’Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w
  7. Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.
  8. Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.
  9. McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.
  10. Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2
  11. Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.
  12. Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.
  13. Luecken MD, Büttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.
  14. Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.
  15. Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.
  16. Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.
  17. Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell–cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.
  18. Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell–cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.
  19. Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.
  20. Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.
  21. Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.
  22. Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Seurat SPOTlight
سير عمل عملي لتحليل بيانات النسخ المكانية: من الحصول على البيانات إلى التحليلات المتقدمة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.