Method Article

بروتوكول مبسط وقوي لعزل وتوسع الخلايا الظهارية الأولية في بطانة الرحم البشرية

DOI:

10.3791/70429

⸱

April 10th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The International Education College of Zhejiang Chinese Medical University, 2The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, 3Department of Breast Surgery, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine), 4Quzhou TCM Hospital at the Junction of Four Provinces Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University, 5Bozhou District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 6The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Shihezi University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزراعة الأولية لخلايا بطانة الرحم البشرية (HEECs) تمثل تحديا تقنيا. يجمع هذا البروتوكول بين الهضم المختلط بالإنزيمات مع مثبط ROCK (Y-27632) لتحسين بقاء الخلايا وتوسعها مع الحفاظ على هوية الظهارة، مما يوفر منصة قوية لأبحاث بطانة الرحم والتطبيقات التجديدية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأبحاث حول اضطرابات بطانة الرحم، بما في ذلك فرط تنسج بطانة الرحم المرتبطة بالتاموكسيفين، محدودة بسبب نقص نماذج الظهارة المختبرية القوية. غالبا ما تكون الطرق التقليدية لعزل خلايا بطانة الرحم البشرية (HEECs) غير فعالة، تتطلب طلبا تقنيا، وضعيفة القابلية للتوسع. هنا، يوصف بروتوكول مبسط خال من المغذيات يدمج هضم الإنزيمات المختلطة، وتحلل كريات الدم الحمراء، ومعالجة مثبط الصخور الصخرية المستدامة (Y-27632) لتمكين عزل وتوسع عالي الرطوبة الأولية بفعالية. يعد إدراج Y-27632 أمرا بالغ الأهمية للتخفيف من الموت المبرمج الناتج عن التفكك وتعزيز التصاق الخلايا في المراحل المبكرة. يدعم هذا النهج الانتقال التسلسلي مع الحفاظ على هوية الظهارة لثلاثة مقاطع على الأقل، مع الحفاظ على الشكل لما بعد 10 مرات. تؤكد التوصيفات بواسطة البلوت الغربي والفلورة المناعية تعبيرا عاليا عن سيتوكيراتين 18 وإ-كاديرين، مع انخفاض تدريجي في ملوثات الستروما الإيجابية للفيمنتين تحت ظروف الزراعة الانتقائية. من خلال معالجة القيود التقنية الرئيسية، توفر هذه الطريقة مصدرا موثوقا وقابلا للتوسع لخلايا الظهارة للدراسات الميكانيكية، ونمذجة الأمراض، وفحص الأدوية، والتطبيقات التجديدية في أبحاث بطانة الرحم. يقدم سير العمل الموحد بديلا لأنظمة الزراعة المشتركة المعقدة، مما يسهل وصولا أوسع إلى نماذج الخلايا الأولية عالية الجودة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد النماذج المخبرية الموثوقة ضرورية لتطوير دراسة اضطرابات بطانة الرحم، خاصة تلك المرتبطة بالتاموكسيفين (TAM)1. على الرغم من أن TAM يستخدم على نطاق واسع كعلاج صماء لسرطان الثدي، إلا أن نشاطه الجزئي لمنبه الإستروجين في بطانة الرحم يزيد بشكل ملحوظ من حدوث فرط تنسج بطانة الرحم، والسلائل، وفي بعض الحالات، التحول الخبيث2. تعتمد الإدارة السريرية الحالية لأمراض بطانة الرحم المرتبطة بالتاموكسيفين بشكل رئيسي على العلاج بالبروجسترون أو التدخل الجراحي، وكلاهما له قيود كبيرة. غالبا ما يرتبط علاج البروجسترون بآثار جانبية مثل النزيف الاختراق وزيادة الوزن، بينما قد تسبب الطرق الجراحية إصابة لا رجعة فيها في بطانة الرحم وتأثير الخصوبة3. تؤكد هذه القيود الحاجة إلى نماذج ظهارية قوية يمكنها دعم الدراسات الميكانيكية والمساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية محسنة. ومع ذلك، كان التقدم في هذا المجال مقيدا بشكل أساسي بسبب التحديات التقنية في الحصول على خلايا ظهارية بطانة الرحم البشرية عالية النقاء وقابلة للتوسع (HEECs).

تم الإبلاغ عن العمل التأسيسي في هذا المجال من قبل أرنولد وآخرون (2001)، الذين عزلوا مجموعات الخلايا البثوية والظهارية من خلال هضم الكولاجيناز والترشيح المغربل المتسلسل، محققين نقاء يزيد عن 98٪ كما تم تأكيده بواسطة Immunostaining4. على الرغم من نجاحها، اعتمدت الطريقة على الهضم بإنزيم واحد، وتتطلب معالجة مطولة، واعتمدت على الترشيح التدريجي لإزالة ملوثات البضاعة وكريات الدم الحمراء، مما جعل سير العمل معقدا وصعب التوحيد4. لاحقا، أسس يوكوميزو وآخرون (2002) نظام زراعة HEEC أولي من عينات استئصال الرحم باستخدام زراعة مشتركة ثلاثية الأبعاد مع خلايا تغذية للبطن5. بينما دعمت البيئة الدقيقة القائمة على المغذيات جزئيا نمو الظهارة، سمح النظام فقط بمرور محدود، عادة لا يزيد عن خمسة مرات، مما حد من فائدته في التطبيقات التي تتطلب توسعا طهاريا واسعاومستقرا 5.

لتجاوز هذه القيود، تم تطوير بروتوكول مبسط وقابل للتكرار للغاية لعزل HEEC والزراعة طويلة الأمد. استنادا إلى أعمال سابقة أظهرت أن مثبط ROCK Y-27632 يحسن بشكل ملحوظ كفاءة الزراعة الأولية لخلايا الكيراتينية البشرية، وخلايا الظهارة اللثية، وخلايا الظهارة الثديية، تم تطبيق نفس المبدأ على نسيج بطانة الرحم 6,7,8. يتضمن هذا النهج ثلاث ميزات رئيسية: الهضم بالإنزيمات المختلطة لتعزيز تفكك الأنسجة بكفاءة، وخطوة أساسية لتحليل كريات الدم الحمراء لتقليل التلوث المبكر وتسهيل التصاق الطلائي، واستمر التغذية ب Y-27632 لقمع الاستماتة المبرمجة، ودعم الالتصاق، وتعزيز القدرة على التكاثر. باستخدام هذه الاستراتيجية، يمكن توسيع HEECs على عدة مقاطع مع الحفاظ على شكل الظهارة والتعبير العالي ل CK18 و E-cadherin 9,10. ومن الجدير بالذكر أن الانتقال المتسلسل لثلاثة أجيال على الأقل لم يؤد إلى انحراف ظاهري يمكن اكتشافه، مما يدل على استقرار وقابلية التوسع لنظام الزرعة.

تعالج هذه الطريقة بشكل مباشر التحديات التقنية الطويلة الأمد في الزراعة الأولية للطاقة العالية عالية (HEEC)، بما في ذلك متطلبات عالية لإدخال الأنسجة، وسير العمل المعقد، وانخفاض قابلية التكرار، وإمكانات التوسع المحدودة. من خلال الحفاظ على هوية الظهارة والخصائص الوظيفية طوال فترة المرور، يوفر البروتوكول منصة موثوقة للبحث في تجديد بطانة الرحم، والفيزيولوجيا المرضية، والفحص الدوائي عالي الإنتاجية، والتفاعلات بين الخلايا والمواد الحيوية. من خلال دمج معالجة الأنسجة مع التوسع التسلسلي، يعالج هذا السير الموحد عنق زجاجة طويل الأمد في علم الأحياء التناسلي ويدعم التطبيقات المستقبلية في هندسة الأنسجة، والطب التجديدي، والعلاج الشخصي.

يتطلب هذا البروتوكول عينات نسيج طازجة، ويفضل أن تعالج خلال 24 ساعة من الجمع. قد تختلف خصائص إنتاج الخلايا ونموها حسب مصدر الأنسجة، مثل سلائل بطانة الرحم مقابل بطانة الرحم الطبيعية. تشمل المصادر الشائعة للفشل هضم الأنسجة غير المكتمل، أو تلوث مفرط في الكريات الحمراء، أو عدم كفاية مكملات Y-27632. على الرغم من أن النظام يدعم التوسع عبر عدة مرات، قد تكون هناك حاجة لمزيد من التحسين للحفاظ على الاستقرار الظاهري أثناء الزراعة الممتدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على عينات جديدة من أنسجة بطانة الرحم من عينات من سليلة الرحم التي تم استئصالها جراحيا من المرضى في المستشفى الأول التابع لجامعة تشجيانغ الطبية الصينية. تم إجراء جميع الإجراءات وفقا للإرشادات التي أقرها لجنة الأخلاقيات الطبية في المستشفى الأول التابع لجامعة تشجيانغ الطبية الصينية (البروتوكول رقم 2025-KLS-569-01؛ تمت الموافقة عليه في 14 سبتمبر 2025). تم التعامل مع العينات البشرية الأولية في خزانة أمان بيولوجية من الفئة الثانية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معاطف المختبر والقفازات وحماية العين. تم التعامل مع جميع المواد الكيميائية وفقا للوائح السلامة المؤسسية وإرشادات أوراق بيانات سلامة المواد (MSDS).

1. اكتساب الأنسجة

  1. جمع أنسجة بطانة الرحم الطازجة من عينات جراحية تم الحصول عليها من نساء بالغات. انقل النسيج إلى أنابيب معقمة تحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع إضافة 3٪ من البنسلين/الستربتوميسين (P/S).
    ملاحظة: يجب معالجة جميع الأنسجة خلال 24 ساعة من الجمع الجراحي.

2. معالجة الأنسجة المبدئية

  1. حرك الأنسجة في محلول الغسيل (الجدول 1) لغسلتين متتاليتين كل منهما لمدة دقيقتين لإزالة المخاط وجلطات الدم.
  2. اشطف النسيج لفترة وجيزة ب 5 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ لمدة 5 ثوان لتعقيم السطح.
  3. انقل النسيج فورا إلى محلول غسيل سعة 20 مل واغسل لمرتين، كل منهما 5 دقائق، لإزالة بقايا الإيثانول.
    ملاحظة: نظرا لأن الإيثانول قابل للاشتعال، قم بهذه الخطوة بعيدا عن اللهب المفتوح والتخلص من النفايات المحتوية على الإيثانول وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.

3. هضم الأنسجة وحصاد الخلايا

  1. تقطيع الأنسجة
    1. قم بتقطيع نسيج بطانة الرحم بشفرتين معقمين حتى يمكن شفط شظايا (~2 مم3) عبر طرف ماصة بحجم 1 مل (حوالي 10 دقائق).
    2. انقل النسيج المفروم إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل.
  2. الهضم الإنزيمي
    1. أضف 10 مل من محلول الهضم (الجدول 1) إلى الأنبوب الذي يحتوي على شظايا الأنسجة.
    2. حضن الأنبوب في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اهز الأنبوب بلطف كل 15 دقيقة لتسهيل الهضم.
    3. استمر في الحضانة حتى تصبح شظايا الأنسجة متفتخة بشكل واضح ويبدو المحلول معبرا بسبب انطلاقات الخلايا.
  3. إنهاء الهضم
    1. أضف 10 مل من المحلول المعادل لإنهاء الهضم الإنزيمي.
    2. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بالماصة صعودا وهبوطا حوالي 15 مرة باستخدام ماصة P1000 مضبوطة على 800 ميكرولتر.
  4. الترشيح والطرد المركزي
    1. قم بترشيح التعليق المهضوم عبر فلتر شبك بحجم 100 ميكرومتر.
    2. الطرد المركزي عند 156 × جرام لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
  5. تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC)
    1. استنشق السوبريتانت بعناية دون إزعاج الحبيبة.
    2. أعد تعليق حبيبة الخلية في 2 مل من محلول تحليل الخلية الكروية المبردة مسبقا.
    3. حضن على الثلج (حوالي 4 درجات مئوية) لمدة 3–5 دقائق مع تحريك لطيف.
  6. إنهاء التحلل
    1. أضف ≥10 مل من PBS أو وسط كامل لإيقاف تفاعل التحلل.
    2. الطرد المركزي عند 156 × جرام لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.

4. بدء الثقافة الأولية

  1. الغسيل والطرد المركزي
    1. استنشق السوبريتانت بعناية دون إزعاج الحبيبة.
    2. أعد تعليق الحبيبة في محلول معادلة بسعة 20 مل.
    3. اخلط بعمل الماصات حوالي 15 مرة.
    4. الطرد المركزي عند 156 × جرام لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
  2. إعادة التعليق والتلقيح
    1. استنشق السوبرناتان.
    2. أعد تعليق حبيبة الخلية بلطف في 10 مل من وسط الزراعة الأولي الذي يحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632 عن طريق التوصيل ببطء للأعلى والأسفل 8–10 مرات باستخدام ماصة 1 مل.
    3. قم بتغليف تعليق الخلية في طبق زراعة بحجم 100 مم.
      ملاحظة: للحصول على كثافة بذور أولية مثالية، اختر وعاء الزراعة وفقا لعائد الخلية المقدر. إذا كان العائد المتوقع >1 × 106 خلايا، استخدم طبقا بحجم 100 مم، وللإنتاجات الأقل استخدم طبقا بحجم 60 مم. اضبط حجم المتوسط وفقا لذلك (مثلا، 10 مل لطبق 100 مم؛ 4 مل لطبق 60 مم).
  3. ظروف الزراعة
    1. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    2. استبدل الوسط بوسط زراعة ظهارية طازج بدون Y-27632 كل 3 أيام.
      ملاحظة: مراقبة ارتباط الخلايا وشكلها؛ قم بتحديث الوسط كل يومين عندما تبدأ الخلايا في التكاثر.

5. مرور الخلايا

  1. التحضير للتريبسينية
    1. عندما تصل المزارع إلى 80٪–90٪ من التقاء الزينة، قم بإزالة طبق 100 مم من الحاضنة.
    2. تخلص من الوسط المستهلك.
    3. اشطف الخلايا مرتين ب 2 مل من PBS.
    4. قم بسحب وإزالة أي بقية من PBS بعناية.
  2. التريبسينية
    1. أضف 2 مل من التربسين 0.05٪ إلى الطبق.
    2. لف بلطف لضمان تغطية متساوية لطبقة الداخل.
    3. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    4. افحص الخلايا تحت المجهر (هدف 40x) لتأكيد الانفصال.
  3. التحييد والجمع
    1. أضف 8 مل من محلول المعادلة لإيقاف هضم التربسين.
    2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بحجم 15 مل.
    3. البيبت حوالي 15 مرة للحصول على تعليق خلية واحدة.
    4. الطرد المركزي عند 156 × جرام لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
  4. إعادة التعليق وإعادة الزرع
    1. استنشق السوبرناتانت دون إزعاج الحبيبات.
    2. أعد تعليق حبيبة الخلية بلطف في 10 مل من وسط الخلية الظهارية عن طريق التنبيه للأعلى والأسفل حوالي 10 مرات باستخدام ماصة بحجم 1 مل.
    3. زرع 1 ×10 6 خلايا في وسط خلية ظهارية بحجم 10 مل في طبق جديد بحجم 100 مم.
    4. ضبط كثافة البذور لتعزيز خلايا منفردة أو مجموعات صغيرة معزولة ومنتشرة جيدا في اليوم التالي، وتجنب الاكتظاظ.
  5. الصيانة بعد العبور
    1. حضن تحت ظروف الزراعة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون).
    2. راقب الزراعة بانتظام واستبدل وسط الخلايا الظهارية كل يومين.
      ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا جاهزة للتطبيقات اللاحقة بعد المرور الأول أو الثاني، بمجرد الحصول على طبقة أحادية صحية ملتصقة مع ≥80٪ التقاء الجسم.
      تحذير: تم التعامل مع جميع المواد التي تلامست مع الخلايا البشرية الأولية كخطر بيولوجي محتمل. قبل التخلص منها أو المعالجة الإضافية، كانت هذه المواد تعقيم باستخدام مبيض بنسبة 10٪ وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تأكيد تأسيس نظام الزراعة الأساسي HEEC بنجاح من خلال التقييمات الشكلية والتكاثرية والجزيئية، كما هو موضح في الشكل 1. من خلال دمج الهضم بالإنزيمات المختلطة، وتحلل كريات الدم الحمراء، ومثبط ROCK، مكن هذا البروتوكول من العزل الفعال والتوسع المستقر لخلايا الظهارة من أنسجة بطانة الرحم البشرية.

أظهرت الملاحظات الشكلية الدور الأساسي ل Y-27632 خلال الزراعة المبكرة. التصاق الهيئليوني العالي الذي تم زرعه ب 10 ميكرومولار Y-27632 خلال أول 4...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن إنشاء نموذج موثوق في المختبر لخلايا بطانة الرحم الظهارية البشرية (HEECs) أمر ضروري للتحقيق في بيولوجيا بطانة الرحم وعلم الأمراض11. على الرغم من تطوير عدة طرق لعزل HEEC، إلا أن معظمها لا يزال محدودا بالتعقيد التقني، والكفاءة المنخفضة، وإمكانية التمدد المحدودة 4,5. تعتمد العديد من البروتوكولات أيضا على طبقات التغذية، التي تدخل التباين وتعيق قابلية التوسع12. في هذه الدراسة،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل برنامج تشوتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2024ZD046)، ومؤسسة التعاون العلمي والتكنولوجيا في مقاطعة قويتشو ZK (2025) العام 023، وبرنامج بينغتوان للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2024ZD059؛ رقم 2026YD026).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dispase سولاربيولوجياCAS:42613-33-2بالنسبة لعزل HEECs
كولاجناز النوع الأولميركSKU:SCR103بالنسبة لعزل HEECs
100 وميكرو؛ مرشح M Meshسولاربيولوجيا431752بالنسبة لترشيح HEECs
رابيت ضد CK18أبكامab133263لتليين الأفيضة المناعية لفحص مؤشر التمايز في HEECs
رابيت أنتي CDH1أبكامAB40772لتليين الأفيضة المناعية لفحص مؤشر التمايز في HEECs
الأرنب ضد VIMأبكامab16700لتليين الأفيضة المناعية لفحص مؤشر التمايز في HEECs
4٪ بارافورمالديهيدسولاربيوP0099لتليين الأفيضة المناعية لفحص مؤشر التمايز في HEECs
حاضنة ثاني أكسيد الكربونثيرمو ساينتفيك42820906بالنسبة لحضانة الخلايا
الطرد المركزيإبندورف5404HN133048جهاز الطرد المركزي الخلوي
طبق زراعة الخلايا 100 ممكورنينغ430167لزراعة الخلايا
أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملكورنينغ430829بالنسبة للطرد المركزي الخلوي
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 ملNEST081722CK01بالنسبة لهضم الخلايا
مصفاة الخلاياسولاربيولوجيا431752ترشيح الخلايا
محلول الفوسفات المخزنتيكونو20201033محلول الغسيل
DMEMجيبكو8122622مكون وسط التحييد
البنسلين/الستربتوميسينثيرمو ساينتفيك15140-122المضادات الحيوية
مصل الأبقار الجنينيجيبكو2556132Pمكون وسط التحييد
0.05٪ تريبسينباسالميدياK431010لمقدمي HEECs  الانفصال
Y-27632سولاربيولوجياIY0040مثبط الصخور
مخزن تحلل خلايا الدم الحمراءسولاربيولوجياR1010تحلل خلايا الدم الحمراء
1٪ ترايتون X-100 ثيرمو ساينتفيكHFH10نفاذية الغشاء
الحمار ضد الأرنب IgGثيرمو ساينتفيكA32790TRالأجسام المضادة الثانوية
DAPIثيرمو ساينتفيك62248تلوين الحمض النووي
1 x PBSTسولاربيولوجياP1031مخزن الغسيل
وسيلة مخصصة للمدارس الابتدائية HEECآي سيلiCell-f004-002hلثقافة HEEC
المجهر الكونفوكالي المقلوبZeiss LSM880يستخدم لالتقاط صور التألق المناعي؛ مزود بنظام 40X
خط الخلايا MRC-5آي سيلiCell-h146 خط خلايا سرطان الغدة في بطانة الرحم البشرية؛ تم تقديم ملف STR.
خط خلايا إيشيكاواآي سيلiCell-h113 خط خلايا سرطان الغدة في بطانة الرحم البشرية؛ تم تقديم ملف STR.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gompel, A. Progesterone, progestins and the endometrium in perimenopause and in menopausal hormone therapy. Climacteric. 21 (4), 321-325 (2018).
  2. Prat, A., et al. Clinical implications of the intrinsic molecular subtypes of breast cancer. Breast. 24 (Suppl 2), S26-S35 (2015).
  3. Chen, J., Cao, D. Fertility-sparing re-treatment for endometrial cancer and atypical endometrial hyperplasia patients with progestin-resistance: A retrospective analysis of 61 cases. World J Surg Oncol. 22 (1), 169(2024).
  4. Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppälä, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: A new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
  5. Yokomizo, R., et al. Endometrial regeneration with endometrial epithelium: Homologous orchestration with endometrial stroma as a feeder. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 130(2021).
  6. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  7. Xie, Z., et al. Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using Y-27632. J Vis Exp. (177), e62978(2021).
  8. Qian, L., et al. Isolation and culture of primary human mammary epithelial cells. J Vis Exp. (207), e66638(2024).
  9. Moll, R., et al. Cytokeratins of normal epithelia and some neoplasms of the female genital tract. Lab Invest. 49 (5), 599-610 (1983).
  10. Shimoyama, Y., et al. Cadherin cell-adhesion molecules in human epithelial tissues and carcinomas. Cancer Res. 49 (8), 2128-2133 (1989).
  11. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: Evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
  12. Riaz, M. A., et al. Long-term maintenance of viable human endometrial epithelial cells to analyze estrogen and progestin effects. Cells. 13 (10), 811(2024).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zhu, Y., et al. Therapeutic effect of Y-27632 on tumorigenesis and cisplatin-induced peripheral sensory loss through rhoa-nf-κb. Mol Cancer Res. 17 (9), 1910-1919 (2019).
  15. Brosens, I., Brosens, J. J., Benagiano, G. The eutopic endometrium in endometriosis: Are the changes of clinical significance. Reprod Biomed Online. 24 (5), 496-502 (2012).
  16. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: Comparison of ficoll gradient centrifugation and red blood cell lysis buffer treatment purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  17. Tam, W. L., Weinberg, R. A. The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer. Nat Med. 19 (11), 1438-1449 (2013).
  18. Loh, C. Y., et al. The e-cadherin and n-cadherin switch in epithelial-to-mesenchymal transition: Signaling, therapeutic implications, and challenges. Cells. 8 (10), 1118(2019).
  19. Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization. J Vis Exp. (157), e60742(2020).
  20. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Eng Part C Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  21. Li, X., et al. Prolonged treatment with Y-27632 promotes the senescence of primary human dermal fibroblasts by increasing the expression of IGFBP-5 and transforming them into a caf-like phenotype. Aging. 12 (16), 16621-16646 (2020).
  22. Hu, R., Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R. Molecular mechanisms of tamoxifen-associated endometrial cancer (review). Oncol Lett. 9 (4), 1495-1501 (2015).
  23. Wu, X., et al. Conditional reprogramming: Next generation cell culture. Acta Pharm Sin B. 10 (8), 1360-1381 (2020).
  24. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endometrial Epithelial CellsCell IsolationPrimary Cell ExpansionFeeder Free CultureMixed Enzyme DigestionROCK InhibitorErythrocyte LysisSerial PassagingWestern BlotImmunofluorescence

Related Articles