مقالة منهجية

تقييم النشاط الأيضي لبطينات سمك الزرد المتجددة بالكامل خارج الجسم الحي باستخدام اختبار التدفق خارج الخلية

538 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

أبريل 17, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

في هذه المقالة

ملخص

في هذا المقال، سنصف بروتوكولا مفصلا لقياس معدل استهلاك الأكسجين ومعدل تحمض البطينات البالغة من سمك الزرد خارج الجسم لتوصيف قدرتها الأيضية التأكسدية والتحلل السكري.

الملخص

تعزى قدرة سمك الزرد على تجديد قلوبها طوال فترة البلوغ جزئيا إلى التكيفات الأيضية. على الرغم من افتراض أن قلب السمك يعتمد بشكل كبير على تحلل السكر، إلا أن الدراسات الحديثة كشفت عن ملف أيضي أكثر تعقيدا يظهر فيه الأيض التأكسدي كعنصر أساسي لإعادة تمايز خلايا عضلة القلب ونجاح تجدد القلب في المرحلة المتأخرة. في عام 2025، قمنا بتكييف طريقة عالية الإنتاجية لتقييم الملف الأيضي لبطينات سمك الزرد الكامل خارج الجسم الحي، باستخدام اختبار فرس البحر (اختبار التدفق خارج الخلية). تسمح هذه الطريقة بتقييم سريع وفي الوقت الحقيقي لمعدل استهلاك الأكسجين الأساسي وأقصى (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلوي (ECAR) باستخدام اختبار إجهاد XF Mito على محلل Seahorse XFe24. في هذا المقال، نصف بروتوكولا مفصلا لإجراء تحليل التدفق خارج الخلية على بطين سمك الزرد الكامل. القدرة على قياس السجلات الضمادية (OCR) وECAR في القلوب الحية الكاملة خارج الجسم الحي ستوفر فرصة لتوضيح الأيض القلبي في نقاط زمنية حرجة خلال التطور، وتطور المرض، والتجدد.

المقدمة

على عكس البشر، تحتفظ أسماك الزرد (Danio rerio) بقدرتها على تجديد الأنسجة القلبية المفقودة طوال حياتها البالغة1. عند الإصابة القلبية، تنفصل خلايا عضلة القلب في منطقة حدود الجرح وتعود إلى دورة الخلية 2,3 لاستعادة أعداد خلايا عضلة القلب4 وإعادة ملء الجرح. مؤخرا، تم الاعتراف بأهمية إعادة تمايز خلايا عضلة القلب في عملية التجدد5. كلا العمليتين تنظمان بدقة بواسطة التغيرات الأيضية في قلب سمك الزرد، حيث يحلل السكر الذي يدفع التكاثر 6,7 والفسفرة التأكسدية (OXPHOS) التي تعزز إعادة التمايز8. على الرغم من انتشار الطرق الدوائية والوراثية للتلاعب بالتمثيل الغذائي في مجال التجدد 6,7، إلا أن التحقق من التأثيرات الأيضية لتلك الاضطرابات لا يزال تحديا بسبب صغر حجم قلب سمك الزرد، الذي يتطلب إعدادا معقدا ومخصصا للقنونة 9,10,11 أو تجميع قلوب متعددة لتحليل الطيف الكتلي12 أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسيالنووي 8. 13.

ولتجاوز هذه القيود، وصفنا مؤخرا استخدام محلل Seahorse XFe24 للتحليل الأيضي عالي الإنتاجية لبطينات سمك الزرد الكامل خارج الجسم 8. تم تصميم اختبار التدفق خارج الخلية لقياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلوي (ECAR) للخلايا، وجزر البنكرياس، والكرات الكرويدة. يتم تحقيق ذلك من خلال حساسات الحالة الصلبة التي تكتشف التغيرات في تركيز الأكسجين والبروتون (pH) في الوسط الناتجة عن استخدام سلسلة نقل الإلكترونات التنفسية للأكسجين وإنتاج اللاكتات المعتمد على التحلل السكري على التوالي (الشكل 1A)14.

يمكن إجراء تحليل التدفق خارج الخلوي على صفيحة ذات 96 بئر (XFe96 و XF Pro)، أو ألواح صغيرة ذات 8 آبار، أو نسخ مختلفة من ألواح 24 بئر (XFe24). على الرغم من أن ألواح البئر 96 توفر إنتاجية أعلى، إلا أن مسافة العمل بين الحساس وقاع البئر غير مناسبة لاستيعاب بطين سمك الزرد كامل. بالإضافة إلى ذلك، في صيغة الصفيحة ذات 96 بئر، لا يوجد إمكانية لتثبيت البطين في أسفل البئر لمنع طفوه في الوسائط وتأثيره على الحساسات. من ناحية أخرى، صممت صفيحة التقاط جزر XFe24 في الأصل لتوصيف الأيض لجزر البنكرياس الأولية، ونتيجة لذلك تسمح بترسيب الأنسجة في قاع البئر، والتي يتم تثبيتها بعد ذلك بواسطة شبكة (شبكة). نظرا لصغر حجم قلب سمك الزرد، تمكنا من تكييف صفيحة التقاط الجزر الصغيرة لتستخدم على بطينات سمك الزرد، التي تبقى مثبتة تحت الشبكة طوال مدة الاختبار.

لتقييم القدرة التنفسية الميتوكوندرية، استخدمنا اختبار إجهاد ميتو حيث تم استخدام أربعة مثبطات لسلسلة نقل الإلكترونات وإزيزاز الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) سينثاز (الشكل 1A). أولا، يتم الحصول على قياسات الأساس لاختبار OCR (الشكل 1B، الماجنتا). ثم يحقن الأوليغوميسين، وهو مثبط V مركب. يثبط الأوليغوميسين نشاط ATP سينثاز وبالتالي يؤدي إلى انخفاض في الضبط الضوئي على الحرارة، والذي يعزى إلى إنتاج ATP (الشكل 1B، اللون الأخضر). الاستهلاك المتبقي للأكسجين هو نتيجة التنفس غير المترابط واستهلاك الأكسجين غير الميتوكوندري (الشكل 1B، البرتقالي والرمادي، على التوالي)15. بعد الأوليغوميسين، يتم حقن FCCP، مما يؤدي إلى تبديد تدرج البروتون عبر الغشاء الميتوكوندري (الشكل 1A). في محاولة لاستعادة تدرج البروتونات، ترفع الميتوكوندريا من تنظيم استهلاكها للأكسجين إلى أقصى طاقتها (الشكل 1B، الأزرق). وأخيرا، يستخدم مزيج من الروتينون ومضاد الميسين A يثبط المركبات I وIII على التوالي (الشكل 1A). يؤدي هذا المزيج الدوائي إلى توقف كامل لنشاط سلسلة نقل الإلكترونات التنفسية الميتوكوندرية بسبب نقص تدفق الإلكترونات من المجمعين I وIII إلى المجمع IV15. وهذا يسمح بقياس استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندري (الشكل 1B، رمادي).

بشكل عام، باستخدام الصفيحة الصغيرة لالتقاط الجزر مع اختبار ميتو إسترس، تمكنا من تقييم القدرة الأيضية التأكسدية والجليكوليكية لبطينات سمك الزرد بالكامل خارج الجسم الحي. نوضح البروتوكول التفصيلي لهذه العملية أدناه. وأخيرا، نظهر بقاء البطينات المعزولة من النوع البري غير مصابة خارج الجسم في محلل التدفق خارج الخلية، ونتحقق من اختبار إجهاد الميتو على بطينات سمك الزرد المعدلة وراثيا بعد 14 يوما من الإصابة بالتبريد (DPCI)8.

البروتوكول

جميع الإجراءات الموضحة أدناه المتعلقة بالحيوانات تم تنفيذها وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات لعام 1986 في المملكة المتحدة والتوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي في أوروبا، وقد تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المركزية لرعاية الحيوانات والمراجعة الأخلاقية في جامعة أكسفورد.

ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام محلل Seahorse XFe24 ووسط Seahorse DMEM بدون الفينول الأحمر والبيكربونات.

1. إصابة القلب بالتبريد في سمك الزرد (اختياري)

  1. احصل على الموافقة الأخلاقية المناسبة من المؤسسة المحلية والسلطات الوطنية قبل بدء التجربة.
  2. إجراء الإصابة بالتجميد على قلوب أسماك الزرد كما هو موصوف سابقا 16,17,18.

2. ترطيب خرطوشة الحساس

  1. افتح مجموعة اختبار التدفق خارج الخلوي وحمل لوحة المرافق ذات 24 بئر (الشكل 2A) عن طريق توصيل 500 ميكرولتر من محلول المعايرة لكل بئر.
  2. أغلق لوحة المرافق باستخدام خرطوشة المستشعر ومعزز الهيدروليكو (الشكل 2A).
  3. حضن الخرطوشة ولوحة الأدوات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية طوال الليل (18–72 ساعة). حافظ على الغطاء على خرطوشة المستشعر طوال فترة الحضانة.

3. تحضير حلول الأدوية ووسائل الإعلام

  1. صنع محاليل جاهزة للأدوية: إذابة الأوليغوميسين في ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO) إلى تركيز 10 ملليمو، وسيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) في DMSO إلى تركيز 5 ملليمو، والروتينون في DMSO إلى تركيز 10 ملليمولار، ومضاد المايسين A في الإيثانول إلى تركيز 10 ملليمو، وتخزينه في -20 درجة مئوية إذا لم يستخدم فورا.
    ملاحظة: يوصى بتحضير حلول أوليغومايسين وروتينون ومضاد المايسين الطازجة كل 2-3 أشهر، وحل FCCP في كل مرة قبل إجراء الاختبار.
  2. تحضير تركيز المحلول العامل للأدوية (500 ميكرومولار أوليغوميسين، 300 ميكرومولار FCCP، 450 ميكرومولار لكل مزيج روتينون/أنتيميسين A) عن طريق تخفيف المحلول المخزن في وسط DMEM. تأكد من أن الحجم النهائي للتركيزات العاملة هو 1.5 مل للأوليغوميسين، 1.65 مل ل FCCP، و1.8 مل للروتينون/أنتيميسين A، مما يسمح بتحميل 30 منفذا (24 منفذا لكل مثبط في الخرطوشة بالإضافة إلى 6 منافذ إضافية لكل دواء لتصحيح أخطاء الترمي).
    ملاحظة: سيظهر بعض الترسيبات في الروتينون/الأنتيميسين A، ولكن بعد الخلط الجيد سيتم تقليل ذلك. لاحظ أن التركيزات المذكورة في 3.2 هي 10 أضعاف التركيز النهائي للأدوية عند حقنها في الآبار.
  3. جهز وسط DMEM (درجة الحموضة 7.4) ليحتوي على 10 ملليمولار جلوكوز، 1 ملليمولار بيروفات، و2 ملليمولار جلوتامين، وخزنها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. تشغيل محلل التدفق خارج الخلوي

  1. شغل المحلل من الزر الجانبي طوال الليل قبل الاختبار للسماح بتوازن درجة الحرارة مع البيئة.
  2. شغل الكمبيوتر وافتح برنامج Wave.
  3. اختر اختبار الضغط في ميتو على البرنامج.
  4. قم بإيقاف تشغيل المدفأة في الزاوية السفلية اليسرى من البرنامج بحيث تنخفض درجة حرارة المحلل إلى أقل من 37 درجة مئوية وتصل إلى 28–29 درجة مئوية لتقترب من درجة الحرارة القياسية لتربية أسماك الزرد19.
  5. حدد استراتيجية الحقن في صفحة تعريفات المجموعة (تحت تبويب استراتيجيات الحقن ) بإضافة المركبات التي سيتم ترسيبها في كل منفذ من كتالوج المركبات. لاختبار ميتو إكسرس، أضف أوليغوميسين في المنفذ A، وFCCP في المنفذ B، وروتينون/أنتي ميسين في المنفذ C. هناك قدرة على إضافة دواء آخر في المنفذ D، وهو غير مستخدم في هذا البروتوكول.
  6. احذف جميع الاستراتيجيات المصممة مسبقا الأخرى الموجودة تحت تبويب استراتيجيات الحقن بمجرد تعريف الاستراتيجية التجريبية. حدد المجموعات التجريبية (مثل النوع البري والطفرة) على جانب المجموعات من الصفحة، وحدد استراتيجية الحقن التي سيحصلون عليها (المعرفة في الخطوة 4.5). تأكد من تطابق استراتيجيات الحقن بين المجموعات وكذلك مع استراتيجية الحقن المصممة.
  7. في صفحة خريطة اللوحة ، حدد موقع كل عينة على لوحة ال 24 بئرا بالنقر على كل مجموعة ثم النقر على الآبار التي ستحتوي على العينات.
    1. لاحظ أن أربعة من الآبار غير مناسبة لترسيب العينات (الشكل 2B) وتستخدم كفراغات ستستخدم لتصحيح الخلفية. تأكد من توزيع العينات في كل مجموعة بشكل متساو عبر اللوحة لتسوية الانحياز المحتمل في المواقع في القياسات أو الظروف البيئية.
  8. في صفحة البروتوكول ، قم بإزالة علامة التحكم أو التجربة إذا لم يتم استخدام مثبط إضافي غير المذكور أعلاه، وتأكد من تطابق منافذ البرمجيات مع مواقع الأدوية على الخرطوشة.
  9. يقوم البرنامج بتعيين 3 دورات من الخلط والانتظار والقياس تلقائيا لكل حالة. عدل عدد الدورات إلى 10 قياسات أساسية (غير معالجة)، 3 أوليغوميسين، 7 جرعات FCCP، و9 قياسات روتينون/أنتيميسين A للسماح بوجود آثار مستقرة وللمثبطات لتؤثر على الأنسجة ثلاثية الأبعاد. تأكد من أن كل دورة تتكون من خلط لمدة 3 دقائق، وانتظار لمدة دقيقتين، و3 دقائق قياس.

5. معايرة المحلل

  1. إزالة الخرطوشة ولوحة الأدوات من الحاضنة المرطبة (انظر الخطوات 2.1–2.3).
  2. قم بإزالة معزز الهيدروجين والغطاء (الشكل 2A) من الخرطوشة وضع خرطوشة المستشعر على لوحة المرافق التي تحتوي على المعايرة.
  3. قم بعمل الماصبات بلطف في منافذ الماصي الخاصة بها مع لمس جدار المنفذ الجانبي بطرف الماصة، لضمان تدفق سلس للسائل: 50 ميكرولتر من الأوليغوميسين في المنفذ A، 55 ميكرولتر من FCCP في المنفذ B، و60 ميكرولتر من روتينون/أنتيميسين A في المنفذ C (الشكل 2C).
    1. لاحظ أن السائل يثبت في مكانه فقط بواسطة التوتر السطحي عند فتحة المنفذ، لذا تجنب التوصيل المفاجئ أو لصق الخرطوشة من هذه الخطوة فصاعدا. تأكد من عدم دخول أي سائل إلى منفذ المستشعر (الشكل 2C) لأن ذلك قد يتلف المحلل.
  4. انقر على بدء التشغيل في البرنامج، ثم سم الجولة، واحفظها على الكمبيوتر. في هذه المرحلة، يفتح صينية المحلل لوضع الخرطوشة ولوحة الأدوات.
  5. ضع الخرطوشة المحملة بالأدوية ولوحة الأدوات التي تحتوي على المعايرة على صينية المحلل وفقا لخريطة اللوحة على الصينية (بئر A1 في أعلى اليسار) وتأكد من التركيب الصحيح. قم بإزالة معزز الصنبور والغطاء (الشكل 2A) من اللوحة قبل تحميلها على الصينية. عدم القيام بذلك سيتلف المحلل.
  6. بمجرد أن تكون جاهزا، أمر البرنامج ببدء الاختبار بالضغط على تشغيل الاختبار. في هذه المرحلة، يقوم المحلل بأخذ الصينية المحملة وبدء المعايرة.
  7. ابدأ عزل القلب (انظر الخطوات 6.1–6.12). تستمر المعايرة حوالي 40 دقيقة، لكن يمكن الاحتفاظ باللوحة في المحلل طالما استغرقها عزل القلوب ووضعها في لوحة التقاط الجزر الصغيرة (الشكل 2B,D).

6. عزل قلوب الأسماك وتحميلها على صفيحة الجزيرة ذات 24 بئر

  1. افتح لوحة التقاط الجزر الدقيقة وحمل لوح الجزر المكون من 24 بئر ب 500 ميكرولتر من DMEM (10 ملليمولار جلوكوز، 1 ملليمول بيروفات، 2 ملليمولار جلوتامين) في درجة حرارة الغرفة.
  2. ضع جميع الشبكات في طبق بتري بحجم 35 مم يحتوي على وسائط DMEM في درجة حرارة الغرفة، لضمان غمرها بالكامل وخلوها من الفقاعات الكبيرة.
  3. جهز طبق بتري إضافي بحجم 35 مم يحتوي على DMEM (10 ملليموتر جلوكوز، 1 ملليمولار بيروفات، 2 ملليمولار جلوتامين) في درجة حرارة الغرفة. هذا سيؤدي إلى شطف القلوب عند الجمع وتشريح البطين من الأذينين والانتفاخ الشرياني.
  4. قم بإزالة سمكة واحدة في 5 جم/لتر MS-222 وتحقق من عدم وجود ردود فعل.
  5. ضع السمكة على إسفنجة مثبتة على طبق بيتري بقطر 92 مم، وافتح تجويف قلبها، وقم بتشريح القلب كما هو موضحسابقا 16,20.
  6. اشطف القلوب في طبق بيتري بحجم 35 مم الذي يحتوي على DMEM (10 ملليموتر جلوكوز، 1 ملليمولار بيروفات، 2 ملليمولار جلوتامين) في درجة حرارة الغرفة.
  7. أزل الأذين والانتفاخ الشريان باستخدام الملقط في طبق بتري بقطر 35 مم.
  8. اهز البطين بلطف واعصره حتى يخرج الدم من التلوث. لا تتلف جدار البطين عند غسل القلب.
  9. انقل القلب إلى بئره المخصص على صفيحة التقاط الجزر الصغيرة ودعه يغوص إلى مركز البئر المناسب وفقا لخريطة الصفيحة. حافظ على الطبق في درجة حرارة الغرفة. أدرج جميع البطينات في الاختبار، حتى لو توقفت عن الخفقان بشكل واضح.
  10. كرر العملية لجميع الأسماك المتاحة. عند مقارنة النشاط الأيضي لمجموعات تجريبية مختلفة، نقترح عزل قلب واحد لكل مجموعة بدلا من كل قلوب من مجموعة قبل الانتقال إلى المجموعة التالية. على الرغم من أن القلوب يمكن أن تبقى على قيد الحياة لمدة لا تقل عن 180 دقيقة في المحلل (الشكل 3A)، نقترح أن يحدث العزل قلبا واحدا لكل مجموعة كأفضل ممارسة لضمان توزيع الوقت المتساوي في الوسط بين المجموعات.
  11. بعد عزل جميع القلوب (حوالي 60 دقيقة للوحة تحتوي على 20 قلبا)، ضعها في قاع آبار الصفائح الصغيرة لالتقاط الجزر (الشكل 2B)، وضعها في مركز البئر باستخدام ملقط رقيق (الشكل 2D,E).
  12. استخدم ملقطا لتغطيتها بالشبكة (حوالي 20 دقيقة) (الشكل 2D). تأكد من أن الشبكة في الاتجاه الصحيح (شبكة تواجه القلب) ولا تحتوي على فقاعات كبيرة، لأن ذلك قد يتداخل مع القياسات (الشكل 2E).
    1. بمجرد أن تكون الشبكة في موضعها، استخدم الملقط لدفعها من الحواف حتى يسمع صوت طقطقة خفيفة. تأكد من عدم اصطدام القلب بالملقط عبر الشبكة.

7. تحميل العينات على المحلل وجمع القياسات

  1. بمجرد أن يتم إحاطة القلوب في لوحة التقاط الجزر الصغيرة، تحقق من البرنامج أن جميع الآبار قد تم معايرتها بنجاح، كما هو موضح بعلامات العلامة الخضراء على شاشة الكمبيوتر. الآن قم بإخراج لوحة الأدوات بالضغط على فتح الصينية.
    ملاحظة: لن يتم إخراج الخرطوشة في هذه المرحلة، ولن يظهر سوى لوحة الأدوات التي تحتوي على المعايرة.
  2. قم باستبدال لوحة الأدوات بلوحة صغيرة تحتوي على العينات على صينية المحلل. تأكد من أن صفيحة الجزيرة الصغيرة موضوعة بشكل صحيح (A1 في الزاوية العلوية اليسرى) وأن الغطاء قد أزيل. عدم إزالة الغطاء سيتلف المحلل.
  3. بمجرد وضع صفيحة الجزيرة، أمر البرنامج ببدء التجربة بالضغط على لوحة خلية الحمل. خلال حوالي أول 10 دقائق، تقوم أجهزة الاستشعار بخطوة التوازن، ثم تبدأ القياسات.
  4. بعد الانتهاء من التجربة (حوالي 4 ساعات)، اضغط على خرطوشة القذف لفتح الصينية وطرد الصفيحة الصغيرة والخرطوشة.
  5. أزل الميكرولوح الصغير والخرطوشة، واضغط على القرص حتى يغلق الصينية. في هذه المرحلة، اضغط عرض النتائج لرؤية البيانات المجمعة.
  6. حفظ القياسات، وتصديرها من جهاز المحلل، ورفعها على واجهة التحليلات لمزيد من التحليل والمعالجة. سيؤدي ذلك إلى استئصال لوحة الجزيرة والخرطوشة من المحلل.
  7. قم بإزالة لوحة الجزيرة والخرطوشة من المحلل وأغلق الخرطوشة باستخدام الغطاء.
  8. قم بتجميد صفيحة الجزيرة الصغيرة على الثلج الجاف أو إزالة القلوب من الآبار (انظر الخطوة 8.2) وتخزينها عند -20 درجة مئوية إذا لم يتم عزل البروتين للتطبيع (الخطوة 8) فورا.
  9. بمجرد حفظ البيانات، قم بإيقاف تشغيل البرنامج والمحلل والكمبيوتر.
  10. قم بتحميل البيانات على واجهة التحليلات وعرضها باختيار رسم OCR من خيار العروض القياسية . على الواجهة، عرض البيانات كمستوى أو معدل OCR وECAR، وصحح الخلفية بناء على الآبار الفارغة، واختر الآبار للتصور بالنقر على خريطة اللوحة لجعلها تظهر أو تختفي.

8. عزل البروتين وقياسه من أجل التطبيع

  1. تحضير اختبار اختبار التقرب المناعي المشع (RIPA) المحتوي على مثبط البروتياز، عن طريق إذابة قرص واحد من مثبط البروتيازات في 10 مل من مخزن RIPA والخلط جيدا.
  2. إذا لم يتم ذلك بالفعل (الخطوة 7.8)، باستخدام أداة إدخال شاشة التقاط الجزر (الشكل 2F)، قم بإزالة الشبكات من لوحة الجزر لتحرير القلوب. أزل القلوب بحذر، فقد تكون عالقة على الشبكة. إذا كان هذا هو الحال، استخدم الملقط لتحريرها. إذا لم يكن بالإمكان إزالة الشبكة باستخدام أداة إدخال الشاشة، حرك اللوح تحت جهاز الستيريوسكوب وباستخدام مقص التشريح الدقيق اقطع الشبكة بعناية لتحرير القلب.
  3. ضع كل بطين في أنبوب بحجم 1.5 مل يحتوي على 200 ميكرولتر من مخزن RIPA الغني بمثبط بروتياز على الثلج.
  4. توحيد القلب باستخدام أداة تجانس مع مدقات قابلة للتخلص من الثلج.
  5. إعداد المعايير عن طريق تخفيف ألبومين المصل البقري (BSA) المقدم في مخزن RIPA بتركيزات كالتالي: 2000 ميكروغرام/مل، 1500 ميكروغرام/مل، 1000 ميكروغرام/مل، 750 ميكروغرام/مل، 500 ميكروغرام/مل، 250 ميكروغرام/مل، 125 ميكروغرام/مل، 25 ميكروغرام/مل، 0 ميكروغرام/مل.
  6. جهز محلول بيرس BCA العامل (50:1، الكواشف A: الكواشف B، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة). احسب حجم المادة العامل المطلوب باستخدام الصيغة التالية:
    (عدد المعايير + عدد العينات) × 2 × 200 ميكرولتر
    ملاحظة: يسمح هذا الحجم باستخدام 200 ميكرولتر من محلول العمل لكل عينة ومعيار، ويسمح بالحصول على قياسات مكررة لكل عينة ومعيار.
  7. في صفيحة بسعة 96 بئر، أضف 25 ميكرولتر من كل معيار وكل عينة لكل بئر في نسخ مكررة.
  8. أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل لكل بئر.
  9. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. اترك الطبق ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ثم أغلقها باستخدام مادة ختم للصحن. تأكد من عدم وجود فقاعات في الآبار، لأن ذلك قد يعيق قارئ اللوحة. إذا تكونت عدد محدود من الفقاعات، استخدم طرفا أو ملقطا رفيعا لتفجيرها.
  11. قس الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام قارئ اللوحات.
  12. توليد منحنى معياري بناء على امتصاص المعايير وحساب تركيز البروتين في العينات.
  13. سجل تركيز البروتين في تبويب التطبيع (الشكل 2G) لواجهة التحليلات لكل بئر.

9. تحليل البيانات

  1. بعد التطبيع مقابل محتوى البروتين، قم بتصدير البيانات من واجهة التحليلات كملفات Excel أو Prism لمزيد من التحليل باستخدام زر السحابة في الزاوية العلوية اليمنى من الرسم البياني.
  2. باستخدام البيانات المطبلة، احسب معدل الضبط الضوئي (OCR) وECAR الأساسي كمتوسط قياسات القاعدة الأساسية، مع استثناء الثلاثة القياسات الأولى، حيث قد تكون الإشارة غير مستقرة عند القياسات الأولى.
  3. باستخدام البيانات المطبعة، لتحديد أقصى OCR وECAR، يتم حساب متوسط قياسات أفضل ثلاث عمليات اقتناص لمعالجة FCCP.

النتائج

يتيح هذا البروتوكول قياس كمية الضبط البصري وECAR لبطينات سمك الزرد الكاملة. قمنا بالتحقق من بقاء البطينين في بيئة خارج الجسم الحي من خلال حضانة بطينات KCL البرية غير المصابة في المحلل في غياب أي علاج دوائي (الشكل 3A). تشير البيانات إلى أن البطينين لهما معدل OCR وECAR مستقرين، وهما مرتفعان بشكل ملحوظ عن قياسات الأساس للآبار الفارغة لمدة لا تقل عن 180 دقيقة (الشكل 3A). تشير هذه البيانات إلى أن البطينين يظهران وظيفة تنفسية طبيعية وبقاء طبيعيين في هذا الوضع خارج الجسم الحي .

قمنا بعدة قياسات للOCR باستخدام تركيزات أدوية وتركيبات وسائط مختلفة لتحديد الجرعة المثلى للبطينين (الشكل 3B). لاحظنا زيادة طفيفة في تغير طيات OCR (FCCP/قاعدي) عند استخدام تركيبات [أوليغومايسين] 10 ميكرومول، [FCCP] 8 ميكرومول، و[روتينون/أنتيمايسين] 25 ميكرومولار، وزيادة أكبر قليلا في [أوليغومايسين] 50 ميكرومولار، [FCCP] 30 ميكرومولار، و[روتينون/أنتيميسين] 45 ميكرومولار (الشكل 3B). وبناء عليه، تابعنا التركيزات الأخيرة لتجاربنا. وبما أن البطين ذو بنية ثلاثية الأبعاد، فمن الممكن أن تؤثر الأدوية بقوة على الخلايا الخارجية للأنسجة دون أن تصل إلى الخلايا في الجانب الضوئي من البطين. لمعالجة ذلك، قمنا بخطوة نفاذية حيث عالجنا القلوب بالسابونين بنسبة 0.5٪ لمدة 30 دقيقة قبل الحضانة في DMEM (10 ملليمولار جالاكتوز، 1 ملم بيروفات، 4 ملليمولار جلوتامين). أدى ذلك إلى انخفاض مستمر في الضبط الضوئي الجاكوز وغياب الزيادة المتوقعة بعد حقن FCCP (الشكل 3C)، مما يشير إلى أن القلوب كانت تفشل أيضيا. وبالتالي، لم نقم بنفخ البطينات في تجاربنا.

علاوة على ذلك، نقدم هنا الآثار التطبيعة من تجربتناالأصلية 8. وباستخدام التفاوت الطبيعي في القدرة التجديدية لسبع سلالات من أسماك الزرد البرية، حددنا أن mdh1ab، وهو المالات السيتوسولية ديهيدروجيناز 1Ab، له تأثير مفيد على التجدد من خلال إعادة تمايز خلايا عضلة القلب. للتحقق من صحة هذا الاكتشاف، قمنا بإنتاج سمك زرد معدلة وراثيا يفرط في التعبير عن mdh1ab بطريقة خاصة بخلايا عضلة القلب (mdh1ab cOE) وأسماك تتحكم في التعبير الزائد عن بروتين فلوري أخضر (GFP cOE). قمنا بإصابات بطينيهم بالتجميد، وجمعناها عند 14 dpci، وحققنا في عملية الأيض باستخدام اختبار إجهاد ميتو (الشكل 3D). لم يغير علاج الأوليجومايسين بشكل كبير معدل الضبط الضوئي الضوئي (OCR)، رغم أن هناك زيادة طفيفة في ECAR. أدى حقن FCCP في الوسائط إلى زيادة متوقعة في OCR وECAR مع الحفاظ على عينات mdh1ab cOE الأعلى (الشكل 3D). وأخيرا، أدى روتينون/أنتي ميسين إلى توقف كامل للأيض في كلا المجموعتين. بشكل عام، سمحت لنا هذه الطريقة بتحديد فروق كبيرة في القدرة الأيضية لبطينات mdh1ab التي تفرط في التعبير وبين سبع سلالات مختلفة من سمك الزرد البري8.

figure-results-1
الشكل 1: استقلابية الجلوكوز أثناء اختبار إجهاد الميتو. (أ) تمثيل تخطيطي لاستقلاب الجلوكوز. يدخل الجلوكوز الخلية عبر ناقلات GLUT ويتحول إلى بيروفات من خلال تحلل السكر. يحول إنزيم اللاكتات ديهيدروجيناز (LDH) البيروفات إلى لاكتات، ويتم إفراز البروتونات الناتجة من الخلية. يتحول البيروفات إلى أسيتيل-CoA ويدخل دورة الميتوكوندريا وTCA لتغذية سلسلة نقل الإلكترونات التنفسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. يتم ملاحظة مثبطات المجمعات I وIII وV، بالإضافة إلى مفكك FCCP، باللون الأحمر. الإلكترونات التي تنتقل عبر سلسلة نقل الإلكترونات التنفسية ترمز إليها بأسهم زرقاء، والتي تؤدي في النهاية إلى تحويل الأكسجين والبروتونات إلى ماء. (ب) مخطط نتائج اختبار الإجهاد في ميتو. يلاحظ التنفس القاعدي باللون الأرجواني. عند حقن الأوليغوميسين، ينخفض معدل الضبط الحراري (OCR)، مما يسمح بحساب التنفس المرتبط ب ATP (الأخضر) وكذلك تسرب البروتون (البرتقالي). يزيد FCCP من الضبط الضوئي إلى أقصى قدرة تنفسية للخلايا (الأزرق). حقن روتينون ومضاد الميسين A يؤديان إلى توقف التنفس الميتوكوندري ولا يسمحان إلا بحدوث التنفس غير الميتوكوندري (الرمادي). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: خرطوشة المستشعر وتخطيط لوحة الميكرولوح لالتقاط الجزيرة. (أ) صورة لخرطوشة الغطاء-المستشعر-مجمع التعزيز الهيدرو-لوحة المرافق (الأعلى) وخرطوشة المستشعر المقلوبة (الأسفل). سكلايبار: 1 سم. (B) صورة لميكرولوح صغير لالتقاط جزيرة محملة بطينات سمك الزرد. تشير الدوائر الحمراء إلى الآبار الفارغة التي لا تحتوي على البطينات وستعمل كتصحيح خلفية أثناء التحليل. شريط التدريج: 1 سم. (C) تمثيل تخطيطي لتخطيط المنافذ في خرطوشة مستشعر XFe24. يحتوي المنفذ A على أوليغوميسين، وB يحتوي على FCCP، وC يحتوي على مزيج روتينون/أنتي مايسين. يمكن ترك المنفذ D فارغا، أو يمكن إضافة دواء إضافي. S تشير إلى منفذ المستشعر، والذي لا ينبغي أن يحتوي على أي سائل حتى لا يتلف المحلل. (د) صورة تمثيلية لبطين سمك الزرد في قاع البئر، محاط بالشبكة (على اليسار) وبدون شبكة (يمين). شريط القياس: 5 ملم. (E) مقطع عرضي تخطيطي للوحة التقاط الجزيرة الصغيرة التي تحتوي على بطين، والشبكة (أصفر)، وخرطوشة المستشعر (باللون الأخضر). P تشير إلى المنافذ وS هي المستشعر. الخط المتموج يمثل الوسيط. (و) أداة إدخال شاشة التقاط الجزر الصغيرة. شريط التوسع: 1 سم. (G) أيقونة تبويب التطبيع على واجهة التحليلات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: قياسات OCR وECAR التمثيلية لبطين سمك الزرد. (أ) آثار OCR وECAR ممثلة لبطينات سمك الزرد البرية غير المصابة (سلالة KCL) التي لم تعالج بالمثبطات المستخدمة في الاختبار (n = 2، خط أحمر). الآثار الناتجة عن آبار فارغة لا تحتوي على أي مادة بيولوجية تعرض باللون الرمادي (n = 4)؛ OCR، مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA، عامل الزمن P = 0.0200، الوقت × تفاعل البئر P = 0.0196، عامل البئر P < 0.0001، عامل المجموعة P < 0.0001؛ قياسات ECAR المتكررة ذات الاتجاهين ANOVA، عامل الزمن P = 0.1323، تفاعل البئر × الزمن P = 0.0216، عامل البئر P = 0.0009، عامل المجموعة P<0.0001؛ تم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. (B) تغير طية OCR على تركيزات الأدوية المختلفة والوسائط المستخدمة. تحليل النوفاع أحادي الاتجاه (P = 0.0032) مع اختبار المقارنات المتعددة لتوكي. [O] 5 ميكرومولار، [F] 4 ميكرومولار، [RA] 2 ميكرومولار، n = 6; [O] 10 ميكرومولار، [F] 8 ميكرومولار، [RA] 25 ميكرومولار، n = 8; [O] 25 ميكرومولار، [F] 16 ميكرومولار، [RA] 45 ميكرومولار، n = 8; [O] 50 ميكرومولار، [F] 30 ميكرومولار، [RA] 45 ميكرومولار، n = 8; [O] 100 ميكرومولار، [F] 60 ميكرومولار، [RA] 90 ميكرومولار، n = 8. O، أوليغوميسين؛ F، FCCP؛ روماتويد، روتينون/أنتيمايسين. (ج) أثر البطينات المنفذة للسابونين (أحمر، n = 4) مقارنة بالبطينات غير المعالجة (رمادي، n = 4); مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA، عامل الزمن P < 0.0001، الوقت × تفاعل العينة P < 0.0001، عامل العلاج P < 0.0001، عامل العينة P = 0.824؛ تم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM.الحد الأقصى لمعدل OCR للبطينات المعالجة بالسابونين مقارنة بالبطينات غير المعالجة؛ اختبار t للطالب غير المقترن (P = 0.0850). (D) آثار OCR وECAR التمثيلية من بطينات mdh1ab cOE (أحمر، n = 8) و بطينات GFP cOE (رمادي، n = 8) بحجم 14 ديكل مكعب. OCR، القياسات المتكررة ذات الاتجاهين ANOVA، عامل الزمن P < 0.0001، الوقت × تفاعل العينة P < 0.0001، عامل النمط الجيني P < 0.0001، عامل العينة P = 0.1098؛ ECAR، القياسات المتكررة ذات الاتجاهين ANOVA عامل زمني P < 0.0001، الوقت × تفاعل العينة P = 0.7507، عامل العينة P = 0.2154، عامل النمط الجيني P < 0.0001. البيانات مقتبسة من Lekkos وآخرين، 20258 وعرضت كمتوسط ± SEM. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

هنا، نصف بالتفصيل بروتوكول تحليل الضبط الضوئي (OCR) وECAR لبطينات سمك الزرد خارج الجسم الحي باستخدام محلل Seahorse XFe24 واختبار إجهاد ميتو. يلعب أيض خلايا القلب دورا أساسيا في تجديد القلب 21,22,23,24. ومع ذلك، كان التحقق من النمط الأيضي لقلب سمك الزرد المتجدد تحديا وغالبا ما يفتقر إلى المنشورات6،7. نظرا لصغر حجم قلب سمك الزرد، تتطلب تقنيات مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي أو مطيافية الكتلة تجميع عدة بطينات للحصول على إشارة كافية 8,12,13. على النقيض من ذلك، تسمح الطريقة التي نصفها هنا بالحصول على قياسات OCR وECAR من عدة بطينات فردية، مما يزيد من القوة الإحصائية.

توفر طرق التحليل الأيضي الكلاسيكية، مثل علم الأيض، لمحة عن الملف الأيضي للنسيج في لحظة جمعه. من خلال اختبار ميتو الإجهاد تمكنا من جمع بيانات حية في الوقت الحقيقي حول كيفية تكيف البطينات مع تحديات الأيض المختلفة، بما في ذلك أقصى قدرة تنفسية لديها، وهو أمر غير واضح عند استخدام منهجيات أخرى. لتحقيق النمط الظاهري الحي لبطين سمك الزرد، تم محاولة تروية قلب سمك الزرد 9,10,11. يتطلب ذلك معدات مخصصة معقدة وفنيين ماهرين لتحقيق الكانوليشن مع الحفاظ على طريقة منخفضة الإنتاجية. يوفر المحلل بديلا أبسط باستخدام جهاز متوفر تجاريا لتنمذة البطينات عالية الإنتاجية (20 بطينا في كل مرة). حسب علمنا، لم تكن هناك مقارنة مباشرة بين الطريقة الموصوفة في هذه الورقة وتقنيات التأكسد الحية الأخرى، مثل قطب كلارك.

والأهم من ذلك، أن الطريقة التي نصفها قابلة للتكيف حسب سؤال البحث. وقد استخدم هذا الاختبار سابقا لتوصيف أجنة سمك الزرد الكامل 25,26. بالإضافة إلى اختبار الضغط لميتو الموضح هنا، تم تحسين اختبار ميتو فيول فليكس لتقييم استهلاك الوقود الأيضي لشرائح القلبالبشرية. علاوة على ذلك، تم تعديل اختبار النمط الظاهري للطاقة الخلوية لتوصيف القدرة الجليكوليتية لتجديد قلوب أستياناكس المكسيكية 28. نتوقع أن يستخدم هذا البروتوكول في هياكل ثلاثية الأبعاد أخرى مثل الأعضاء القلبية، وسيكون مفيدا في التحقق من صحة الاضطراب الجيني في المسارات الأيضية في قلوب أسماك الزرد غير المصابة.

ندرك أن لهذه التقنية بعض القيود. من حيث التحديات التقنية، عند العزل، تم التعامل مع القلوب في وسط DMEM عند درجة حرارة الغرفة ولم يحافظ على درجة حرارة 28 درجة مئوية، وهي درجة الحرارة المثلى لسمك الزرد19. خفض درجة حرارة الماء إلى 18 درجة مئوية يمكن أن يؤثر بشكل كبير على وظيفة قلب سمك الزرد في الموقع29,30. ومع ذلك، لا نتوقع أن يكون للتعرض قصير الأمد لدرجة حرارة الغرفة تأثير كبير على فسيولوجيا البطينات المعزولة، حيث تعود البطينات بسرعة إلى محلل 28 درجة مئوية. في أيدينا، توقفت غالبية البطينات عن الخفقان بشكل واضح عند تشريح الأذين، مما يشير إلى غياب منبه منظم ضربات القلب كسبب لعدم الانقباض. علاوة على ذلك، خلال فترة العزل، لم يتم أكسجة الوسط، مما قد يؤدي إلى نقص أكسجة خفيف، والذي يعود إلى مستويات الأكسجين الطبيعية بعد خلط المحلل قبل القياس الأول.

اعتبار عملي إضافي يتعلق بدرجة حرارة القلوب يتعلق أيضا بإيقاف تشغيل السخان في المحلل، مما يؤدي إلى انخفاض درجة الحرارة من 37 درجة مئوية إلى 28–29 درجة مئوية. المحلل لا يسمح بتقليل طاقة السخان إلى درجة الحرارة المطلوبة. ومع ذلك، عندما يعمل المحلل، تكون درجة الحرارة داخل الصينية أعلى ب 6–7 درجات مئوية من درجة حرارة الغرفة. يتزامن هذا النطاق في درجات الحرارة مع درجة حرارة تربية أسماك الحمارالزرد المثلى 19.

يتم إجراء هذا الاختبار على بطينات سمك الزرد الضخم. وبالتالي، من المستحيل التمييز بين مساهمات أنواع الخلايا الفردية في التغيرات التي لوحظت في OCR وECAR. قد يكون هذا ذا أهمية كبيرة عند دراسة معدلات الأيض في نقاط التجدد المبكرة عندما قد يخفي التدفق العالي لخلايا المناعة31 تغيرات التصوير الضوئي الواضح في خلايا عضلة القلب. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤثر الدم المتبقي في التجويف البطيني على قراءات الأيض. السماح للقلوب بالنزيف في وجود الهيبارين7 قد يقلل أكثر من تأثير تجلط خلايا الدم في القلب. علاوة على ذلك، لتعزيز انتشار المثبطات المستخدمة نحو الخلايا الداخلية للبطين، حاولنا خطوة نفاذية باستخدام السابونين. أدى نفاذ السابونين إلى انخفاض مستمر في الأشعة الضوئية الحرارية طوال الاختبار، مما أدى إلى فشل البطينين في التنفس. يمكن تجنب هذه القيود من خلال عزل وزراعة وتحليل خلايا عضلة القلب المعزولة، رغم أن هذا النهج يتطلب زراعة الخلايا32 لفترة طويلة، وهو ما قد لا يكون مثاليا في بيئة تجديدية.

قد يؤثر النسيج المصاب على طريقة التطبيع المستخدمة. في هذه الدراسة، نقوم بتطبيع الضبط الضوئي الضوئي (OCR) بواسطة ميكروجرام بروتين لكل مل باستخدام اختبار BCA. على الرغم من أن اختبار BCA لا يتفاعل بقوة مع بروتينات الكولاجين بسبب تركيبها الغني بالهيدروكسي برولين والبرولين، والتي لا يتم اكتشافها بشكل جيد باستخدام كوبر، إلا أن وجود مكونات جرح أخرى خالية من الخلايا قد يؤثر على عملية التطبيع. قد تنظر الدراسات المستقبلية في استخدام الحمض النوويالكلي 33 كعكس دقيق للخلايا الحية في البطين.

علاوة على ذلك، لم نتمكن من إعادة إنتاج الانخفاض المتوقع في الضبط الضوئي الضوئي الناتجة عن تثبيط المعتمد على الأوليغوميسين لمركب V15. على الرغم من أن بعض الدراسات تظهر انخفاضا في الضبط الضوئي الزائد من الحساسية الضوئية من خلال علاج الأوليغوميسين لخلايا عضلة القلب المعزولة32,34,35، إلا أن البيانات هنا تشبه عدم الاستجابة التي أبلغت عنها دراسة حديثة على خلايا عضلة عضلة الفئران البالغة المعزولة36. نظرا لأن تركيز الأوليغوميسين الذي نستخدمه أعلى بكثير من الذي تم الإبلاغ عنه في الدراسات المذكورة أعلاه، فمن غير الواضح ما إذا كان رفع التركيز النهائي إلى أكثر من 50 ميكرومولار سيكون له تأثير.

وأخيرا، على الرغم من أن استهلاك الأكسجين يعتمد بشكل أساسي على التنفس، إلا أن تحمض خارج الخلية لا ينتج حصريا عن اللاكتات الناتجة عن التحلل الجليكوليكي، بل أيضا من خلال تحويل ثاني أكسيد الكربون إلى حمض الكربونيك. وقد أبلغ أن ثلث التحمض خارج الخلايا في الخلايا المغذى على الجلوكوز ينتج عن ثاني أكسيد الكربون في الظروف الأساسية37. وبالتالي، ننصح بالحذر عند تفسير قياسات ECAR الناتجة عن محلل Seahorse إذا لم يتم إجراء تصحيح لنسبة التحمض المدفوع بالتنفس38.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لنيك هاو (شركة أجيلينت تكنولوجيز) وتوماس نيكول (جامعة أكسفورد) على دعمهم والنقاش النقدي خلال تطوير هذه الطريقة. نود أن نشكر موظفي منشأتنا الحيوانية في المستوى الأول (جامعة أكسفورد، وحدة الخدمات الطبية الحيوية) وفي معهد الطب التنموي والتجديدي (جامعة أكسفورد) على رعايتهم ونقل سمك الزرد. وقد حظي هذا العمل بدعم من مجلس البحوث الطبية (MR/W006731/1 إلى KL)، ومستشفى الملك فيصل المتخصص ومركز البحوث (زمالة ما بعد الدكتوراه في RA)، وصندوق الدعم الاستراتيجي المؤسسي لويلكم (204826/Z/16/Z إلى JSOM)، ومؤسسة القلب البريطانية IBSRF (FS//17/58/33072 إلى LCH)، والمجلس الأوروبي للبحوث (ERC) ضمن برنامج الاتحاد الأوروبي Horizon 2020 للبحث والابتكار (715895). CAVEHEART، ERC-2016-STG إلى MTMM)، منح مشاريع مؤسسة القلب البريطانية (PG/15/111/31939 وPG/23/11189 إلى MTMM)، وMTMM تعترف بالدعم من مركز التميز البحثي BHF في أكسفورد، جامعة أكسفورد (RE/24/130024) ومركز الطب التجديدي BHF (RM/13/3/30159).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب إيبندورف 1.5 مل;ستارلابS1615-5550
لوحة ب 96 بئرا  ثيرموفيشرAB-0800
أنتيميسين أChemCruz SC-202467A
DMEM mediumأجيلينت1035755-100
DMSOسيغما-ألدريتش D2650-100 مل
الثلج الجاف  
الإيثانولسوبيلكو1.00983.2500
مجموعة اختبار التدفق خارج الخلوي أجيلينت103518-100تحتوي الحزمة على لوحة أدوات، ومعزز كهائي، وخرطوشة حساس، وغطاء (يأتي مع صفائح الجزر الصغيرة)
FCCPسيغما-ألدريتش C2920
الجلوكوزأجيلينت103577-100
الجلوتامينأجيلينت103579-100
الحاضنة
الصفيحة الصغيرة لالتقاط الجزرأجيلينت101122-10025 شبكة مدرجة في المجموعة
أداة شاشة التقاط الجزيرةأجيلينت101135-100
ملقط القطع الدقيقideal-tek3131760حجم 5-S (سيكون مطلوبا 2x لعزل البطين عن الشريان المنتفخ والأذين)
مقص التشريح الدقيقFST15009-08
MS-222سيغما-ألدريتش E10521
أوليغوميسينMP 151786
Pestle mottor homogeniser VWR431-0100
المدقاتVWR431-0094
طبق بتري 35 ممغرينر بيو-ون627102
بيتري ديش 92 ممستارستيدت82.1473
مجموعة اختبار بيرس BCAثيرمو ساينتفيك23227
أقراص صغيرة مثبطات البروتياز والفوسفاتاز من بيرس، خالية من EDTAثيرمو ساينتفيكA32961
بيروفاتأجيلينت103578-100
مخزن تحليل RIPAسانتا كروسSC-364162
روتينونيMP 02150154-CF
طور التداخل بين حلوى سيهورس أناليكس أجيلينتأجيلينتhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
محلل Seahorse XFe24أجيلينتhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
الختمثيرمو ساينتفيكAB-0558
نجم سبيكترو نانوإم جي لاب تك GmbH601-0298
إسفنجةقم بعمل شق طويل وعميق بما يكفي ليتناسب مع الجانب البطني للأعلى
الموجة (الإصدار 2.6.1.56)أجيلينتhttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF calibrent أجيلينت100840-000

المراجع

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Seahorse
تقييم النشاط الأيضي لبطينات سمك الزرد المتجددة بالكامل خارج الجسم الحي باستخدام اختبار التدفق خارج الخلية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.