التحقق من صحة التكامل العشوائي للجينات المنقولة والتعبير في طفيليات إيميريا

Summary

هنا، نقدم طريقة موحدة للتحقق من صحة دمج وتعبير الجينات الأجنبية في طفيليات إيميريا المعدلة وراثيا. من خلال دمج التحليلات الجينومية ومستوى البروتين، يؤكد هذا السير استقرار إدخال وتعبير الجينات. يسهل هذا النهج تطوير إيميريا المعدلة وراثيا للبحث وتطبيقات اللقاحات.

Abstract

التحقق من صحة طفيليات إيميريا المعدلة وراثيا ضروري لتأكيد التكامل الجينومي المستقر والتعبير عن الجينات الخارجية. يصف هذا البروتوكول سير عمل شامل للتحقق من إدخال الجينات المعدلة والتعبير عن البروتين في إيميريا تينيلا. يبدأ الإجراء باستخراج الحمض النووي الجيني من الكيسات المبيضة المكشوفة، يليه تضخيم PCR للتحقق الأولي من وجود الشظية المستهدفة. لتأكيد التكامل الجينومي بشكل أكبر، يتم إجراء إعادة تسلسل الجينوم الكامل لتحديد مواقع الإدخال وتقييم استقرار البنية المتكاملة في جينوم الطفيلي. يتم فحص تعبير البروتين لاحقا بواسطة الطلاء الغربي للليزات المحضرة من سبوروزويتا منقاة، مما يمكن من اكتشاف البروتين المؤتلف المستهدف. بالإضافة إلى ذلك، يتم رؤية التموقع داخل الخلايا من خلال اختبار التألق المناعي غير المباشر (IFA) باستخدام خلايا المضيف المصابة. معا، توفر هذه الاختبارات إطارا قويا وقابلا للتكرار للتحقق من صحة خطوط إيميريا المعدلة وراثيا. يتيح هذا السير تأكيدا موثوقا للتكامل الجينومي والتعبير عن البروتينات، مما يدعم التطبيقات اللاحقة في التلاعب الجيني، وعلم الجينوم الوظيفي، وتطوير اللقاحات التي تستهدف طفيليات إيميريا .

Introduction

يمثل التهاب الكوكسيديزيس، الناتج عن أنواع إيميريا، أحد أكثر الأمراض الطفيلية أهمية اقتصادية في الدواجن، مما يؤدي إلى انخفاض زيادة الوزن، وسوء تحويل الأعلاف، وخسائر مالية عالمية تقدر بمليارات الدولارات سنويا ^1,2,3. أصبح التلاعب الجيني بطفيليات إيميريا أداة قوية لكل من البحث الأساسي وتطوير اللقاحات ^4,5,6. يمكن النقل المستقر من دمج وتعبير الجينات الخارجية مثل المبلغين الفلوريين أو المستضدات الواقية، مما يسمح برؤية تطور الطفيليات في الوقت الحقيقي والتقييم المستهدف لمرشحي اللقاح ^7,8,9.

نشر سابق لدوان وآخرون قدم بروتوكولا موحدا لتكوين النوى والتكاثر في الجسم الحي لإيميريا المعدلة وراثيا، مما أسس طريقة فعالة لتوليد وإثراء خطوط الطفيليات المؤتلفة¹⁰. ومع ذلك، لا يوجد حاليا سير عمل موحد لتأكيد التكامل الجينومي المستقر والتعبير الوظيفي للجينات المحولة. يعد هذا التحقق ضروريا لضمان أصالة واستقرار وقابلية تكرار الخطوط المعدلة وراثيا المستخدمة في الدراسات البيولوجية اللاحقة أو تطبيقات اللقاحات.

تقدم هذه المقالة بروتوكولا كاملا خطوة بخطوة للتحقق من صحة تكامل وتعبير الجينات المنقولة في إيميريا تينيلا، باستخدام خط E. tenella المعدلة وراثيا تعبر عن فيروس مرض الجبس المعدي (IBDV) VP2 (Et-VP2) كنموذج¹¹. تم نقل البلازميد p5′AMic2linkerVP2m3′A، الحامل لجين VP2 ومراسل mCherry، إلى E . tenella sporozoites البرية (Et-WT). تم عزل الكيسات الفلورية الحمراء بواسطة فرز الخلايا النشطة بالفلورة (FACS) ونقلها تسلسليا في الدجاج الخالي من الكوسيديا. يوضح هذا السير إجراءات لاستخراج الحمض النووي الجيني، والتحليل الأولي المعتمد على PCR، وإعادة تسلسل الجينوم الكامل لتحديد مواقع الإدخال، واختبار Western blotting للتحقق من تعبير البروتين، واختبار التألق المناعي غير المباشر (IFA) لرؤية التموقع داخل الخلايا للبروتين المؤتلف. معا، توفر هذه الطرق إطارا شاملا وقابلا للتكرار لتأكيد أصالة خطوط إيميريا المعدلة وراثيا، مما يمكن من استخدامها بشكل موثوق في أبحاث الجينوم الوظيفي وتطوير اللقاحات.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية التي شملت الدجاج من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة الصين الزراعية (رقم الموافقة: CAU20160628-2). تم إجراء جميع إجراءات التربية والتجارب وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة الصين الزراعية، وامتثلت للمبادئ التوجيهية الدولية للأبحاث الطبية الحيوية التي تشمل الحيوانات. تم استخدام دجاج وايت ليغورن ذكور الخالي من مسببات الأمراض الخاصة (SPF) عمره سبعة أيام في هذه الدراسة. تم الحفاظ على الطيور تحت ظروف تربية قياسية مع وصول مجاني إلى العلف والماء طوال فترة التجارب. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. استخراج الحمض النووي الجيني من بويضات أبواغية من أنواع إيميريا.

1. انقل 1 مل من تعليق البويض (≥1 × 10⁷/مل) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 مل. أضف نفس الحجم من خرز زجاجي بحجم 1 مم يتوافق مع حبيبات البويض. قم بتعطيل الكيسات باستخدام أداة تجانس الأنسجة عن طريق ضرب الخرز بقوة على 60 هرتز لمدة 5 دقائق حتى تنكسر جدران البويضة تماما وتخرج محتوياتها.
2. اجمع الخليط (باستثناء الخرزات الزجاجية) في أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي بقوة 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة. تخلص من السوبرناتان، أضف 500 ميكرولتر من مخزن CTAB و40 ميكرولتر من بروتيناز K، وحضن الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. أضف 500 ميكرولتر فينول: كلوروفورم: كحول إيزوأميل (25:24:1)، دوامة لمدة 10 ثوان، وجهاز طرد مركزي عند 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق. انقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد.
   ملاحظة: أغلق الأنبوب الذي يحتوي على الطبقة العضوية بإحكام وتخلص منه لمنع تلوث البيئة. (اختياري) إذا ظل تلوث البروتين مرتفعا، كرر الخطوة 1.3 1–2 مرات إضافية.
4. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم: كحول إيزوأميل (24:1)، دوامة لمدة 10 ثوان، وطرد مركزي عند 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق. انقل الطور المائي إلى أنبوب جديد وأضف حجما متساويا من الأيزوبروبانول. اخلط بالعكس حتى تظهر ترسبات الحمض النووي.
   ملاحظة: الهطول عند −20 درجة مئوية لمدة ≥ساعة أو طوال الليل يعزز الإنتاجية.
5. الطرد المركزي بقوة 12,000 x g لمدة 10 دقائق لاستخراج الحمض النووي للحبيبات. اغسل الحبيبة بنسبة 70٪ إيثانول، واستخدم الطرد المركزي بقوة 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتانت. قم بإزالة السائل المتبقي بعناية باستخدام مضخة تفريغ وجفف الحبيبة بالهواء عند درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية.
6. إذابة الحبيبات المجففة للحمض النووي في مخزن ddH₂O أو TE يحتوي على RNase. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة ≥1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل لإزالة الحمض النووي الريبي المتبقي. خزن الحمض النووي المنقى عند −20 درجة مئوية.
   ملاحظة: للحفاظ على المدى الطويل، يمكن تخزين حبيبات الحمض النووي غير المذابة مباشرة عند −20 درجة مئوية أو −80 درجة مئوية. تقييم سلامة وتركيز الحمض النووي بواسطة الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز قبل التطبيقات اللاحقة.

2. التحقق من PCR لوجود تركيب Et-VP2 في جينوم الطفيلي

1. تصميم أزواج البرايمر (الجدول 1) للتحقق من التكامل الجينومي لبناء Et-VP2.
   ملاحظة: تم تصميم تسلسلات البرايمر باستخدام Primer-BLAST، مع معلمات نموذجية تتراوح بين طول البرايمر 18–24 بوتس في الطلق، ودرجة انصهار تقارب 55–60 درجة مئوية، وتكوين هيكل ثانوي أدنى. تم فحص خصوصية كل زوج تمهيد بشكل إضافي مقابل جينوم إيميريا تينيلا لتجنب التضخيم غير النوعي.
2. تحضير خليط تفاعل بسعة 50 ميكرولتر يحتوي على 25 ميكرولتر من 2× خليط تاك ماستر، و21 ميكرولتر ddH₂O، و1 ميكرولتر لكل من الطبقة الأولية الأمامية والعكسية، و2 ميكرولتر من قالب DNA.
3. قم بالتضخيم باستخدام ظروف الدورة الحرارية التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 30 دورة بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ تليها تمديد أخير عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: تأكد من خلط جميع المواد الكيميائية جيدا قبل التدوير الحراري. استخدم قوالب DNA معدة حديثا لتحقيق كفاءة تضخيم مثالية.

3. إعادة تسلسل خط الطفيلي المعدل وراثيا (Et-VP2)

1. نموذج تقديم وبناء المكتبة
   1. قدم تعليق أوكيست بحجم 1 مل (≥1 ×^{10 7}/مل) إلى مزود خدمة تسلسل تجاري لتحليل إعادة التسلسل من الجيل القادم.
   2. بعد تقييم جودة الحمض النووي الجيني، قم بتفكيك الحمض النووي عن طريق تعطيل ميكانيكي باستخدام الموجات فوق الصوتية. تنقية الحمض النووي المجزأ، وإجراء إصلاح الطرف، وإضافة قاعدة أدينين (A) إلى الأطراف 3 أقدام (3')، وربطت محولات التسلسل.
   3. اختر شظايا الحمض النووي بالحجم المطلوب باستخدام الرحلان الكهربائي من جل الأغاروز وإجراء تضخيم PCR لبناء مكتبة التسلسل.
   4. إخضاع المكتبة المبنية لفحص الجودة. قم بتنفيذ تسلسل النهاية المزدوجة على منصة Illumina NovaSeq باستخدام طول قراءة 150 بيشن. حافظ على عمق تسلسل 100× لضمان دقة البيانات، وتوليد ما لا يقل عن 6 جيجابايت من البيانات الخام مع درجة جودة دنيا Q20 >90٪.
      ملاحظة: التعامل مع جميع المواد الكيميائية وعينات الحمض النووي باستخدام تقنيات المعقمة لمنع التلوث. تحقق من أن معايير التسلسل تلبي معايير العمق والجودة المطلوبة قبل الانتقال إلى تحليل البيانات.
2. تحليل البيانات
   1. تصفية بيانات التسلسل الخام باستخدام برنامج Fastp (v0.23.2) وفقا للمعيار^{التالي 12}:
      1. أزل تسلسلات المحولات.
      2. اضبط عتبة الجودة المنخفضة على Q20 وقم بإزالة القراءات التي تمثل فيها قواعد منخفضة الجودة أكثر من 30٪ من إجمالي طول القراءة.
      3. قم بإزالة القراءات التي تقل عن 50 نقطة حمل.
   2. محاذاة القراءات المحكومة بالجودة مع الجينوم المرجعي ل E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) باستخدام برنامج Bowtie2 (v2.4.5)¹³. يتم تقييم عشوائية بيانات التسلسل من الجيل التالي بناء على عمق التغطية والتجانس.
   3. تأكد من محاذاة قراءات التسلسل مع تسلسل المتجهات المعدل. قم بإزالة القراءات التي لا تحدد منطقة T-DNA للحصول على قراءات كيميرية، حيث يربط أحد الطرفين بالحمض النووي التسلسلي والآخر إلى الجينوم المرجعي ل E. tenella .
   4. استنادا إلى تسلسلات قراءات الكيميرية، قم بإجراء محاذاة باستخدام ToxoDB (الإصدار 64) لتحديد الموقع المحدد لمواقع إدخال T-DNA المحتملة. تحليل عمق التسلسل عبر المناطق المتماثلة بين الناقل وجينوم إيميريا (أي المناطق التنظيمية 5′ و3′) باستخدام برنامج Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. تحديد مواقع التكامل المحتملة للبلازميد المعدل وراثيا داخل جينوم E. tenella والتحقق منها بواسطة PCR باستخدام نظام التفاعل الموضح في الخطوة 2.1.
      ملاحظة: تأكد من الاستخدام المتسق لإصدارات البرمجيات وإعدادات المعلمات طوال التحليل للحفاظ على دقة البيانات وقابليتها للتكرار.

4. التلوين الغربي لبروتينات إيميريا المعدلة وراثيا

1. اجمع نظام تعليق PBS يحتوي على ما لا يقل عن 5 × 10 أو⁶ سبوروزويتس في أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 2500 × جرام لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبة في محلول تحلل RIPA بسعة 100 ميكرولتر وحضانة الجليد لمدة ساعة واحدة. أضف 20 ميكرولتر من محلول تحميل البروتين 6× وسخن الخليط على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. حضر جل SDS-PAGE باستخدام صفيحة زجاجية بحجم 1.5 مم. اضبط تركيز الأكريلاميد وفقا للوزن الجزيئي للبروتين المستهدف. أثناء البلمرة، ضع جل الفصل بالماء المقطر على الجل الفاصل لضمان سطح مستو قبل إضافة جل التكديس.
3. قم بطرد المركزي بقياس 10,000 × جرام لمدة 5 دقائق وتحميل 40 ميكرولتر من المادة الفائقة في كل مسار عينات. قم بتحميل 10 ميكرولتر من مؤشر البروتين في مسار منفصل، واملأ أي ممرات متبقية ب 40 ميكرولتر من مخزن تحميل 1× كأدوات تحكم.
4. قم بالرحلان الكهربائي في 1× مع تشغيل المخزن عند 70 فولت لمدة 20 دقيقة، تليها 120 فولت لمدة 60–90 دقيقة، حتى يصل مقدمة الصبغة إلى أسفل الجلام.
5. قم بإزالة الجل حسب حجم البروتين المتوقع. قم بتفعيل غشاء PVDF في الميثانول لمدة دقيقة واحدة وقم بتجميع ساندويتش النقل بالترتيب التالي: إسفنجة، ورق ترشيح، جل (جانب الكاثود)، غشاء PVDF، ورق فلتر، إسفنجة. أزل أي فقاعات هواء، وانقل البروتينات عند 70 فولت لمدة 3 ساعات في مخزن النقل.
6. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBST (5 دقائق لكل مرة) وقم بحجبه بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء مرتين باستخدام PBST لإزالة محلول الانسداد المتبقي.
7. حضانة الغشاء بالأجسام المضادة الأولية المخففة في مخزن الأجسام المضادة: فأر متعدد النسيلة مضاد (1:2000) ومضاد GAPDH وحيد النسيلة للفأر (1:2000). حضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف. اجمع محلول الأجسام المضادة واغسل الغشاء خمس مرات باستخدام PBST (5 دقائق لكل مرة).
8. حضن الغشاء باستخدام IgG مضاد للفئران المتعامل مع HRP (1:2000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغشاء خمس مرات باستخدام PBST (5 دقائق لكل مرة).
9. تحضير ركيزة ECL عن طريق خلط أحجام متساوية من المحلول A و B. تطبيق الركيزة بشكل متساو على الغشاء واكتشاف إشارات البروتين باستخدام نظام تصوير كيميائي للتوليخ.
   ملاحظة: قم بجميع الخطوات التي تتضمن عينات بروتين على الثلج ما لم يذكر خلاف ذلك. تعامل مع الميثانول وركائز ECL في غطاء بخار أثناء ارتداء قفازات ونظارات واقية.

5. اختبار التألق المناعي غير المباشر داخل الخلية (IFA) لاختبار الإيميريا المعدلة وراثيا

1. تنقية الأبوروزويتس باستخدام عمود الكروماتوغرافيا
   1. قم بتوصيل عمود الكروماتوغرافيا بمضخة التبريستالية وضبط معدل التدفق إلى 50–60 هرتز. اغسل العمود بالماء المقطر ومحلول الجليسين.
   2. أضف تعليق السليلوز DE-52 إلى العمود مع إضافة محلول الجليسين باستمرار حتى يصل طبقة السليلوز إلى ارتفاع يقارب 1 سم.
   3. تحميل السبوروزويتس المنقي بطريقة بيركول على العمود. حافظ على معدل تدفق بين 30–40 هرتز باستخدام محلول الجليسين وجمع تدفق التدفق في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل.
   4. راقب الشفافية عن طريق وضع قطرات على شريحة زجاجية للمراقبة المجهرية. عندما لا يتم اكتشاف سبوروزويت، أوقف المضخة. قم بطرد الكتلة المجمعة عند 2500 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتان، وأعد تعليق الحبيبة في PBS.
      ملاحظة: قم بجميع الخطوات في ظروف معقمة لمنع التلوث الميكروبي. التخلص من نفايات الجليسين وبيركول وفقا للوائح السلامة الحيوية المؤسسية.
2. عدوى سبوروزويت لخلايا HFF
   1. زرع البذور 1 ×^{10 6} سبوروزويتا في صفائح بطول 24 بئرا تحتوي على طبقات أحادية لخلايا HFF. أضف البنسلين-ستربتوميسين إلى تركيز نهائي 1× (100 U/mL بنسلين و100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين)، ثم اخلط برفق، وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 4–6 ساعات للسماح بالتغلغل. أزل الوسيط، واغسله مرة واحدة ب 1 مل من PBS، وتخلص من السوبرناتانت.
   2. قم بإزالة أغطية الزجاج بعناية من الآبار باستخدام ملقط معقم وانقلها إلى صفيحة جديدة تضم 24 بئرا. ثبت العينات في 1 مل من بارافورمالديهايد 4٪ لمدة 30 دقيقة، ثم اغسله مرة واحدة ب 1 مل PBS، ثم تخلص من السوبرناتانت.
   3. قم بنفخ الخلايا ب 1 مل من 0.25٪ ترايتون X-100 لمدة 30 دقيقة. اغسله مرة واحدة ب 1 مل PBS وتخلص من السوبرناتانت.
   4. قم بحجب العينات ب 1 مل من 3٪ BSA لمدة 30 دقيقة. اغسله مرة واحدة ب 1 مل PBS وتخلص من السوبرناتانت.
   5. الأجسام المضادة المضادة وحيدة النسيلة المخففة للفأر (1:200) في 3٪ من BSA. ضع قطرات من الجسم المضاد المخفف على طبقة الإغلاق واقلب الغطاء (جانب الخلية للأسفل) على القطرات. حضن الغطاء في غرفة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسله ثلاث مرات بسعة 1 مل من PBS (كل واحدة 5 دقائق).
   6. مخفف مضاد للفئران IgG (1:200) و33258 (1:100) بمقدار 3٪ BSA. ضع قطرات خليط التلوين على فيلم الختم واقلب الغطاء على القطرات. الحضانة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة، ثم اغسله خمس مرات بسعة 1 مل PBS (كل منها 5 دقائق).
   7. قم بتركيب الغطاء بوضع وسط تثبيت مضاد للتدرج بسعة 5 ميكرولتر على شريحة زجاجية. اقلب غطاء الغطاء (جانب الخلية للأسفل) على القطرة، متجنبا فقاعات الهواء، وأغلق الحواف. تخزين الشرائح المثبتة في غرفة رطبة عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.
      ملاحظة: استخدم البارافورمالديهايد وترايتون X-100 في غطاء بخار كيميائي أثناء ارتداء قفازات وحماية للعين. تم سرد صيغ الكواشف المستخدمة في هذا الإجراء في الجدول 2.

Results

أكد تحليل PCR الجيني وجود الشظية المستهدفة في الطفيليات المعدلة وراثيا، بينما لم يتم اكتشاف أي نطاقات مماثلة في الضابط من النوع البري (الشكل 1A). أظهرت إعادة تسلسل الجينوم الكامل أيضا أن البلازميد الخطي تم دمجه بشكل مستقر في جينوم الطفيلي، وتم التحقق من صحة موقع التكامل المتوقع بواسطة تضخيم PCR عبر منطقة التوصيل (الشكل 1B).

تم التحقق من تعبير البروتين بواسطة البلوت الغربي، الذي كشف عن شريط مميز يتوافق...

Discussion

يؤسس هذا البروتوكول سير عمل شامل للتحقق من صحة التكامل الجيني، والتعبير عن البروتينات، وتحديد الموقع داخل الخلايا للجينات الخارجية في الإشريكية الوراثية المعدلة وراثيا. بدلا من الاعتماد على اختبار واحد، يجمع هذا النهج بين الأدلة الجينومية والبروتينية، مما يضمن تأكيد إدخال الجينات المعدلة بنيويا ووظيفيا.

تؤثر عدة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول بشكل كبير على التحقق الناجح من الخطوط المعدلة وراثيا. قد تظهر مشاكل تقنية إذا لم يتم تحسين هذه الخطوات بعناية. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
وسيط تركيب مضاد التدرج	MCE	HYK1042	وسط تثبيت فلوري لمنع التبييض الضوئي
BSA (3٪)	بيوتايم	ST023	حاجز العزل ومخزن تخفيف الأجسام المضادة لعلاج IFA؛ اترك الكتلة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة
الكلوروفورم: كحول الأيزوأميل (24:1)	سيغما	C0549	كاشف لإزالة الفينول المتبقي أثناء استخراج الحمض النووي الجيني
الدجاج الخالي من الكوكسيديا	بويرينغر-إنغلهايم	SPF	يستخدم للمرور في الجسم الحي وتضخيم السلالات المعدلة وراثيا؛ تمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات (رقم الموافقة: CAU20160628-2)
CTAB (بروميد سيتيل تريميثيل أمونيوم)	ميرك KGaA	H5882	مكون من مخزن استخراج الحمض النووي الجينومي؛ التركيبة: 3 جرام CTAB + 12.27 جرام NaCl + 15 مل 1 مول/لتر Tris-HCl + 6 مل 0.5 مول/لتر EDTA، معدلة لحجم نهائي 150 مل مع ddH2O
DE-52 سليلوز	سولاربيولوجيا	C8350	وسط كروماتوغرافيا تبادل الأيونات لتنقية السبوروزويت؛ تمت معالجتها بشكل متسلسل ب NaOH، وHCl، والماء المقطر، ثم توازنه مع محلول الجليسين
ركيزة ECL (المحلول A + المحلول B)	ترموفيشر	32106	مادة كشف الكشف الكيميائي المضيئة؛ امزج أحجام متساوية من الحل A و B قبل الاستخدام
IgG مضاد للفأر من الماعز المرافقة بتقنية FITC	سيغما	AP124F	الأجسام المضادة الثانوية الفلورية ل IFA، نسبة التخفيف 1:200
خرز الزجاج	سيغما	Z250473-1PAK
محلول الجلايسين	سيغما	67419	التوازن ومخزن التسرب لأعمدة الكروماتوغرافيا؛ التركيبة: 0.75 جرام جلايسين + 7.9 جرام NaCl مذاب في 500 مل ماء مقطر، تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4-7.6، معقم
هوشت 33258	سيغما	94403	مادة تلوين نووي، نسبة التخفيف 1:100؛ يستخدم في تحديد الموقع IFA
معالج IgG مضاد للفأر من نوع HRP	سيغما	12-349	الأجسام المضادة الثانوية لمنطقة ويسترن بلوتينغ، نسبة التخفيف 1:2000
منصة التسلسل Illumina NovaSeq	شركة بيرسونال بيو للتكنولوجيا المحدودة (شنغهاي، الصين)		منصة التسلسل من الجيل القادم؛ تسلسل النهاية المزدوجة (طول قراءة 150 بت بايت)، عمق التسلسل 100 مرات؛ توليد &ge؛ بيانات خام بحجم 6 جيجابايت (Q20>90٪)
جهاز الطرد المركزي منخفض السرعة	جهاز الطرد المركزي في عهد بكين	DT5-2
الجسم المضاد للعلم أحادي النسيلة في الفأر	سيغما	F1804	الأجسام المضادة الأولية، نسبة التخفيف 1:200؛ يستخدم للكشف عن IFA لبروتين الاندماج الموسوم بعلم
الأجسام المضادة المضادة لGAPDH أحادية النسيلة للفأر	سيغما	G8795	الأجسام المضادة الأولية، نسبة التخفيف 1:2000؛ يستخدم كنظام تحكم في التحميل للحجب الغربي
الحليب الخالي من الدسم (5٪)	بيوتايم	P0216	حاجز حاجز العزل للعرق الغربي؛ الكتلة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أو 4&00; C طوال الليل
بارافورمالديهايد (4٪)	ميرك KGaA	30525	محلول تثبيت الخلية؛ ثبت على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة
PBS	سولاربيولوجيا	P1010
البنسلين-ستريبتوميسين (100 مرة؛)	ييسن	60162ES76	مضاد حيوي لزراعة الخلايا؛ يثبط التلوث الميكروبي
بيركول (مخزون تدرج DG	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	17-0891-09
الفينول: الكلوروفورم: الكحول الأيزوأميل (25:24:1)	ميرك KGaA	77617	كاشف لإزالة البروتين أثناء استخراج الحمض النووي الجيني
مخزن تحميل البروتين (6&00;)	بيوتايم	P0015F	مخزن تحميل الرحلان الكهربائي للبروتين؛ التركيبة: 100 ملليموتر تريس (رقم الهيدروجيني 6.8)، 4٪ SDS، 2 ملي مولار EDTA، 2٪ جليسرول، 6 مولار يوريا؛ مزج مع 50 & mu; L 2M DTT و50 & mu; L 5٪ بروموفينول أزرق قبل الاستخدام
إنزيم البروتيناز K	ميرك KGaA	39450-01-6	200 ملغ مذاب في 10 مل ddH2O، يستخدم لهضم البروتين أثناء استخراج الحمض النووي الجيني
غشاء PVDF	ترموفيشر	88518	غشاء نقل البروتين؛ يتم تفعيله بالميثانول لمدة دقيقة واحدة قبل الاستخدام
مخزن تحليل RIPA	ييسن	20101	مخزن التحلل لاستخلاص بروتين السبوروزويت
RNase A	ميرك KGaA	9001-99-4	25 ملغ مذاب في 2.5 مل من 0.01 مول/لتر NaAc، وتم تسخينه عند 100 درجة؛ C لمدة 10-15 دقيقة، وتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع 1 مول/لتر Tris-HCl؛ يستخدم لإزالة الحمض النووي الريبي من عينات الحمض النووي
مواد جل SDS-PAGE (أكريلاميد، بيس-أكريلاميد، ترايس، SDS، APS، تيميد)	السيرة الذاتية	101	كواشف لتحضير جل SDS-PAGE؛ تركيز الأكريلاميد معدل حسب الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف
الصوديوم تاوروديوكولات هيدرات	سيغما	T0875
الحل)
تاك ماستر ميكس (2&00;)	فازيم	P112-01/02/03	خلطة تضخيم PCR تحتوي على بوليميراز Taq وdNTPs وغيرها.
ترايتون X-100 (0.25٪)	ميرك KGaA	9036	محلول نفاذية الخلايا؛ الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة
تريبسن	سولاربيولوجيا	T8150
خلط الدوامة	بكين شمال منطقة التطوير الحيوي	HQ-60-II
منظم حرارة حمام الماء	غرانت إنسترومنتس (كامبريدج)	120,GM0815010