استخدام الرنين المغناطيسي النووي بالمحلول لتوصيف المكثفات الجزيئية الحيوية تحت ظروف ثنائية المراحل

ملخص

هنا نقدم بروتوكولات لمنهجيات الرنين المغناطيسي النووي، وإعادة الانتشار المقيد للعينات غير المرئية (REDIFINE) وإزالة التكتيكتيوN المكثفة بواسطة نقل المغنطة الصلبة الSEmi (CONDENSE-MT) التي تتيح توصيفا كميا بدون علامات للمكثفات الجزيئية الحيوية تحت ظروف ثنائية المرحلة، كاشفة عن التقسيم الجزيئي، وديناميكيات التبادل، وترطيب المكثفات، وبنية القطرات دون ترسيب أو وسم.

الملخص

المكثفات الجزيئية الحيوية الناتجة عن فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) تنظم البيئة داخل الخلية وتنظم عمليات كيميائية حيوية متنوعة. على الرغم من أهميتها، يظل فحص تركيب المكثفات، وديناميكيات التبادل، والتنظيم الداخلي تحديا، خاصة بدون علامات خارجية. يمكن لتحليل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أن يوفر نافذة فريدة خالية من العلامات إلى هذه التجمعات المتوسطة المقياس، حيث تلتقط كل من الحركة الجزيئية والتباين البيئي. تمكن منهجيتان مكملتان للرنين المغناطيسي النووي من توصيف شامل للمكثفات مباشرة ضمن حالتها ثنائية المرحلة. بالنسبة للمكثفات التي تكون ديناميكية بما يكفي لتكون ملحوظة بالرنين المغناطيسي النووي، يستخدم نهج التبادل الانتشاري، RErestricted DIffusion of INvisible DIffusion المختصر REDIFINE، تباين الانتشار مع التبادل الكيميائي لقياس نسبة الجزيئات المقسمة بين الطورين المكثف والمخفف، وتحديد حجم القطرات ونفاذية الواجهة، واستخراج معدلات التبادل الجزيئي عبر حدود الطور. بالنسبة للمكثفات الأكثر صلابة التي لا يمكن رؤيتها بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، تستخدم طريقة نقل المغنطة شبه الصلبة المكشوفة بالماء، CONdensate DEtectioN بواسطة SEmi-Solid Magnetization Transfer، أو اختصارا CONDENSE-MT، تباين الاسترخاء وتبادل البروتونات بين الجزيئات الحيوية المكثفة والمذيب الطور المخفف لمراقبة المكثفات على بروتونات الماء السائب، مما يوفر الوصول إلى التقسيم النسبي، ومعدلات الدوران الجزيئي، وديناميكيات الترطيب، ومحتوى الماء المرتبط. معا، تقدم هذه الأساليب رؤية متعددة الأبعاد وكمية لبنية وديناميكيات المكثفات تحت ظروف ثنائية المراحل شبه الأصلية دون علامات فلورية أو كشفية. يوسع تكاملها صندوق أدوات الرنين المغناطيسي النووي لدراسة فصل الطور الجزيئي الحيوي ويؤسس أساسا لربط خصائص المكثفات الفيزيائية-الكيميائية بوظيفتها البيولوجية وسوء تنظيمها المرضي.

المقدمة

تحقق الخلايا تنظيمها المكاني والزماني الاستثنائي من خلال تقسيم التفاعلات الكيميائية^{الحيوية 1,2,3}. بالإضافة إلى العضيات المرتبطة بالغشاء، تحدث العديد من العمليات الخلوية الحيوية داخل أقسام بدون أغشاء تتكون بواسطة فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) للبروتينات والأحماض^{النووية.} تشمل هذه التجمعات الديناميكية، التي يشار إليها غالبا باسم المكثفات الجزيئية الحيوية، النواة، وحبيبات الإجهاد، والبقع النووية، وأجسام المعالجة، التي تلعب أدوارا أساسية في، على سبيل المثال، أيض الحمض النووي الريبي، وتنظيم النسخ، أو نقل الإشارة^5،6. قدرتها على تكوين وإذابة وتبادل المكونات استجابة للإشارات البيئية توفر للخلايا آلية متعددة الاستخدامات لتنظيم الأنشطة الكيميائية الحيوية دون الاعتماد على الأغشية الدهنية.

تنشأ مجموعة كبيرة من المكثفات الجزيئية الحيوية من بروتينات مرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) التي تحتوي على مناطق غير منتظمة جوهريا (IDRs) ومجالات ارتباط بالرنا (RBDs)^7,8. يمكن لهذه البروتينات أن تنفصل إما بمفردها أو في مركب مع RNA، مما يؤدي إلى تكوين مكثفات ذات خصائص مادية ووظائف بيولوجية متنوعة. على سبيل المثال، يشكل بروتين SARS-CoV-2 النيوكليوكابسيد (N) مكثفات جزيئية حيوية معتمدة على RNA⁹ مرتبطة بتعبئة وتجميع الجينوم الفيروسي، بينما يشكل بروتين الارتباط بمسار البوليبيريميدين 1 (PTBP1) مكثفات نووية تساهم في إسكات الجينات¹⁰. علاوة على ذلك، تخضع بروتينات مثل FUS وDDX4 لأنظمة LLPS مدفوعة بمناطقها غير المرتبة، مما يؤثر على أيض الحمض النووي الريبي وتكوين حبيبات الإجهاد^11,12. يرتبط اختلال تنظيم هذه العمليات بأمراض تنكسية عصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) والخرف الجبهي الصدغي، حيث يمكن أن تؤدي الانتقالات الطورية الشاذة إلى التجمع وفقدان الوظيفة¹³.

لا يقتصر التكثف على البروتينات ومجمعات البروتين-الحمض النووي الريبي. يمكن للحمض النووي الريبي وحده أن يخضع لاضطراب LLPS، خاصة في سياق تسلسلات التوسع المتكرر المرتبطة بعدة اضطرابات تنكسية عصبية^14,15. يمكن أن تشكل تضخمات متكررة بين ثلاثي النيوكليوتيدات والسداسي نوكليوتيدات، مثل CAG في مرض هنتنغتون أو CUG في ضمور عضلة العضلة، مكثفات شبيهة بالقطرات سواء في المختبر أو في الخلايا¹⁴. فهم الأساس الفيزيائي لتكثيف الحمض النووي الريبي، وكذلك كيف يختلف عن المكثفات التي تحركها البروتينات والحمض النووي الريبي البروتيني، أمر بالغ الأهمية لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء أمراض التمدد المتكرر.

على الرغم من أهميتها البيولوجية، يظل التوصيف الكمي والخالي من العلامات للمكثفات الجزيئية الحيوية تحديا هائلا¹⁶. تعتمد تقنيات المجهر الفلوري التقليدية والطيفية على ملصقات خارجية، والتي يمكن أن تؤثر على بنية الجزيئات الحيوية أو ديناميكيا أو سلوك الطور^17,18. علاوة على ذلك، بعض المكثفات غير مرئية بالرنين المغناطيسي النووي بسبب الحركة الجزيئية المحدودة وأشكال الخطوط العريضة، مما يحد من المعلومات المتاحة من خلال الطرق التقليدية للرنين المغناطيسي النووي. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لاستراتيجيات تجريبية يمكنها فحص المكثفات مباشرة في حالتها ثنائية المرحلة، شبيهة بالسكان الأصليين، دون وضع علامات على الوضع. نظرا للدور المهم لحدود طور القطرات في عمليات التبادل ونضج المكثفات، فمن المهم بنفس القدر تثبيت القطرات الجزيئية الحيوية ضمن حجم عينة معين، مما يمنع ترسيب الطور الكثيف. يمكن تحقيق ذلك بسهولة باستخدام الهيدروجيلز التي تحاكي الهيكل الخلوي من الأغاروز.

التطورات الأخيرة في منهجيات الرنين المغناطيسي النووي توفر مثل هذا الحل. يجمع نهج REDIFINE (إعادة انتشار العينات غير المرئية)¹⁹ بين رنين مغناطيسي النووي المنتشر وتحليل التبادل الكيميائي لقياس التقسيم الجزيئي، وتبادل الحركيات، وحجم القطرات في مكثفات البروتين والبروتين والحمض النووي الريبي. وبشكل مكمل، تكتشف تقنية CONDENSE-MT (تحليل الكثافة الكثيفة بواسطة نقل المغنطة الصلبة SEmi) المكثفات غير المرئية بالرنين المغناطيسي النووي عبر نقل المغنطة المائية، مما يسمح بقياس كمية المادة المكثفة في الظروف المحددة ويكشف ديناميكيات الترطيب ومعدلات الدوران الجزيئي داخل المكثف. معا، تتيح هذه الطرق إجراء تحقيقات خالية من العلامات وغير جراحية لأنواع مختلفة من المكثفات، والمكثفات البروتينية فقط، والمكثفات البروتينية-RNA، والمكثفات التي تحتوي على RNA فقط في ظروف توازن ثنائية المرحلة. من خلال توسيع صندوق أدوات الرنين المغناطيسي الطبيعي، تفتح الباب لاستكشاف منهجي وكمي لبنية المكثفات، وديناميكياتها، وصلاتها بالوظيفة البيولوجية والأمراض.

البروتوكول

1. تحضير العينة

1. اختيار المخزن المؤقت (buffer): استخدم مخازن مجربة تكون فيها الجزيئات الحيوية أكثر استقرارا.
   ملاحظة: عادة ما تكون إشارات الرنين المغناطيسي النووي أقوى عند درجة حموضة منخفضة. كمتطلب تقني، أضف 5٪ D₂O كقفل ميداني لجميع عينات الرنين المغناطيسي النووي (النتيجة النهائية v/v).
2. تثبيت العينة ثنائية المرحلة، باستخدام هيدروجيل أغاروز الذي يحاكي الهيكل الخلوي كوسط. وزن مسحوق الأغاروز لتحضير مرق أغاروز بنسبة 1.5٪ (بدون وزن لكل وزن) في نفس المخزون. استخدم الأجاروز العادي كبديل أرخص للمكثفات الحيوية الجزيئية المكونة من البروتينات غير المنتظمة جوهريا (IDPs) والحمض النووي الريبي الريبي التي يمكنها تحمل درجات حرارة أعلى. استخدم الأجاروز منخفض الذوبان عند تحضير المكثفات الدقيقة التي تحتوي على بروتينات تحتوي على مجالات مطوية¹⁹.
3. تحضير مرق الأغاروز: سخن التعليق إلى حوالي 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وقم بإذابة الأغاروز بالكامل عن طريق الخلط أو الدوامة.
   تحذير: الأغاروز المنصهر ساخن ويمكن أن يحترق؛ يتعامل مع القفازات المقاومة للحرارة.
   ملاحظة: حافظ على الأغاروز المنصهر دافئا (مثلا 55 درجة مئوية للأجاروز العادي و37 درجة مئوية للأجاروز منخفض الذوبان) في حمام مائي ليبقى سائلا قبل الخلط مع العينة البيولوجية.
   يمكن إبقاء الأجاروز المنصهر دافئا لعدة عشرات من الدقائق^19،21.
4. تحضير العينة النهائية ثنائية المرحلة:
   1. لتحضير عينة ثنائية المراحل مستقرة بواسطة هيدروجيل أجاروز، اخلط مخزونات البروتين (و/أو الحمض النووي الريبي) مع مخزن الأغاروز الدافئ الخاص في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
      ملاحظة: تركيز البروتين/الحمض النووي الريبي النهائي عادة ما يكون بين 50-500 ميكرومولار ليكون مناسبا للكشف عن الرنين المغناطيسي النووي.
   2. انقل الخليط فورا إلى أنبوب NMR بقطر 3 مم باستخدام ماصة زجاجية طويلة. دع الأغاروز يتصلب بعد فترة وجيزة من النقل.
      ملاحظة: بدون الأغاروز، تتراسب العينة ثنائية المراحل مع مرور الوقت، مما يعقد جمع بيانات الرنين المغناطيسي النووي وتحليلها لأن العينة تتغير فعليا على مقياس زمن التجربة.
5. إجراء الفحص البصري: افحص العينة بصريا. إذا حدث فصل الطور، تظهر العينة فورا عكرة وتبقى كذلك. وهذا يشير إلى أن العينة ثنائية الطور قد تم استقرارها بنجاح في الأغاروز.
6. عند التخطيط لتشغيل CONDENSE-MT، جهز عينة مرجعية إضافية للأجاروز بنفس الخطوات، مع حذف إضافة الجزيء الحيوي. أضف المخزن بدلا من ذلك للحصول على نفس حجم العينة. جهز هذه العينة فقط بعد تحضير عينة المكثفات وقياس جميع البيانات عليها لضمان عدم حضن عينة الأغاروز المرجعية لفترة أطول.

2. تسجيل تجارب REDIFINE

1. قم بقفل وتشغيل الشبكة ومطابقة قناة ^1Hكالمعتاد. قم بمعايرة طول النبضة 90° على ساعة ^واحدةباستخدام الإجراء العام.
2. سجل طيفا واحدا من كبت الماء. يفضل ملاحظة إشارة جزيئية حيوية قوية (الشكل الإضافي 1A).
   1. إذا لم يلاحظ أو لم يلاحظ إشارة قليلة، افترض أن البروتين/الحمض النووي الريبي المكثف غير قابل للرصد بالرنين المغناطيسي النووي وأن الانقسام إلى الطور المكثف مرتفع. في هذه الحالة، لا تتابع REDIFINE لأن هذه المنهجية تعتمد على إشارة جزيئية حيوية قابلة للملاحظة.
   2. في هذه الحالة، من حيث المبدأ يجب أن تعمل تجارب CONDENSE-MT بشكل جيد جدا، لذا انتقل فورا إلى الخطوة 4 (تسجيل تجارب CONDENSE-MT).
3. قم بتحميل تجربة التحليل الطيفي المرتب بالانتشار التقليدية (DOSY) التي تعتمد على إجراء تقليدي ثنائي الأبعاد للصدى المحفز باستخدام تدرجات ثنائية القطب (تسلسل نبضات بروكر: stebpgp1s19). راجع كتيبات مستخدم بروكر DOSY وديفيوجن لمزيد من التفاصيل.
4. اضبط P0 وP1 وP27 على طول النبضة المعايرة 90°. اضبط كقاعدة عامة، NS إلى 32 مسحا، DS إلى 16، TD1 إلى 16، وضبط TD2 و SW2 ليكون وقت الاستحواذ AQ بين 80-100 مللي ثانية. اضبط d1 على 1.5 ثانية.
   ملاحظة: يجب معايرة التدرجات بشكل صحيح.
5. قم بتحسين تأخير ووترغيت d19 كالمعتاد حسب المجال المغناطيسي لديك، لتحقيق أقصى إثارة عند العطرات (حوالي 7 جزء في المليون) أو الأليفاتيك (حوالي 1 جزء في المليون). اضبط d20 على 75 مللي ثانية. اختيار p30 يعتمد على حجم البروتين/الحمض النووي الريبي. بالنسبة للبروتينات >20 كيلو دالتون، استخدم 5 مللي ثانية؛ للبروتينات الصغيرة، استخدم 3.5 مللي ثانية كقاعدة عامة.
6. سجل تجربة DOSY بالأمر: 'xau dosy 2 95 16 l y y' التي تصف قوة تدرج الانتشار من 2 إلى 95٪ في 16 خطوة، بطريقة خطية.
   1. من الناحية المثالية، يجب ملاحظة الانحسار الأولي للإشارة الناتج عن الطور المخفف، بينما يجب أن يتوقف تناقص إشارة الطور المكثف إلى هضم (الشكل 1A والشكل الإضافي 1B).
7. للاستمرار في جمع البيانات لمجموعة REDIFINE الكاملة، أنشئ 9 بيانات جديدة من المعاملات التي قمت بتشغيلها للتو. في كل تجربة متتالية، يتم تغيير تأخير انتشار d20 فقط بخطوات متغيرة ليشمل النطاق من 100–1000 مللي ثانية (أي 100، 150، 200، 250، 300، 400، 500، 700، 1000 مللي ثانية).
8. نفذ كل واحدة من هذه التجارب بالأمر 'xau dosy 2 95 16 l y n'. آخر حرف "n" يضمن الحفاظ على كسب المستقبل طوال التجارب العشر.

3. معالجة مجموعات بيانات REDIFINE وتصور النتائج

1. معالجة كل تجربة (10 تجارب إجمالا) بالطريقة التالية:
   1. قم بتعيين qsine ل SSB 2 كدالة نافذة، واستخراج الشريحة^{الخامسة} باستخدام qsin؛ fp، وتحويل البعد الأحادي وحفظ معلمات المراحل إلى مجموعة البيانات ثنائية الأبعاد.
   2. ثم عالج ثنائي الأبعاد باستخدام xf2، وقم بتصحيح الأساس abs2، واستخراج هذه الشرائح ال16 باستخدام split2D (مدخلات إضافية في نافذة النوافذ المنبثقة: r – 16 – 11). سيستخرج هذا 16 طيفا مكتسبا باستخدام قوى تدرج مختلفة ويحتفظ بها كتجارب معالجة أحادية الأبعاد من 11 إلى 26 ضمن نفس مجموعة البيانات.
   3. كرر نفس الشيء مع التجارب التسع المتبقية. أحيانا من الضروري فحص أول 4-5 شرائح على الأقل للتأكد من صحة المراحل وتصحيح الخطوط الأساسية. إذا لزم الأمر، صحح يدويا – فالتوزيع الجيد والأساس هما شرطان أساسيان للقياس الصحيح (الشكل 1B).
2. استخدم LLPS_REDIFINE_fit كود ماتلاب المرفق للتحليل (الشكل التكميلي 2A). في الكود، قم بضبط الكلمات التالية حسب تجاربك: 'دلتا' (ضرب الانتشار d20)، 'P.d' (مدة التدرج الكلي 2*p30)، exp(1,:) إلى exp(10,:) بناء على # التجارب التي أجريتها. ثم اضبط P.g حسب قوة تدرج المجس (متاح في مجلد تجربة TopSpin تحت ملف "difflist").
3. قم بضبط 'المجلد' و'المسار' بناء على موقع بياناتك. شغل الكود حتى السطر 40. هذا سيعطيك شريحة البعد الواحد – من هنا، اختر مناطق التكامل؛ يجب أن تشمل هذه الأروماتيك أو الأليفاتيك، واختيار المنطقة لأضيق قدر الإمكان، دون احتساب مجموعات جزيئية مختلفة مثل الأميدات.
4. أدخل حدود التكامل في نقاط في المتغيرات 'يسار' و'يمين' وفقا لذلك (الشكل التكميلي 2A). وذلك لدمج البيانات للتحليل الكمي (الشكل 1C). اختر اسم المصفوفة حسب العينة الخاصة بك، وتاريخ التشغيل، وبعض التفاصيل التجريبية.
5. شغل الكود بالكامل. في 'fit0'، يمكنك اختيار المعلمات الابتدائية التي ستستخدمها دالة التحسين لبدء التصغير. ابدأ بالقيم الافتراضية، ثم إذا لم يتحقق التقارب، غير القيمة الثانية ل fit0 (السكان في المرحلة المكثفة) بخطوات 0.1 من 0.1 إلى 1.
   ملاحظة: أحيانا تحتوي مجموعة البيانات على عدة أدنى محلية، ويجب تغيير المعلمات الابتدائية بشكل كبير لتبدأ في التقارب نحو الحد الأدنى العام.
6. عند تحقيق التوافق المرضي، تكتب قيم التركيب داخل الشكل (الشكل 1D والشكل الإضافي 2B) ويمكن الوصول إليها في المتغير 'الملاءمة'. قم برسم هذه المعاملات بشكل مخطط إحصائي لتحسين التصور.

4. تسجيل تجارب CONDENSE-MT

ملاحظة: هدف التجربة هو اكتشاف المكثفات بشكل غير مباشر من خلال ملاحظتها على إشارة ماء المذيب عبر تبادل البروتونات²⁰. في تجربة CONDENSE-MT، يتم الحصول على ملف MT بالإصبعة وتحليله (الشكل 2A)²⁰.

1. سجل الطيف المفضل لديك أحادي الأبعاد الذي يستخدم لكتم الماء. إذا تم ملاحظة إشارة قليلة جدا، فمن المرجح جدا أن تجربة CONDENSE-MT ستنجح بشكل جيد جدا.
2. يتطلب التحليل الكمي ل CONDENSE-MT تحديد معدل R1 مسبقا. حدد معدل R₁ عبر استعادة T₁ للانعكاس. انسخ تسلسل النبضات المقدم، ومجموعة معلمات بروكر، وقائمة ال vd إلى المجلدات المعنية. قم بتحميل مجموعة المعلمات "T1_inversion_recovery" واضبط القوى والترددات على مطياف الرنين المغناطيسي النووي (وفقا ل "edprosol").
   1. قم بمعاير نبضة 1H بزاوية 90° (p1)، واضبط NS على 2، DS على 0، d1 إلى 20 ثانية، SW إلى 10 جزء في المليون، TD2 إلى 16k، وTD1 إلى 24 (من طول قائمة الأقراص المعدلة). تمكين تدرج ضعيف على طول Z (GPZ0 = 0.1٪) لتجنب تأثيرات تخميد الإشعاع.
3. بالنسبة لتجربة CONDENSE-MT,
   1. انسخ مجموعة معلمات بروكر المقدمة، والتسلسل، وقائمة الترددات إلى مجلدات بروكر الخاصة، وحمل مجموعة المعلمات "CONDENSE-MT"، وضبط الترددات والقوى حسب مقياس الطيف الخاص بك.
   2. اضبط P1 على طول النبضة المعايرة 90° وP4 إلى 1 ميكروثانية لنبضة الإثارة لتجنب تخميد الإشعاع. ضبط NS على 2، DS على 16، d1 إلى 4 ثانية، SW2 إلى 20 جزء في المليون، TD2 إلى 8k، TD1 على طول قائمة الترددات (عادة 46). اضبط SPNAM10 على Squa100.1000 ومدة اللعب من p10 إلى 5 ثوان.
   3. ابحث عن قدرة SP10 لإنتاج إشعاع 100 هرتز (سيحسب الأمر 'نبضة 100 هرتز' بكل من الواط والديسيبل). ضبط قدرة نبضة الإشعاع SP10 وفقا لذلك ونفذ هذه التجربة شبه ثنائية الأبعاد باستخدام أمر 'zg'.
      ملاحظة: ستستخدم التجربة قائمة الترددات المرفقة التي تمتد عبر إزاحات الإشعاع من الرنين الفعال مع الماء إلى الرنين الخارج جدا (100000 هرتز) لاكتشاف إشارة الماء عند إزاحات إشعاع مختلفة (الشكل 2B). مخطط تكاملات الماء (ضمان الطور الصحيح للأطياف؛ الشكل 2C) بالنسبة لإزاحة الإشعاع، يعطي ملف CONDENSE-MT الموضح في الشكل 2A.
4. أنشئ 7 تجارب جديدة وفي كل واحدة متتالية، زد فقط قوة الإشعاع لتغطية النطاق من 170 هرتز إلى 1000 هرتز (أي 170، 250، 330، 500، 650، 780، 1000 هرتز). في كل تجربة، استخدم الأمر من النقطة السابقة. لكل قدرة تشبع، سيتم الحصول على قائمة الإزاحة كاملة (الشكل 2D).
   ملاحظة: يتطلب تركيب المكثف-MT البيانات المرجعية التي تم الحصول عليها من عينة الأغاروز فقط (وسط بدون مكثفات حيوية جزيئية). ضمان نفس الفاصل الزمني بين تحضير العينة وجمع البيانات، والحصول على نفس مجموعة البيانات التي تتكون من 8 تجارب على عينة مرجعية للأغاروز. وذلك لضمان أن كل من مرجع الأغاروز والعينة ثنائية الطور قد تم حضانهما لنفس الفترة.

5. معالجة مجموعات بيانات CONDENSE-MT وعرض النتائج

1. معالجة كل تجربة CONDENSE-MT (8 تجارب إجمالا، الشكل التكميلي 3A) بالطريقة التالية.
   1. اضبط qsine ل SSB 2 كدالة النافذة، واستخرج^{الشريحة} 46 باستخدام qsin؛ fp، وقم بتوزيع ذروة الماء في 1D، وحفظ معلمات المراحل في مجموعة البيانات ثنائية الأبعاد، ثم معالجة 2D باستخدام xf2، واستخراج هذه الشرائح ال46 باستخدام split2D (مدخلات إضافية في نافذة النوافذ المنبثقة: r – 46 – 11).
      ملاحظة: سيستخرج هذا 46 طيفا أحادي البعد مكتسبة باستخدام إزاحات إشعاع مختلفة ويحتفظ بها كتجارب معالجة أحادية البعد من 11 إلى 56 ضمن نفس مجموعة البيانات (الشكل الإضافي 3A، موضح لتجربة CONDENSE-MT على تردد 1000 هرتز).
   2. كرر نفس الشيء مع التجارب السبع المتبقية. تحقق من عدة شرائح من كل تجربة للتأكد من صحة المراحل والأساس (الشكل 2C). إذا لزم الأمر، صحح يدويا – المراحل الجيدة والأساس هما شرطان أساسيان للقياس الصحيح!
2. كرر نفس الخطوات على البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام عينة مرجعية للأجاروز وتجارب استعادة الانعكاس، مع استخراج الشريحة 24 للمرحلة واستخدام split2D (r – 24 – 11).
3. ملاءمة البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام كود ماتلاب المقدم. اتبع التعليمات المحددة في النص.
4. قم بإجراء تحليل التركيب أولا لعينة مرجعية للأجاروز للحصول على المعلمات الخلفية في غياب المكثفات. يقرأ رمز read_CONDENSE_MT_data أولا بيانات الرنين المغناطيسي النووي المعالجة ويدمج إشارة رنين الماء في الشرائح أحادية البعد التي تولدها أمر split2D (الشكل الإضافي 3B).
5. حدد حدود التكامل بشكل فردي؛ سيتم رسم طيف مرجعي أحادي البعد في Matlab لتقييم حدود التكامل (الشكل التكميلي 3C). سيقوم الكود بتطبيع البيانات بشكل أكبر وملاءمة التكاملات الموحدة للماء كدالة من الإزاحة الإشعاعية والقدرة على نموذج CONDENSE-MT²⁰. ستخزن read_CONDENSE_MT_data التكاملات المطبعرة في المتغير integral_water_real_all، والذي يستخدم بعد ذلك للتركيب اللاحق.
6. تحديد معدل استرخاء R₁ للماء في وجود الأغاروز أو المكثفات قبل تركيب بيانات CONDENSE-MT.
   ملاحظة: يمكن تركيب تجربة استعادة انعكاس الماء ضمن القسم الأول من نص ماتلاب CONDENSE-MT_full (أو نص CONDENSE_MT_referenceMTpool في حالة بيانات مرجعية الأغاروز). يمكن إدخال اسم الملف ومسار التجربة، بالإضافة إلى معرف التجربة للتجربة، لتشغيل سكريبت ماتلاب Inversion_Recovery (الشكل الإضافي 4A، القسم 1). إذا لزم الأمر، يمكن تعديل عدد شرائح البعد الواحد وحدود التكامل في هذا السكريبت؛ ويعتمد الأخير على معلمات المعالجة المستخدمة في TopSpin. سيحدد هذا القسم معدل R1 للمياه ويخزنه في متغير P.R1w ، وهو مطلوب لتركيب بيانات CONDENSE-MT لاحقا.
7. بالنسبة لبيانات الأغاروز، استخدم التكاملات التطبيحية مباشرة للتوافق، باستخدام سكريبت CONDENSE_MT_referenceMTpool (الذي يستدعي دالة function_1MT .
8. لقياس المكثفات، استخدم المعلمات الملاءمة للأجاروز كمدخل للتوافق العالمي للبيانات التي تم الحصول عليها على العينة المكثفة (الشكل التكميلي 4A). سيثبت ذلك الخصائص الفيزيائية لشبكة الأغاروز كقيم ثابتة للملاءمة، مما يسمح بقياس تأثير المكثفات الإضافي للمكثفات المدمجة في شبكة الأغاروز (الشكل 2E).
9. قم بقياس كمية المكثفات باستخدام سكريبت CONDENSE-MT_full ، الذي يستدعي دالة ماتلاب function_2MT . تعطى المعلمات الابتدائية للتحسين الحسابي عبر fit0 (الشكل التكميلي 4B). سيتم حساب عدم يقين المعلمات في الملاءمة باستخدام مصفوفة جاكوبيان التي ستشتق منها مصفوفة التباين والتغاير (الشكل التكميلي 4B).
10. تقييم جودة الملاءمة بواسطة انحراف الملاءمة، الذي يشبه الانحراف المتبقي لتوقع النموذج من البيانات التجريبية. لمزيد من مراقبة الجودة، رسم التوافق مع البيانات التجريبية (الشكل التكميلي 4C).

النتائج

تم تطبيق بروتوكول LLPS REDIFINE الموصوف هنا على نطاق FUS N-terminal (NTD). ينفصل FUS NTD بسهولة في الظروف المحيطة عند تركيزات ميكرومولر^19,21. تم تحضير هذه العينة بتركيز 200 ميكرومولار في عازل HEPES بعمق 30 ملمولار يحتوي على 200 مللي مولار KCl عند درجة حموضة 7.5، مع 0.5٪ من الأغاروز العادي. عند فصل الطور، تبقى إشارات FUS NTD قابلة للرصد في الطور المكثف (الشكل 1A,B). وهذا يجعلها مرشحا مثاليا لدراسة LLPS REDIFINE. أي أن معظم البروتينات المعرضة ل LLPS تحتوي على مناطق طويلة غير منتظمة داخليا تظل عادة مرئية في الطور المكثف؛ ومع ذلك، في البروتينات الأكثر تنظيما، هذا ليس هو الحال.

كشف ملاءمة REDIFINE (الشكل 1D والشكل 3A,B) عن عدة معلمات فريدة لهذه العينة من FUS NTD. تحديدا، حدد معاملات الانتشار في الطور المخفف والمكثف (D_dil و_{D cond})، وعدد البروتين في الطور المكثف (ν_cond)، ومتوسط حجم القطرة R، ونفاذية الطور بين الطور p. يحدد حجم القطرة ونفاذيتها معدل التبادل بين الطور من الطور المكثف إلى الطور المخفف k_cd=3p/R، مما يسمح لنا بالحصول على معلومات حول ديناميكيات التبادل¹⁹.

يمكن تصور هذه النتائج بطرق مختلفة (الشكل 3B). باستخدام مخطط العنكبوت، يمكن مقارنة النتائج عبر ظروف أو عينات مختلفة. من ناحية أخرى، يمكن تمثيل معلمات REDIFINE في النموذج بشكل تصويري لتصورها بأكثر الطرق فعالية. لاحظ أن REDIFINE يوفر كل هذه النتائج بدون تسمية في غضون ساعات قليلة باستخدام عينة واحدة فقط.

نظرا لأن إشارة الرنين المغناطيسي النووي ل FUS NTD تبقى قابلة للكشف في الطور المكثف (الشكل 3C)، فمن المرجح أن يكون CONDENSE-MT غير قابل للتطبيق بسبب نقص تباين الاسترخاء. قمنا بتسجيل مجموعة بيانات CONDENSE-MT على FUS NTD، وبالفعل، لم يلاحظ أي فرق في ملف MT بين مرجع الأغاروز وعينة FUS NTD ثنائية الطور (الشكل 3C). وهذا يجعل منهجية CONDENSE-MT غير قابلة للتطبيق على هذه العينة المحددة من FUS NTD.

ومع ذلك، يوفر CONDENSE-MT توصيفا ديناميكيا لمكثفات RNA ذات التوسع المتكرر (الشكل 3C,D)²⁰. لاحظ أن CONDENSE-MT يمكنه توفير عدة معلمات تميز الحمض النووي الريبي في الطور المكثف بشكل فريد (الشكل 3D)، رغم أن إشارته غير قابلة للرصد في الرنين المغناطيسي النووي التقليدي (الشكل 3C). المعلمات التي تم الحصول عليها هي حركية تبادل البروتون بين المكثف والماء السائل (k_{مكثف، H2O} و k_{H2O، مكثف})، ومعدل استرخاء T₂ للمكثف (T_{2، المكثف})، الذي يعكس مدى التوقف الديناميكي للجزيئات الحيوية عند التكثف، ومعدل R₂ الظاهر للماء السائب (R_{2، ماء}). هذا المعامل الأخير هو مزيج خطي من معدل الدوران للكتلة الضخمة، والماء المخفف، والماء المكثف البطيء المتدحرج. تشير قيم R_{2 أعلى} إلى زيادة كثافة المياه في المكثف، مما يرفع معدل R₂ الظاهر للماء إلى²⁰ (الشكل 2E والشكل 3D).

توفر البيانات والكود

تتوفر بيانات LLPS REDIFINE الخام ورموز المعالجة في مستودع زينودو: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . تم إيداع بيانات خام وأكواد معالجة CONDENSE-MT في مستودع Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. MATLAB مطلوب للمعالجة. كما تم توفيرها في هذه المقالة (ملفات الترميز التكميلية).

الشكل 1: سير عمل REDIFINE. (أ) تعطي قياسات الانتشار منحنيات انقسام ثنائية المراحل المعقدة في عينات مكثفة. يحتوي التحلل الناتج على معاملات مفككة تصف معاملات انتشار النوع في الطور المكثف والمخفف، وأعدادها، وحجم القطرات، ومعدل التبادل بين الطور. (ب) لفك ترميز هذه المعاملات المعزولة، يجب تسجيل مجموعة بيانات شبه ثلاثية الأبعاد عن طريق تغيير ليس فقط قوة التدرج بل أيضا تأخيرات الانتشار. من الضروري جدا للقياس أن يتم تصحيح كل شريحة من هذه القياسات بشكل صحيح وتصحيح الأساس بشكل صحيح. (ج) بعد التحقق من جودة البيانات المقاسة والمعالجة، يتم إدخال هذه الشرائح أحادية الأبعاد إلى كود MATLAB للتحليل والرسم النهائي. (د) يتم بعد ذلك تركيب البيانات بواسطة محلل برمجة غير خطي. يتم توضيح التوافق والمعاملات الناتجة لعينة FUS NTD ثنائية المرحلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: سير عمل CONDENSE-MT (أ) ملف تعريف فريد من CONDENSE-MT لوحظ على رنين الماء يوضح التوسع الناتج عن وجود جزيئات حيوية مكثفة وماء. (ب) يلاحظ الماء لكل إزاحة إشعاع. (ج) للكمية، من الضروري أن تكون جميع الأطياف متطورة بشكل صحيح. (د) بعد الحصول على رنين الماء عند إزاحات إشعاع مختلفة، يتم تكرار التجربة عند قوى إشعاع مختلفة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء مجموعة بيانات لإشارة الماء النسبية كدالة لكل من إزاحة الإشعاع وقدرة الإشعاع (E). ثم يتم تركيب البيانات بواسطة محلل برمجة غير خطي. يتم توضيح التوافقات والمعلمات الناتجة لعينة RNA ثنائية الطور 31xCAG. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: عرض نتائج REDIFINE وCONDENSE MT. (أ) تمثيل مخطط العنكبوت لمعلمات REDIFINE للتحليل المقارن عبر العينات أو الظروف. (ب) نموذج تخطيطي يوضح معلمات مشتقة من REDIFINE، بما في ذلك معاملات الانتشار، نصف قطر القطرات، التقسيم، ومعدل تبادل الطور. (ج) مقارنة ملفات CONDENSE-MT التي تم الحصول عليها لمرجع الأغاروز وFUS ثنائي الطور NTD في الأغاروز عند إشعاع 500 هرتز.
(د) تحليل CONDENSE-MT لمكثفات RNA 31xCAG التكرارية التي تظهر استخراج المعلمات وتصور تأثيرات نقل المغنطة المرتبطة بالمكثفات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: إعداد REDIFINE. (أ) يبقى مجال FUS N-terminal قابلا للرصد عند تحضير العينة المكثفة ثنائية المرحلة. يلاحظ وجود إشارة قوية للأميد/الأمين والبروتونات العطرية. (ب) يظهر تراجع الإشارة الذي لوحظ في تجربة DOSY الانتشارية تحللا أسرع لمجموعة بروتين طور التخفيف وتحللا أبطأ للبروتين في الطور المكثف. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: معالجة REDIFINE. (أ) كود ماتلاب المستخدم في تركيب REDIFINE، مع معلمات محددة حيث يتطلب المدخل المحدد. توضح الإدخال كيف يتم اختيار منطقة التكامل. (ب) تقليل دالة التوافق والنتائج الناتجة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: إعداد CONDENSE-MT. (أ) نظرة عامة على تجارب الرنين المغناطيسي النووي المطلوبة لتحليل CONDENSE-MT، بما في ذلك تجربة انعكاس الماء واستعادة الاختبار (expno. 5) وتجارب CONDENSE-MT عند قوى إشعاع مختلفة (expno 11-18). (ب)، (ج) نظرة عامة على سكريبت ماتلاب لقراءة وتكامل أطياف الماء أحادية البعد لمجموعات بيانات CONDENSE-MT. تجارب CONDENSE-MT معطى كرئيسية – main8. يتم إدخال حدود الاندماج water_left و water_right. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4: معالجة CONDENSE-MT. (أ) القسم الأول من نص تركيب CONDENSE-MT، والذي يتضمن تركيب استعادة انعكاس الماء (القسم 1) ومدخلات المعلمات الخلفية التي تم تحديدها مسبقا للأغاروز. (ب) تحديد التركيب وعدم اليقين في المعاملات لمجموعات بيانات CONDENSE-MT. يمكن تعيين معاملات البداية للملاءمة ضمن fit0. (ج) قسم رسم نتيجة ملاءمة CONDENSE-MT. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملفات ترميز تكميلية: سكريبتات MATLAB لتحليل REDIFINE وCONDENSE-MT. يقوم بروكر توبسبين ببرمجة إعداد تجربة CONDENSE-MT وسكريبتات MATLAB المستخدمة لمعالجة وتركيب مجموعات بيانات انتشار REDIFINE ومجموعات بيانات نقل المغنطة CONDENSE-MT، بما في ذلك دمج البيانات، وتحليل الاسترخاء، وروتينات ملاءمة النماذج العالمية. MATLAB مطلوب لتشغيل السكريبتات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

هنا، قدمنا بروتوكولات مفصلة لتوصيف المكثفات الجزيئية الحيوية ثنائية المراحل بدون علامات بالرنين المغناطيسي النووي. تشمل هذه المنهجيتين الناشئتين، LLPS REDIFINE، وتجربة تكميلية لكنها متعامدة تسمى CONDENSE-MT. على الرغم من تطبيقها بشكل عام، تعتمد LLPS REDIFINE على الكشف الجزيئي الحيوي وتتطلب إشارة قابلة للرصد عند فصل الطور للتحليل الصحيح. على الرغم من أن هذا قد يحد من قابلية تطبيق REDIFINE، إلا أن غالبية المكثفات تحتوي على بروتينات ذات مناطق غير منتظمة جوهريا يمكن ملاحظتها عادة بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (NMR). على وجه الخصوص، بالنسبة للبروتين:RNA والمكثفات التي تحتوي فقط على RNA، تتوسع إشارة الجزيئات الحيوية في الطور المكثف إلى ما بعد حدود الكشف عند فصل الطور. إذا كان معامل التقسيم إلى الطور المكثف مرتفعا، فإن الرنين المغناطيسي النووي التقليدي لا يلاحظ تقريبا أي إشارة تقريبا. يتجاوز CONDENSE-MT هذا القيد من خلال كونه تقنية مراقبة مائية تعتمد على فرق كبير في الاسترخاء بين الأنواع الجزيئية في الأطوار المخففة والمكثفة.

يعد تحضير العينات بشكل صحيح أمرا أساسيا لتطبيق كل من REDIFINE وCONDENSE-MT بنجاح. لذلك من المهم التأكد من أن الأغاروز منصهر بالكامل قبل نقله إلى الخليط، لتجنب تكون فقاعات الهواء بشكل واسع أثناء النقل، ولتوفير مادة كافية لملء أنبوب الرنين المغناطيسي النووي بشكل موثوق بخلطات ثنائية المراحل تميل إلى الالتصاق في البداية بجدار الزجاج. بالنسبة ل CONDENSE-MT، من الضروري نقل حجم معين من الأجاروز بشكل قابل لإعادة الإنتاج، حيث سيتم قياس خلفية الأغاروز بشكل منفصل. إذا كان تقسيم الجزيئات الحيوية بين الطور المكثف والطور المخفف منحرفا بشدة، أو إذا كان التبادل عبر الأطوار بطيئا أو سريعا جدا، فقد تكون تأثيرات REDIFINE أو CONDENSE-MT غائبة أو ضعيفة جدا بحيث لا يمكن قياسها بشكل موثوق. قد يشبه هذا قيدا رئيسيا لهذه التقنيات. في مثل هذه الحالة، يمكن أن يكون رفع أو خفض درجة الحرارة مفيدا، حيث أن درجة الحرارة تعتبر معدلا قويا لتقسيم الجزيئات وأسعار الصرف الكيميائي. بمجرد الحصول على مجموعات البيانات، غالبا ما يتم الحصول على نتائج التوافق الأمثل بشكل تكراري عن طريق تكرار التحسين الحسابي باستخدام معلمات أفضل ملاءمة من الملاءمة الأولية أو السابقة كقيم إدخال.

بالنسبة للأنظمة التي تحقق تأثيرات قوية من REDIFINE وCONDENSE-MT، يمكن لهذه التجارب أن توفر رؤى خالية من العلامات حول تقسيم الجزيئات، وأسعار الصرف، والديناميكيات الجزيئية التي يصعب تحقيقها باستخدام طرق أخرى خالية من الملصقات. علاوة على ذلك، فإن الطرق المعتمدة على الرنين المغناطيسي النووي عادة غير جراحية، مما يتيح تحليل العينات عدة مرات أو تخزينها لفترات طويلة، مما يسمح بمراقبة خصائص المكثفات مع مرور الوقت. وهذا أمر يثير الاهتمام بشكل خاص في سياق نضج المكثفات المرضية أثناء التليف، وهو أمر يصعب دراسته بطرق مكملة على مدى فترات زمنية طويلة جدا.

نظرا لأن العضيات الخلوية بلا غشاء هي عادة تجمعات متعددة المكونات ذات بنية معقدة، فإن التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية ستشمل اكتشاف وتوصيف أنظمة نماذج المكثفات متعددة المكونات بشكل متزايد التطور، بالإضافة إلى تحليلات المكثفات في سياق خلوي عبر الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية. ومع ذلك، يتطلب ذلك تكييف REDIFINE أو CONDENSE-MT لمثل هذه الأنظمة المعقدة، والجهود جارية لتحقيق ذلك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مطياف الرنين المغناطيسي النووي 700 ميجاهرتز Avance NEO	بروكر بايوسبين	https://www.bruker.com/en.html	يتم جمع البيانات على مطياف الرنين المغناطيسي النووي بتردد 700 ميجاهرتز.
توبسبين	بروكر بايوسبين	https://www.bruker.com/en.html	تتم معالجة البيانات باستخدام هذا البرنامج.
بروتين FUS NTD		لا يوجد	يتم التعبير عن هذا البروتين وتنقيته في مختبرنا
31xCAG RNA		لا يوجد	يتم إنتاج وتطهير الحمض النووي الريبي في مختبرنا
ماتلاب	ماث ووركس	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	تتم معالجة البيانات وتصويرها باستخدام هذا البرنامج.