مقالة منهجية

هندسة نموذج الفأر عالي الدقة قبل السريرية لنقل الدماغ باستخدام تقنية الحقن النابض المتشابك وإصلاح الأوعية الدموية الجراحية الدقيقة

DOI:

10.3791/70639

⸱

أبريل 14, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 2Department of Ultrasound, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Heart Lung and Blood Vessel Diseases, 4Department of Neurosurgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 5Department of Pathology, Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 6Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤسس هذه الدراسة نماذج فئران عالية الدقة لانتشار الدماغ عبر حقن داخل السباط العابر لخلايا الورم باستخدام حقن نابض بالتداخل وإصلاح جراحي دقيق. يحافظ على تدفق الدم الدماغي، ويمنع انسداد الشريان السباتي الشائع، ويوفر نماذج ما قبل سريرية متفوقة مع معدلات تحسينات في انتشار الأورام وتقليل الوفيات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا تزال انتشارات الدماغ مشكلة سريرية مدمرة. أحد التحديات الكبرى في أبحاث نقل الدماغ هو نقص النماذج عالية الجودة التي تعيد تلخيص العملية النقلية بدقة، مما يمكن من رؤى ميكانيكية حول كيفية استعمار الخلايا السرطانية في الدماغ. غالبا ما تتطلب نماذج حقن الشريان السباتي التقليدية للنقالة الدماغية ربطا دائما للشريان السباتي المشترك (CCA)، مما يغير ديناميكية الدم الدماغية ويضعف سلامة الحاجز الدموي الدماغي (BBB). يقدم البروتوكول طريقة محسنة لإنشاء نموذج فأر عالي الدقة لانتشار الدماغ. الابتكار الأساسي يتضمن تقنية الحقن النابض المتداخلة (IPI) لتوصيل الخلايا الورمية، تليها إعادة بناء شريان جراحي في موقع الثقب لاستعادة تدفق الدم الفسيولوجي في CCA. مقارنة بنموذج ربط CCA التقليدي، أدى نهج IPI–الجراحة الدقيقة إلى تقليل الوفيات أثناء العمليات بشكل ملحوظ (2.86٪ مقابل 25.71٪) وزاد من معدل استقرار النقائل الدماغية (94.12٪ مقابل 65.38٪). تستخدم تقنية IPI تكوين الحقنة المتتالية لتقليل ارتجاع الخلايا أثناء حقن داخل الشريان السباتي. بعد حقن الخلايا الورمية، يتم إصلاح CCA بدقة باستخدام غرز جراحية دقيقة تحت ميكروسكوب ستيريو، مما يتجنب الانسداد الدائم. يحافظ هذا على ديناميكا الدم الدماغية الأصلية وسلامة الكتلة الدماغية عند دخول خلايا الورم، مع تحسين كبير من معدلات نجاح الجراحة وتقليل الوفيات. يتم التحقق من صحة الآفات داخل الجمجمة النقائلية من خلال التصوير التلألئي البيولوجي المتسلسل وعلم الأمراض النسيجي. توفر هذه الطريقة منصة متفوقة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لانتشار الدماغ وللتقييم العلاجي قبل السريري، مما يعيد تلخيص العملية النقلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل النقائل الدماغية النوع الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة لدى البالغين، حيث تحدث بحوالي عشرة أضعاف الأورام الدماغية الأولية1. يقدر أن 10٪–20٪ من مرضى السرطان الجهازي سيطورون نقائل دماغية خلال المراحل المتقدمة من مرضهم، وهو سبب رئيسي للوفيات 1,2. على الرغم من التقدم الكبير في علاج السرطانات الأولية، إلا أن توقعات المرضى المصابين بنقائل دماغية لا تزال ضعيفة. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة عام واحد للمرضى المصابين بانتشار الدماغ أقل من 20٪3. آلية انتشار بعض أنواع السرطان إلى الدماغ لا تزال مجهولة. يتفاقم التحدي العلاجي بسبب البيولوجيا الفريدة للنقائل الدماغية، بما في ذلك وجود BBB، والبيئة المناعية المميزة للدماغ، والتفاعلات المعقدة بين الخلايا الورمية والخلايا الدبقيةالعصبية 4,5.

تعتمد كل من أبحاث الديناميكا الدوائية وأبحاث المرض حول انتشارات الدماغ بشكل كبير على نماذج حيوانية دقيقة قبل سريرية تعيد تلخيص عملية المرض البشرية بدقة. النماذج الحيوانية الحالية لانتشار الدماغ تعتمد بشكل رئيسي على زرع الوريد داخل الجمجمة، أو حقن وريد أو وريد الذيل، أو حقن القلب، أو حقن الشريان السباتي 6,7,8,9,10. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تعكس بشكل غير مثالي تطور المرض البشري، وغالبا ما تفشل في التقاط خطوات رئيسية مثل استبعاد الخلايا الورمية عبر كتلة الكتلة العضلية السليمة تحت ظروف التدفق الفسيولوجي11. تؤدي الحقن الوريدية والقلب إلى انخفاض كفاءة تكوين الأورام الخاصة بالدماغ، وغالبا ما تؤدي إلى انتشار انتشارات خارج الجمجمة، مما يؤدي إلى موت الحيوانات المبكرقبل تطور نقائل دماغية كبيرة. تزيد طريقة الحقن التقليدية في الشريان السباتي من معدلات تكون الأورام داخل الجمجمة لكنها تتطلب ربطا دائما للورم الخارجي المزمن. من خلال تغيير ديناميكا الدم الدماغية، قد يؤدي هذا الربط إلى تحفيز نقص التروية في مناطق الدماغ في نفس الجانب ويضعف أنماط تدفق الدم الفسيولوجية اللازمة لتوصيل خلايا الورم، مما يؤثر على توزيعها المكاني ومكانها الاستيطاني داخل الدماغ13,14.

نماذج حيوانية عالية الجودة يمكنها تقليد فيزيولوجيا مرض النقائل الدماغية بشكل أكثر دقة هي أمر بالغ الأهمية15. يجب أن يلخص نموذج نقائل الدماغ المثالي كامل سلسلة الانتقال، بما في ذلك توجيه الخلايا الورمية نحو الأوعية الدموية الدماغية، والتوسع عبر الحاجز الدموي-الدماغي (BBB)، والتفاعلات الديناميكية مع البيئة الدقيقة للدماغ16. الدقة العالية للنموذج أمر بالغ الأهمية لكل من الدراسات الميكانيكية والتقييم العلاجي6. ومع ذلك، فإن نماذج الحقن داخل السباط السباتي الحالية لا تعيد إنتاج الحالات الفسيولوجية الرئيسية بشكل كامل، لا سيما الحفاظ على تدفق الدم الدماغي الطبيعي والتوزيع الطبيعي لخلايا الورم المتداولة.

لتجاوز قيود النماذج ما قبل السريرية الحالية لانتشار الدماغ، تم تطوير نموذج حيواني عالي الدقة يعيد تلخيص سلسلة الانتشار بشكل أدق بناء على تقنية IPI وإصلاح الشرايين الجراحي المجهر. تتضمن هذه الطريقة الانسداد الشرياني العابر بعد حقن خلايا الورم، يليه إصلاح دقيق لموقع الثقب الشرياني لاستعادة تدفق الدم الفسيولوجي إلى المقعد الخلفي الورمي في نفس الجانب. هذا النهج لا يعزز فقط اتساق النموذج ونسب نجاحه، بل يحافظ أيضا، والأهم من ذلك، على BBB من خلال الحفاظ على ديناميكا الدم الدماغية الأصلية. من خلال تقليل اضطراب تدفق الدم الدماغي، يوفر نموذج الحقن داخل السباط المعدل منصة عالية الدقة تلخص بشكل أدق العملية الطبيعية للاستعمار النقيلي في الدماغ، مما يوفر أداة محسنة لدراسة آليات انتشار الدماغ وتقييم العلاجات المحتملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع تجارب الحيوانات من قبل لجنة العناية والاستخدام المؤسسي للحيوانات (IACUC) التابعة لمعهد الفيزياء الحيوية، الأكاديمية الصينية للعلوم (رقم الموافقة: SYXK2021124). تم إعدام الحيوانات التي تصل إلى نقاط نهاية محددة مسبقا وفقا لإرشادات القتل الرحيم للحيوانات الصادرة عن لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) التابعة لمعهد الفيزياء الحيوية، والأكاديمية الصينية للعلوم، وإرشادات الجمعية الأمريكية للحيوانات المرضية للحيوانات (2020)17.

1. تحضير نظام التعليق أحادي الخلية

  1. زراعة خلايا B16F10 و4T1 في وسط RPMI-1640 الكامل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و1٪ بنسلين-ستربتومايسين.
  2. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ CO₂.
  3. تأكد من تعبير اللوسيفيراز وتحقق من عدم وجود تلوث بالميكوبلازما قبل يوم واحد من الإجراءات الجراحية.
  4. في يوم العملية، احصد الخلايا عندما تصل إلى التقاء بنسبة 80٪ عن طريق الغسل أولا بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) قبل التربسين (0.25٪) لمدة أقل من 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. أضف 10٪ وسط RPMI-1640 يحتوي على FBS إلى الخلايا لتبريد التربسين بنسبة 0.25٪.
  6. قم بعمل طرد مركزي على 300 × جرام لمدة 3 دقائق. اغسل الخلايا مرتين في PBS لإزالة المصل المتبقي، ثم عدها باستخدام جهاز قياس الدم.
  7. استخدم اختبار استبعاد الأزرق من Trypan للتأكد من أن صلاحية الخلايا تبقى عند 90٪–95٪ أثناء الحقن.
  8. أعد تعليق الخلايا في PBS عند 2 × 106 خلايا/مل. احتفظ بالخلايا على الثلاجة حتى الحقن.
    ملاحظة: يمكن استخدام خلايا B16F10 و4T1 الموسومة باللوسيفراز المطبوعة. يعرض B16F10 كمثال تمثيلي.

2. تحضير الفئران والتحضير حول العملية

  1. استخدم فئران ذكر C57BL/6 عمرها 7–8 أسابيع.
  2. ضع وسادة تدفئة تحت صفيحة الجراحة لمنع انخفاض حرارة الجسم. شغل وسادة التدفئة قبل 30 دقيقة من الجراحة.
  3. قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية، والصفيحة الجراحية، وقفص الغلاف باستخدام جهاز تعقيم (معقم كهربائي). قم بتعقيم المجهر المجسم والطاولة الجراحية بنسبة 75٪ إيثانول.
  4. يجب تعقيم العناصر الأخرى التي لا يمكن تعقيمها باستخدام الأشعة فوق البنفسجية و75٪ إيثانول (الشكل 1A).
  5. وزن الفأر قبل التخدير وسجل الوزن قبل العملية كخط أساسي.
  6. أضف 10 جرام من التريبروموإيثانول إلى أنبوب الطرد المركزي، ثم أضف 10 مل من كحول الأميل الثالثي. اهز الأنبوب حتى يذوب التريبروموإيثانول تماما.
    ملاحظة: قد يسبب التريبروموإيثانول آثارا جانبية، بما في ذلك الوفاة؛ راقب عمق التخدير بعناية.
  7. قم بترشيح المحلول عبر فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر لتحضير محلول أصلي بنسبة 100٪.
  8. قم بتخفيف محلول 100٪ الأصلي مع محلول ملحي أو مخفف بنسبة 0.9٪ NaCl إلى محلول يعمل بنسبة 2.5٪ (تخفيف بنسبة 1:40). يجب اختبار فعالية كل محلول يعمل جاهز حديثا للتخدير في الفئران.
  9. تخدير الفئران عن طريق حقن 2.5٪ من تريبروموإيثانول داخل الصفاق عند 0.2 مل/10 جرام من وزن الجسم. عند الحاجة، قم بإطالة مدة التخدير بإعطاء جرعة إضافية بمقدار ثلث حجم التخدير الأصلي (الشكل 1B).
    ملاحظة: عدل جرعة التخدير حسب وزن الجسم وراقب التنفس باستمرار.
  10. تأكد من أن الفأر مخدر بالكامل بتطبيق محفز خفيف (مثل قرص إصبع القدم) وعدم ملاحظة أي استجابة حركية.
  11. احلق الفراء في منطقة الرقبة واترك علامة قص على إصبع القدم بعد التخدير.
  12. ضع مرهم العين لحماية العينين من الجفاف.
  13. ضع الفأر على لوحة جراحية وثبت الأطراف الأربعة والقواطع العلوية بشريط لاصق (الشكل 1C).
  14. راقب عمق التخدير من خلال تقييم معدل التنفس وردة فعل القرص لضمان بقاء الفئران خالية من الألم وغير قادرة على الحركة أثناء العملية.
  15. يتم توزيع الحيوانات عشوائيا على مجموعات تجريبية، وأجري الباحثون الذين كانوا أعمى عن تخصيص المجموعات، تحليل التصوير.

3. الإجراءات الجراحية القياسية لتقنية IPI والإصلاح الجراحي المجهري

  1. قم بتعقيم منطقة الرقبة بمحلول بوفيدون-يود ودع الجلد يجف تماما قبل المتابعة (الشكل 1D).
  2. غط الفأر بشكل معقم باستخدام ستارة جراحية معقمة، تكشف فقط منطقة الرقبة (الشكل 1E).
  3. قم بعمل شق في منتصف عنق الرحم بطول حوالي 0.8–1 سم باستخدام مقص جراحي معقم، مع ملقط دقيق لسحب الأنسجة (الشكل 2A).
  4. قم بإجراء تشريح غير حاد للفافة السطحية والعضلات الأساسية باستخدام ملقط بزاوية دقيقة لكشف غمد السباتي الأيمن (الشكل 2B1، الشكل 2C1).
  5. عزل الشريان السباتي الخارجي الأيمن (ECA) من غمد السباتي وربط الشريان السباتي الأيمن لمنع تسرب الخلايا إلى الفروع خارج الجمجمة (الشكل 2B2، الشكل 2C2).
  6. عزل ال CCA الأيمن داخل غمد السباتي بعناية، مع الحفاظ على العصب المبهم الموجود جانبيا وتحت الوعاء (الشكل 2C1).
  7. ضع قطعة صغيرة من القفاز المطاطي وكرة قطنية مبللة بمحلول ملحي تحت ال CCA الأيمن المعزول كوسادة لرفع وتثبيت الوعاء.
    ملاحظة: رفع CCA يثبت الوعاء ويسهل الثقب والحقن بدقة. (الشكل 2B4، الشكل 2C4).
  8. ضع عقدتين غير مشدودتين مع حلقات مفتوحة على ال CCA البعيد والقريب من كرة القطن، ثم اربط العقدة القريبة (الشكل 2B3، الشكل 2C3).
  9. ضع مشبك ميكروأوعية وعائية على ال CCA بالقرب من العقدة البعيدة غير المشدودة لمنع تدفق الدم مؤقتا (الشكل 2B4، الشكل 2C4).
  10. زرع خلايا السرطان
    1. ثقب التداخل
      1. قم بثقب الجزء المرتفع من CCA الأيمن باستخدام إبرة 32G مع توجيه الميل للأعلى.
      2. اسحب الحقنة الأولية مع الحفاظ على موقع الثقب.
      3. يقوم بخلط تعليق خلايا السرطان ب Vortex وسحب 100 ميكرولتر إلى حقنة الميكرولتر، مما يضمن عدم استنشاق فقاعات هواء.
      4. أدخل طرف إبرة حقنة الميكرولتر في موقع الثقب الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.10.1.1 وثبته بثبات دون بدء الحقن لضمان استقرار الموقع قبل تسليم الخلية (الشكل 2B5، الشكل 2C5، الشكل التكميلي 1).
        ملاحظة: استخدم حقنة 32 جرام للثقب وحقنة ميكرولتر للحقن لضمان استقرار الوضعية والتوصيل المتحكم به. يوضح الشكل التكميلي 1 معايير الحقنتين. القطر الخارجي لحقنة 32G هو 0.22 مم، بينما إبرة الميكرولتر 0.26 مم، مما يسهل الإدخال الآمن والحقن المسيطر عليه.
    2. حقن نبض (الشكل 2C5)
      1. قم بإزالة المشبك الميكروفوكسي المطبق في الخطوة 3.9.
      2. ابدأ حقن نظام التعليق الخلوي الورمي في ICA عبر حقنة الميكرولتر.
      3. قم بتسليم التعليق بحركة حقن نابضة، مع تقدم مكبس الحقنة بلطف بنبضات صغيرة بدلا من الضغط المستمر.
      4. إعطاء التعليق باستخدام أحد المعايير التالية: معيار دورة القلب، بحقن ~1 ميكرولتر من تعليق الخلية كل 8 دورات قلبية موجهة بتدفق دم رجعي نابض عند الشريان السباتي الداخلي البعيد؛ أو معيار معدل الحقن، حيث يتم حقن ~1 ميكرولتر/ثانية مع ضمان ألا يتجاوز المعدل 60 ميكرولتر/دقيقة.
      5. راقب الوعاء أثناء الحقن. يتم الإشارة إلى نجاح الولادة عندما يصبح الوعاء الأحمر شفافا مؤقتا أثناء مرور التعليق عبر التمشير، دون وجود انفجار مرئي حول موقع الثقب.
      6. بعد الانتهاء من الحقن، اسحب الحقنة الميكرولتر بحذر.
      7. شد العقدة البعيدة فورا بطريقة متحكم بها لإغلاق الوعاء وتقليل التقيؤ (الشكل 2B6، الشكل 2C6).
        ملاحظة: الحقن النابض يقلل من فرط التروية ويقلل من خطر ارتفاع الضغط داخل الجمجمة.
  11. الجراحة الدقيقة (الشكل 2B6، الشكل 2C6)
    1. استخدم غرزة جراحية مجهرية من النايلون 10-0 لإغلاق موقع الثقب بطريقة محكمة الإغلاق للماء، مع وضع نقاط الدخول والخروج بالإبرة بجوار هامش العيب لتقليل تسرب الأوعية الدموية والحفاظ على وضوح الإضاءة السطحية.
    2. مرر إبرة الخياطة الجراحية المجهرية عبر فتحة الثقب في جدار الوعاء تحت تكبير عالي، واترك الغرز غير مربوطة مؤقتا.
    3. غسل الحقل الجراحي بمحلول ملحي هيبارين.
    4. ثبت الغرز بعقدتين إلى ثلاث عقدة مربعة.
    5. قص أطراف الغرز الحرة إلى حوالي 1–2 مم لمنع الارتخاء وتقليل عبء الأجسام الغريبة.
      ملاحظة: تم وصف الإجراءات الجراحية القياسية لتقنية IPI والإصلاح الجراحي الدقيق في الفيديو التكميلي 1.

4. استعادة تدفق الدم في CCA

  1. قم بفك العقدة القريبة تدريجيا.
  2. قم بغسل التلوين لإزالة أي جلطة مجهرية محتملة. ضع كرة قطنية جافة في ساحة الجراحة لمراقبة النزيف الزائد.
  3. بمجرد عدم تأكيد عدم وجود انصباب نشط من موقع الثقب، قم بفك العقدة البعيدة بحذر لاستعادة تدفق الدم السباتي (الشكل 2B7، الشكل 2C7).

5. تأكيد نجاح الإصلاح

  1. استعادة النبض
    1. راقب CCA للتأكد من نبضات قوية، مما يدل على نجاح إعادة التروية.
  2. تحقق من سلامة السفينة وسلامة السفينة
    1. افحص موقع الإصلاح للتأكد من خلوه من التضيق وأن التلوين يبقى براءة اختراع ومستمرا مع الجزء القريب من الوعاء.

6. الري بالجروح والإغلاق

  1. قم بغسل الحقل الجراحي جيدا بمحلول ملحي طبيعي غير مهيمن لإزالة الحطام وجلطات الدم.
  2. أغلق الشق الجلدي باستخدام خياطة مستمرة.
    ملاحظة: حافظ على رطوبة مجال الجراحة وقم بجميع الحركات بلطف لتقليل إصابة الأنسجة.

7. الرعاية بعد العملية

  1. دعم السوائل: أعط 0.5–1 مل محلول ملحي دافئ معقم تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة لتعويض فقدان السوائل أثناء العملية.
  2. الوقاية من العدوى: إذا تجاوزت مدة العملية 40 دقيقة، أعط الإنروفلوكساسين (5 ملغ/كغ، مرة واحدة يوميا) لمدة 3 أيام متتالية. لا يطلب المضادات الحيوية إذا استمر الإجراء أقل من 40 دقيقة.
  3. التغذية والترطيب: قدم الهيدروجيل أو الطعام الملطف لمدة أسبوع على الأقل بعد العملية لضمان الترطيب والتغذية الكافية.
  4. المراقبة اليومية: قم بإجراء تقييمات صحية يومية، ومراقبة سلوك الدوران، والعجز العصبي، وعدوى الجروح، وفقدان الوزن.
  5. المسار المتوقع بعد العملية: خلال أول 48 ساعة، قد تظهر الفئران انخفاضا في النشاط، وانتصابا خفيفا، وفقدان وزن يصل إلى 15٪ من خط الأساس قبل العملية، يتبعه تعافي تدريجي.
  6. مسكن: أعط الميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) مرة واحدة يوميا لمدة 2-3 أيام لتخفيف الألم وتعزيز التعافي.

8. معايير التقييم لنجاح إنشاء نماذج الحيوانات

  1. مراقبة وزن الجسم
    1. وزن الفئران يوميا وسجل وزن الجسم.
  2. التقييم السريري
    1. قيم العلامات السريرية يوميا، بما في ذلك الوضعية والسلوك الدوراني.
  3. تصوير التلمع الحيوي
    1. شغل مفاتيح الطاقة في جهاز التصوير والكمبيوتر.
    2. شغل برنامج تحليل التصوير الحيوي (الإصدار 4.7.2) وانقر على "تهيئة" لتهيئة نظام التصوير الحيوي للتلميع.
    3. أثناء التهيئة الكهربائية، سيظهر ضوء حالة درجة الحرارة على لوحة تحكم نظام التصوير باللون الأحمر. قم بإجراء التصوير فقط بعد أن يتحول ضوء حالة درجة الحرارة إلى اللون الأخضر.
    4. حرم الطعام والماء عن الفئران لمدة 6 ساعات قبل التصوير لمنع الشفط أثناء التخدير.
    5. جهز ركيزة التصوير بتركيز 10 ملغ/مل، محمية من الضوء طوال الإجراء. احسب حجم الحقن عند 10 ميكرولتر/جم وزن الجسم.
    6. قيد الفأرة للتصوير. نظف موقع الحقن في أسفل البطن الأيسر بنسبة 75٪ كحول طبي.
    7. استخدم مسحة قطنية لتحفيز جدار البطن بلطف في موقع الحقن لتقليل خطر دخول الإبرة إلى الأمعاء.
    8. بعد ثقب جدار البطن، استنشق بلطف لتأكيد غياب الدم، ثم حقن الركيزة في التصوير الحية ببطء.
    9. بعد 4 دقائق و30 ثانية من حقن الركيزة، انقل الفأر إلى غرفة تحفيز التخدير.
    10. تحفز التخدير باستخدام إيزوفلوران بنسبة 3٪. بمجرد فقدان ردود فعل التصحيح والقرص، قلل تركيز الإيزوفلوران إلى 2٪ للصيانة.
    11. ضع الفأر المخدر في غرفة التصوير، مع التأكد من أن مخروط الأنف يغطي الفم والأنف بالكامل. أغلق باب غرفة التصوير بإحكام.
    12. في لوحة تحكم نظام التصوير، اختر "Luminescent" كوضع تصوير. اضبط زمن التعريض إلى 60 ثانية يدويا. اختر "التصوير الفوتوغرافي"، "التراكب"، و"شبكة المحاذاة".
    13. اضبط مجال الرؤية على D لتصوير ثلاثة فئران. اضبط ارتفاع الصورة إلى 1.5 سم. اختر "الحظر" لمرشح الإثارة و"فتح" لمرشح الانبعاث.
    14. بعد 10 دقائق من حقن الركيزة، اضغط على "اقتناء" لالتقاط الصورة.
    15. بعد الحصول على الصورة، انتقل إلى لوحة الأدوات واختر "ROI Tools". استخدم أداة "الدائرة" لتحديد منطقة الاهتمام (ROI)، ثم انقر على "قياس العائد على الاستثمار" للحصول على بيانات كمية.
  4. التحليل النسيجي
    1. احصاد أنسجة الدماغ عند نقطة التجربة وخضعها لتحليل نسيج.
    2. حدد وتأكد من الآفات النقائلية عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E).

9. نقاط نهاية إنسانية

  1. لضمان رفاهية الحيوان والامتثال للمعايير الأخلاقية، تم تحديد نقاط نهايات إنسانية محددة مسبقا كمعايير للقتل الرحيم الفوري.
  2. يتم القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO₂)، يليه خلع عنق الرحم كطريقة فيزيائية ثانوية لتأكيد الوفاة.
  3. يجب إجراء القتل الرحيم الفوري إذا حدثت أي من الحالات التالية.
    1. العجز العصبي
      1. خلل الحركة: ارتنح (مشية غير مستقرة، تمايل)، دوران كهربائي، شلل، شلل نصفي، أو ارتعاش.
      2. تغيرات سلوكية أو واعية: خمول، غيبوبة، أو غيبوبة.
      3. علامات زيادة الضغط داخل الجمجمة: وضعية غير طبيعية (مثل انحناء الظهر مما يدل على الضيق) أو ميل الرأس.
      4. النوبات: تشنجات عامة أو بؤرية.
    2. التغيرات في وزن الجسم والوظيفة الفسيولوجية
      1. فقدان وزن الجسم يتجاوز 20٪ أو عدم القدرة على الأكل أو الشرب بشكل مستقل بسبب عبء الورم أو ضعف شديد.
      2. ضيق النفس (التنفس أو التنفس العميق) أو سلس البول/البراز.
    3. حالة الورم
      1. أنهى التجربة فورا إذا تم اكتشاف قرحة أو عدوى أو نخر مرتبط بالورم.
    4. الحد الأقصى للعبء الورمي المحتمل
      1. تخضع الفئران لتصوير التلألؤ الحيوي مرتين أسبوعيا.
      2. بمجرد دخول إشارة الورم داخل الجمجمة مرحلة نمو أسي (مثل التكرار بين جلستين تصوير متتاليتين)، تزداد المراقبة العصبية إلى مرتين يوميا.
      3. يتم القتل الرحيم فور بدء الترنح أو النوبات، بغض النظر عن قيمة إشارة التلألؤ الحيوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير المضيء الحيوي والتحليل الكمي
وفقا للبروتوكول الجراحي الموحد، أظهر نموذج الفأر المحسن لانتشار الدماغ إشارات حيوية مستقرة داخل الجمجمة من خلال التصوير التسلسلي في الجسم بعد العملية. أظهر التصوير الحيوي المتوهج المستمر في الجسم الحي (الشكل 3A) والتحليل الكمي (الشكل 3B) على مدى 4 أسابيع بعد تلقيح داخل الشريان السباتي أن خلايا B16F10 المنتشرة تكاثرت داخل البيئة الدقيقة للدماغ. أظهرت مراقب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد النماذج القوية قبل السريرية التي تلخص نقائل الدماغ بدقة ضرورية لتوضيح الآليات الفيزيولوجية المرضية وتقييم الفعالية العلاجية. يتطلب نموذج الحقن داخل السباط التقليدي ربط الشريان السباتي المشترك (CCA)، الذي يغير تدفق الدم الدماغي بطريقة غير فسيولوجية، مما قد يؤدي إلى إصابة إقفارية في نفس الجانب ويعطل الحاجز الدموي الدماغي (BBB)9,11,15,16. لهذا النموذج ثلاث قيو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا توجد تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حظي هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة: 82350113 إلى جنوب غرب).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10-0 microsurgical suture with needleLingqiao2650798Microsurgical suture for repair of the common carotid artery puncture site
100 µL microliter syringeBolige Tools100ULMicroliter syringe for tumor cell delivery during interlock pulsatile injection
100 µL pipetteEppendorf3123-000250Pipette for saline irrigation of the surgical field
32G 1 mL insulin syringeKindlyYY0497Insulin syringe used to create the initial arterial puncture site
4-0 silk sutureEthiconW501Suture material for closure of the skin incision
4T1 breast cancer cell lineObtained from Laboratory Shengdian Wang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of SciencesCRL-2539Tumor cell line used for intracarotid brain metastasis modeling
75% EthanolAnnjetQ/371402AAJ008Disinfectant for cleaning the injection site
7–8-week-old male C57BL/6J miceCharles River Laboratories1.10011E+17Experimental animals used for the B16F10 brain metastasis model
8-week-old female BALB/c miceCharles River Laboratories1.10011E+17Experimental animals used for the 4T1 brain metastasis model
Angled-tip forcepsKewo Tools—Microsurgical forceps for tissue dissection and vessel manipulation
B16F10 melanoma cell lineObtained from Laboratory Shengdian Wang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of SciencesCRL-6475Melanoma cell line used for intracarotid brain metastasis modeling
Bioluminescence imaging analysis softwareLiving Image (version 4.7.2)—Software for analysis of bioluminescence imaging data
DMEMXigong Bio TechM1805Cell culture medium for tumor cell maintenance
Enrofloxacin (antibiotic)MCEHY-B0502Antibiotic used for postoperative infection prophylaxis
Eosin Y solutionBeyotimeE301879Histological staining reagent for eosin staining
Eye ointmentBaiyunshanH44023089Ophthalmic ointment for protection of the eyes during anesthesia
Fetal bovine serum (FBS)Pan Sera TechST30-3302Serum supplement for cell culture medium
GraphPad PrismVersion 4.7.2—Statistical analysis software for survival curves and quantitative data analysis
Hematoxylin solutionBeyotimeC0105SHistological staining reagent for hematoxylin staining
IsofluraneH.F.Q. Biotechnology101357015Inhalation anesthetic used during imaging procedures
IVIS Spectrum in vivo imaging systemLumina Series III—Imaging system for in vivo bioluminescence imaging
Meloxicam (analgesic)Qilu Animal Health150252467Non-steroidal anti-inflammatory drug used for postoperative analgesia
Microsurgical scissorsKewo Tools—Microsurgical scissors for tissue dissection
Mini vessel clipZheyong Tools200521Microvascular clip for temporary occlusion of the common carotid artery
Needle holderJiangxin Tools1420 20Cr13Surgical instrument for handling microsurgical sutures
Paraformaldehyde (4%)Zhongsheng Wanda Tech20240411Fixative for brain tissue preservation prior to histological analysis
PenicillinGibco1758-9324Antibiotic for cell culture
Povidone-iodine solutionSihuanpaiQ/PGSHW0009Antiseptic solution for surgical skin disinfection
RPMI-1640 mediumXigong Bio Tech12-115FCell culture medium for tumor cell growth
Scilogex mixersScilogexMX-SVortex mixer for homogenizing tumor cell suspensions
Steam indicator tape3M-Comply1322-24MMSterilization indicator for autoclaved surgical instruments
StereomicroscopeOlympusSZ61Microscope used for visualization during microsurgical procedures
Zeiss Stemi 508 stereomicroscopeZeissStemi 508Stereomicroscope used for high-magnification surgical visualization
Sterile saline (0.9%)Kelun25M14D07Sterile irrigation solution used to maintain moisture of the surgical field
StreptomycinGibco1758-9319Antibiotic for cell culture
Surgical drapeDafang001-2016Sterile drape used to isolate the surgical field
Surgical glovesAnsell Medi-grip210-64005Sterile gloves used during surgical procedures
TribromoethanolSigma-AldrichMKBH0634VInjectable anesthetic for surgical procedures
Ultrasound DopplerMindray S7 SCI—High-resolution ultrasound system for assessment of carotid artery blood flow

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sacks, P., Rahman, M. Epidemiology of brain metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 481-488 (2020).
  2. Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
  3. Yuzhalin, A. E., Yu, D. Brain metastasis organotropism. Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (5), a037242 (2020).
  4. Preusser, M., et al. Brain metastases: Pathobiology and emerging targeted therapies. Acta Neuropathol. 123 (2), 205-222 (2012).
  5. Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nat Rev Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
  6. Daphu, I., et al. In vivo animal models for studying brain metastasis: Value and limitations. Clin Exp Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).
  7. Drouin, Z., Lévesque, F., Mouzakitis, K., Labrie, M. Current preclinical models of brain metastasis. Clin Exp Metastasis. 42 (1), 5 (2024).
  8. Lee, J. E., Yang, S. H. Advances in brain metastasis models. Brain Tumor Res Treat. 11 (1), 16 (2023).
  9. Lim, M., et al. Modeling brain metastasis by internal carotid artery injection of cancer cells. J Vis Exp. (186), e64216 (2022).
  10. Boire, A., Brastianos, P. K., Garzia, L., Valiente, M. Brain metastasis. Nat Rev Cancer. 20 (1), 4-11 (2020).
  11. Schackert, G., Fidler, I. J. Development of in vivo models for studies of brain metastasis. Int J Cancer. 41 (4), 589-594 (1988).
  12. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat Med. 16 (1), 116-122 (2010).
  13. Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (10), 3927-3932 (2008).
  14. Follain, G., et al. Hemodynamic forces tune the arrest, adhesion, and extravasation of circulating tumor cells. Dev Cell. 45 (1), 33-52.e12 (2018).
  15. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Sci Rep. 9 (1), 622 (2019).
  16. Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. J Vis Exp. (120), e55085 (2017).
  17. American Veterinary Medical Association. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2020).
  18. Brasil, S., et al. Monro-Kellie 4.0: Moving from intracranial pressure to intracranial dynamics. Crit Care. 29 (1), 229 (2025).
  19. Miyamoto, T., Karimov, J. H., Fukamachi, K. Acute and chronic effects of continuous-flow support and pulsatile-flow support. Artif Organs. 43 (7), 618-623 (2019).
  20. Kadiroğulları, E., et al. Effect of pulsatile cardiopulmonary bypass in adult heart surgery. Heart Surg Forum. 23 (3), E258-E263 (2020).
  21. O’Neil, M. P., et al. Microvascular responsiveness to pulsatile and nonpulsatile flow during cardiopulmonary bypass. Ann Thorac Surg. 105 (6), 1745-1753 (2018).
  22. Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
  23. Yang, Y., et al. Vascular tight junction disruption and angiogenesis in spontaneously hypertensive rat with neuroinflammatory white matter injury. Neurobiol Dis. 114, 95-110 (2018).
  24. Yaremenko, L., et al. Reactions of astrocytes and microglia of the sensorimotor cortex at ligation of the carotid artery, sensitization of the brain antigen and their combination. Georgian Med News. (304-305), 122-127 (2020).
  25. Ahn, J. H., et al. Differential regional infarction, neuronal loss and gliosis in the gerbil cerebral hemisphere following 30 min of unilateral common carotid artery occlusion. Metab Brain Dis. 34 (1), 223-233 (2019).
  26. Jeong, J. H., Koo, H., Choi, K. G. Morphological analysis of short and long term changes after ligation of unilateral common carotid artery in gerbils. J Korean Neurol Assoc. 17 (4), 561-567 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة