تم تحديد الأنماط متعددة الأبعاد أحادية الخلية والمتكاملة للنسخ والأهداف فوق الجينية في مقاطع الأنسجة المجمدة

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكول متعدد الأومور المكاني Trekker–CUT&Tag يجمع بين الترميز المكاني المباشر لقسم النسيج وتحليل متعدد الخلايا أحادية الخلية. يتيح هذا النهج من تحديد عرض الخلايا الواحدة وتعديل هيستون H3K27ac بشكل مكاني في نفس الوقت، مما يوفر رؤى ميكانيكية حول تنظيم الجينات في سياق تشريح الأنسجة الدقيق.

Abstract

توفر تقنيات التنوع المكاني مع التحليل الخلوي الأحادي فرصا غير مسبوقة لتوضيح البنية الجزيئية والخلوية للأنسجة المعقدة. دمج الترميز المكاني للنوى داخل مقاطع تجميد فردية معدة من كتل أنسجة مدمجة في وسط تجميد بدرجة حرارة القطع المثلى (OCT) مع اختبارات متعددة الأوجه أحادية الخلية في سير عمل بسيط وفعال يمكن أن يسهل التعليق والتحليل الجزيئي المحلي للخلايا في أنواع الأنسجة. تبلغ هذه الدراسة عن انقسام مكاني تحت نهج CUT&Tagation متعدد الأبعاد (CUT&Tag) يقوم بتحليل تعديل H3K27ac والتعبير الجيني في مقطع دماغي مجمد واحد في الوقت نفسه. بعد الترميز الشريطي المكاني، يتم عزل النوى المفردة وتخضع لتقنية CUT&Tag، وهي عملية جمع مشتركة لالتقاط الحمض النووي الموسوم والحمض النووي الريبي والرموز الشريطية المكانية، وتحضير المكتبات، والتتابع. ينتج سير العمل ملفات تعريف فوق جينومية ونسخية مشروحة مكانيا من نفس النوى، مما يتيح تعيين المعلومات متعددة الأوجه إلى الإحداثيات التشريحية. دمج المعلومات فوق الجينية مع بيانات النسخ المكانية يزيد من دقة تحديد نوع الخلايا ويكشف عن برامج تنظيمية منظمة مكانيا وتفاعلات خلايا-خلية داخل الأنسجة السليمة.

Introduction

علم الأحياء المكاني هو مجال سريع التطور يرسم خريطة لموقع وتنظيم وتفاعلات الجزيئات والخلايا والأنسجة داخل بيئاتها الأصلية ^1,2,3. على عكس الطرق الضخمة أو التقليدية ذات الخلية الواحدة التي تتطلب تفكك الأنسجة وتؤدي إلى فقدان المعلومات الموقعية، تحافظ الطرق المكانية على الإحداثيات الفيزيائية للمحللات أو الخلايا/النوى، مما يتيح تحقيقا مباشرا في كيفية تأثير بنية الأنسجة على هوية الخلية، والتواصل بين الخلايا، والوظيفة البيولوجية 4,5,6,7 . بينما تعد الترانسكريبتومكس المكانية والبروتيومكس المكانية حاليا من أكثر الأساليب اعتمادا على نطاق واسع، فإن المجال يتوسع بسرعة نحو التنميط المكاني متعدد الأوميك ^3,8,9. التوصيف المشترك للتعبير الجيني والحالات فوق الجينية داخل نفس النسيج قوي بشكل خاص، لأنه يربط مباشرة الناتج النسخي بالآليات التنظيمية—مثل إمكانية الوصول إلى الكروماتين وتعديلات الهيستون—التي تحكم نشاط الجينات وتعرف بأنها تختلف عبر المجالات المكانية 10,11,12 . لذا، سيوفر تحليل الإيبيجينوم المكاني المتكامل والنسخات رؤى حاسمة حول كيفية تشكيل البرامج التنظيمية لهوية الخلايا وتنظيم الأنسجة.

تم تطوير عدة استراتيجيات متعددة الأودية المكانية لتمكين التحليل الجينيوي فوق الجيني والتوصيف النصي المتزامن. يستخدم الترميز الحتمي في تسلسل الأنسجة (DBiT-seq) قنوات ميكروفلويدية لنقل الباركود المكاني مباشرة أو غير مباشرة، عبر الختم باستخدام ألواح الهلام، إلى أقسام الأنسجة، مما يسمح بالتعليق المكاني للمحللات. يسهل هذا النهج التحليل المكاني المشترك للميزات فوق الجينية والترانسكريبتومية 12,13,14,15. طريقة العلامة المنزلقة، التي تم تسويقها كمنصة تاكارا تريكر، تدخل مباشرة الرموز الشريطية المكانية إلى الأنسجة السليمة قبل التفكك، مما يسمح بمعالجة النوى المفهرسة مكانيا باستخدام سير عمل خلية واحدة قياسي وإسقاطها حسابيا إلى إحداثيات الأنسجة الأصلية¹⁶. على النقيض من ذلك، يستخدم الاختبار المكاني للكروماتين المتاح، وسلالات الخلايا، والتعبير الجيني مع التسلسل (SPACE-seq) استراتيجية الهدف حيث يتم التقاط الأهداف اللاجينية متعددة الذيول وmRNA على تسلسل التقاط متعدد الديموت في بلاطات النسخ المكاني¹⁷.

الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT&Tag) هو أداة قوية لرسم خرائط التفاعلات بين الحمض النووي والبروتينات الهيستونية أو غير الهيستونية من عينات ذات مدخلات منخفضة جدا¹⁸. يعتمد CUT&Tag على تجزئة الكروماتين بواسطة Tn5 عبر الترانسبوزاز ووسم الحمض النووي (الوسم)، مستخدما Tn5 الموجهة بالأجسام المضادة الموجهة ببروتين A المتقارن للانقسام الخاص بالموقع والوسم الجزيئي. بينما يتضمن اختبار CUT&Tag التقليدي خطوات حضانة وغسيل متعددة، تم استخدام سير عمل مبسط ومبسط ل CUT&Tag لتعزيز كفاءة CUT&Tag في تطبيقات الخلايا المتعددة في المراحل النهائية¹⁹.

الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل ومراقبة الجودة لاختبار Trekker–CUT&Tag المكاني متعدد الأومور. (أ) مخطط تخطيطي لسير عمل المتعدد المكاني Trekker–CUT&Tag. يتم تركيب قسم إكليل من نسيج دماغ الفأر المجمد حديثا على بلاطة فضائية من تريكر ويخضع للترميز المكاني. بعد تحلل الأنسجة، يتم عزل النوى وتقييمها من حيث الإنتاج والجودة. يستخدم حوالي 50,000 نواة في H3K27ac CUT&Tag، وتخضع النوى الموسومة لترميز خلية واحدة باستخدام 10x خرزات هلام Chromium Multiome من Genomics بعد العد. يتم تضخيم الحمض النووي المرمز شريطيا أحادي الخلية مسبقا ومقسما إلى جزئين. يتم توليد مكتبة CUT&Tag المفهرسة مباشرة بواسطة PCR الفهرس. بالنسبة لمكتبات التعبير الجيني والباركود المكاني، يتم تضخيم الحمض النووي المضخم مسبقا واختيار الحجم حسب الحجم. تستخدم شظايا تتوافق مع أحجام cDNA النموذجية في إعداد مكتبة تعبير الجينات، بينما تستخدم شظايا DNA أقصر لإنشاء مكتبة الباركود المكانية. يتم تسلسل المكتبات ورسم خرائطها وفقا لإرشادات 10x Genomics وCurio Trekker. الجدول الزمني التجريبي المتوقع موضح على اليسار. (ب) نقاط التحقق الرئيسية لمراقبة الجودة (QC) والاعتبارات الحرجة طوال سير العمل. تشمل مراقبة الجودة للنوى تقييم الإنتاجية، وسلامتها، والتجمع، ومحتوى الحطام. يشمل مراقبة الجودة المبدئية تقييم توزيع حجم الحمض النووي وتلوث دايمر البادئي لجميع المكتبات. يتم تقييم خصوصية مكتبة CUT&Tag بواسطة PCR الكمي (qPCR)، الذي يقيس إثراء المناطق الجينومية المستهدفة عبر الخلفية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تقدم هذه الدراسة اختبار TREKKER CUT&Tag المكاني متعدد الأبعاد الذي يحدد في الوقت نفسه تعديل هيستون H3K27ac المرتبط بالعناصر التنظيمية النشطة للسيس والتعبير الجيني في مقاطع الأنسجة المجمدة حديثا. يوفر هذا البروتوكول إجراءات خطوة بخطوة لترميز تاكارا تريكر، وتفكيك الأنسجة وعزل النوى، وعد النوى والتحكم في الجودة، وتحليل التعديل منخفض الإدخال بتقنية CUT&Tag لتعديل H3K27ac، والتقاط الأهداف الجزيئية على 10x من خرزات الجينوم المتعددة أحادية الخلية، وتحضير المكتبة. تم عرض سير العمل باستخدام مقطع إكليلي من نسيج دماغ الفأر. على عكس سير عمل Genomics Multiome القياسي 10x، حيث يتم قياس وصول الكروماتين بواسطة التحليل للكروماتين المتاح للترانسبوزاز مع تسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq)، يستبدل هذا البروتوكول شظايا الحمض النووي المشتقة من CUT&Tag بشظايا ATAC، مما يتيح الاستكشاف المباشر لمناظر تعديل الهيستون بدقة خلية واحدة. لربط الباركود المكاني لتريكر مع 10x باركود خلية واحدة من Genomics، يتم التقاط الباركودات المكانية متعددة الذيل ونصوص mRNA بواسطة تسلسلات بولي-دي-دي-تي في حرز الجل مولتيومي، بينما تلتقط تسلسلات الفاصل شظايا DNA من CUT&Tag. تمكن هذه الاستراتيجية المزدوجة من الاستعادة المتزامنة للمعلومات فوق الجينية، والمعلومات المكتوبة، والمكانية من نفس النواة الواحدة. حسب علمنا، هذا هو أول سير عمل متعدد الأوجه مكاني يدمج مباشرة التعليقات المكانية في الباركود من تريكر مع اختبار متعدد الخلايا أحادي الخلية لتحديد توزيع علامة الهيستون على مستوى الجينوم والنسخ النصي. تسمح المناظر الطبيعية متعددة الأبعاد الناتجة بالحل المكاني، التي تدمج بيانات احتلال H3K27ac وبيانات التعبير الجيني من إسقاط ملفات الخلايا المفردة إلى إحداثيات الأنسجة الأصلية وتوفر رابطا مباشرا بين آليات التنظيم فوق الجينومية وبرامج النسخ المتعلقة ببنية الأنسجة السليمة.

Protocol

تم القتل الرحيم للفئران البالغة عن طريق_{استنشاق} ثاني أكسيد الكربون (IACUC #: A48315-15-R24) قبل حصاد الأنسجة. تمت إزالة الأدمغة بالكامل بعد استئصال الجمجمة السهمية وإزالة الفرج المقسم إلى النصف. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تركيب قسم نسيج على بلاطة الباركود الخاصة بتريكر للترميز المكاني

1. جهز ما يلي قبل البدء.
   1. قم بموازنة كتلة الأنسجة المدمجة في درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في التجميد قبل القطع. جهز الفواصل للانقسام بالأشعة فوق البنفسجية، وتفكك الأنسجة، وعزل النوى.
      ملاحظة: قد تختلف درجة الحرارة المثلى للتقسيم حسب نوع النسيج.
   2. لعزل النوى، قم بتبريد الطرد المركزي باستخدام دلاء متحركة لأنابيب بسعة 1.5 مل حتى 4 درجات مئوية. قم بتبريد طبق يحتوي على 12 بئر مع حلقة Trekker O على الثلج.
   3. اضبط مقياس الأشعة فوق البنفسجية على الحد الأقصى للتيار (1.2 أمبير) وأقصى قدرة.
2. سجل معرف بلاطة الباركود المكاني (مثل U0001_001) لبلاطة تريكر المراد استخدامها.
   ملاحظة: تحتوي كل بلاطة تريكر على إحداثيات باركود فريدة. يطلب معرف البلاط لاسترجاع الملف الصحيح لتعيين الباركود المكاني لبيانات التسلسل.
3. قسم النسيج. تم إجراء تقطيع إكليلي بسماكة 25 ميكرومتر في الموقع التقريبي للبريغما -1 مم عند درجة حرارة −18 درجة مئوية (الشكل 1A).
   ملاحظة: قد يزيد السماكة إلى 30 ميكرومتر عند العمل مع الأنسجة ذات الخلية المنخفضة.
4. ضع القسم (أو المنطقة المهمة) على البلاط المكاني وذوبه بوضع إصبع لطيف على أسفل زجاج الانزلاق.
   تحذير: إذا لزم الأمر، تحقق من الإجراءات من خلال قياسات مراقبة جودة النوى باستخدام بلاطة تدريب تريكر.
5. استخدم الملقط لإزالة البلاط من اللاصق الشفاف وضعه في بئر في طبق زراعة مناديل مكون من 12 بئر على الثلج فوق حلقة Trekker O-Ring. فورا قم بعمل 30 ميكرولتر من حاجز القطع من Trekker UV على البلاط، مع التأكد من تغطية كامل الأنسجة بطبقة عازلة.
6. ضع مصباح الأشعة فوق البنفسجية (إعداد 1.2 أمبير) على اللوحة مباشرة فوق البئر. أضاء الإضاءة لمدة دقيقة واحدة لتحرير الباركود مع إبقاء كل شيء على البرودة.
   تحذير: ارتد نظارات واقية للأشعة فوق البنفسجية عند العمل مع المصباح فوق البنفسجي.
7. أطفئ مصباح الأشعة فوق البنفسجية واحتضن البلاط على الثلج لمدة 7.5 دقيقة. أثناء الحضانة، أخرج غرفة غسيل من تريكر مقاس 10 × 10 واملأ الحجرات 1 و2 بسعة 400 ميكرولتر من محلول غسل نوى تريكر الباردة لأخذ عينة على الثلج.
8. التقط البلاط بحذر باستخدام الملقط دون لمس الخرز واغسل البلاط في الحجرة 1 لمدة 5 ثوان. اغسل البلاط في الحجرة 2 لمدة 5 ثوان. ضع البلاط بعناية في بئر داخل لوح ال 12 بئر على الثلج. يجب أن يكون قسم الأنسجة مصبوغا باللون الأزرق ومرئيا بسهولة.

2. تفكك الأنسجة وعزل النوى

1. أطلق 175 ميكرولتر من محلول Invent Minute Buffer A موجه نحو النسيج. كرر ذلك 3 مرات أخرى ليصبح المجموع 700 ميكرولتر. مع كل تفريغ، استهدف أجزاء مختلفة من البلاط لفصل النسيج بالكامل عن البلاط.
   ملاحظة: تجنب تلوث الخرز الناتج عن خدش البلاط أو سقوط الخرز.
2. استمر في فصل الأنسجة عن البلاط عن طريق استنشاق الحاجز من جانب البئر وتوزيعه على المناطق المغطاة بالنسيج، مع إبقاء اللوح على الجليد قدر الإمكان. كرر العملية حتى لا يبقى أي نسيج على البلاط. بعد إزالة جميع الأنسجة من البلاط، استخدم الملقط بعناية لنقل البلاط إلى بئر فارغ.
3. استخدم ماصة P1000 لتفكيك النوى ميكانيكيا مع تكرار التآكل في نفس البئر. كرر العملية حتى لا تبقى أي قطع نسيج مرئية.
4. انقل تعليق النوى بعناية إلى خرطوشة فلتر تحتوي على أنبوب جمع من مجموعة عزل النواة الأحادية Invent Minute للأنسجة/الخلايا العصبية. حضن الأنبوب مع فتح الغطاء عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أغلق خرطوشة الفلتر وقم بتشغيل الطرد المركزي فورا عند 13,000 × g لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد.
5. تخلص من خرطوشة الفلتر وأعد تعليق الحبيبة عن طريق الحقن بلطف 10–20 مرة. قم بتدوير الأنبوب في جهاز الطرد المركزي المبرد مسبقا باستخدام دلاء التدوير بقوة 600 × g لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق الحبيبة في 200 ميكرولتر من مخزن تريكر C.
6. أضف 1 مل من مخزن الدقيقة البارد Invent B إلى أنبوب إيبندورف منخفض الارتباط بسعة 1.5 مل، وضع بعناية 200 ميكرولتر من تعليق النوى فوق مخزن الدقيقة B عن طريق الطرد ببطء على جدار الأنبوب لتجنب اختلاط الطبقات. قم بتدوير الأنبوب في الطرد المركزي المبرد مسبقا باستخدام دلاء التدوير بقوة 500 × g لمدة 10 دقائق. أزل الطبقة الحليبية والسوبرناتانت بعناية.
7. أعد تعليق النوى بلطف باستخدام 24 ميكرولتر من مخزن تريكر C وتابع قياسات مراقبة الجودة للنوى المعزولة.

الشكل 2: تقييم مراقبة الجودة للنوى المعزولة. صور ممثلة للحقول الساطعة لنوى معزولة من نسيج دماغ الفأر. تم صبغ النوى بلون تريبان الأزرق بنسبة 0.4٪ وتم تصويرها بتكبير 40x لتقييم سلامة النواة ووجود الحطام. تظهر تحضيرات النوى المعروضة على اليسار نوى عالية الجودة وسليمة مناسبة للاختبارات اللاحقة، بينما تظهر التحضيرات المعروضة على اليمين نوى ذات جودة منخفضة مع تجمعات أنسجة متحلمة جزئيا. تشير رؤوس الأسهم المملوءة إلى النوى التالفة أو الممزقة. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. عد وقياسات QC للنوى المعزولة

1. لعد النوى، خذ 2 ميكرولتر من تعليق النوى في 8 ميكرولتر من مخزن تريكر C. اخلط 10 ميكرولتر من تعليق النوى المخفف مع 10 ميكرولتر من محلول تلوين AO/PI. عد النوى حسب تعليمات الشركة المصنعة.
2. لتقييم جودة النوى المعزولة، يتم تخفيف 2 ميكرولتر من تعليق النوى إلى 8 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق بنسبة 4٪. فحص النوى تحت مجهر الفلورة بتكبير 40x، مع التحقق من وجود شكل سليم لمحتوى الغشاء النووي والحطام غير النووي (الشكل 2).
3. انتقل فورا إلى اختبار CUT&Tag متعدد النواة أحادي (CUT&Tag على H3K27ac + تعبير الجين).
   تحذير: تابع الخطوات التالية إذا تم استرداد ما لا يقل عن 30,000 نواة عالية الجودة.

4. الوسوم CUT&Tagment على النوى المعزولة

1. جهز مخزن حضانة CUT & Tag I. ضعه على الثلج.
2. تحضير الجسم المضاد الأولي والترانسبوزاز المنشط بواسطة إنزيم التوجيه (TAG) المترافق.
   1. أضف 46.23 ميكرولتر من مخزن حضانة CUT&Tag I و1.33 ميكرولتر من إنزيم TAG إلى أنبوب PCR على الثلج. أضف كمية مثالية من الأجسام المضادة الأولية إلى الأنبوب. اخلط ببطء عن طريق التوصيل بالماصة 10 مرات.
      ملاحظة: تمت إضافة 2.43 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد H3K27ac إلى التفاعل. تم التحقق من كمية الأجسام المضادة لاختبارات CUT&Tag الضخمة والميدانية . تحسين كمية الأجسام المضادة لاقتران إنزيم TAG عن طريق الفحص الجماعي. تم تعريف الجسم المضاد الأمثل بأنه أدنى تركيز يحقق أقصى إشارة إلى ضوضاء، كما يحدده qPCR عند المواقع المستهدفة الموجبة والسالبة.
   2. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة وضع الأنبوب على محول بسرعة 18 دورة في الدقيقة. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. يمكن تحضير الخليط الناتج مسبقا ووضعه على الثلج لمدة تصل إلى 5 ساعات.
      ملاحظة: قد يتم إجراء حضانة TAG للأجسام المضادة بالتزامن مع أو قبل عزل النوى.
3. حضانة النوى المعزولة مع إنزيم الأجسام المضادة TAG المترافقة.
   1. قم بتدوير أنبوب (الخطوة 2.7) من النوى المعزولة في جهاز الطرد المركزي المبرد مسبقا باستخدام دلاء التأرجح بقوة 500 × جم لمدة 10 دقائق. أزل المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبة واترك خلفك ~5 ميكرولتر من السوبرناتانت.
   2. أضف 25 ميكرولتر من مخزن حضانة CUT&Tag I (الخطوة 4.1) وأعد تعليقها بعمل بلطف 10 مرات. انقل النوى إلى الأنبوب (الخطوة 4.2.2) الذي يحتوي على مرافقة الأجسام المضادة وTAG باستخدام نفس طرف الماصة. اخلط بلطف عن طريق الطباعة 10 مرات وضع الأنبوب على مدور لطيف.
   3. حضانه طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. في اليوم التالي (اليوم الثاني)، جهز 1X من محلول القطع والعلامة على النوى وضعه على الثلج.
5. وسم CUT&Tag
   1. استرجع أنبوب التفاعل (الخطوة 4.3.3) من المدور. أضف 5 ميكرولتر من منشط CUT&Tag وانقل الخليط إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل. حضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية على جهاز ThermoMixer عند 550 دورة في الدقيقة.
   2. استرجع الأنبوب، أضف 20 ميكرولتر من مخزن التبريد CUT&Tag، وامزج التفاعل بلطف عن طريق التوصيل بالماصات 10 مرات. قم بطرد مركزي في جهاز الطرد المركزي المبرد مسبقا باستخدام دلاء متحركة بقوة 500 × جرام لمدة 10 دقائق. إزالة المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبات النوية، مع ترك ~5 ميكرولتر من المادة الفائقة في أسفل الأنبوب.
   3. أضف 100 ميكرولتر من مخزن نوى 1X CUT&Tag وأعد تعليق النوى بلطف 10 مرات. قم بتدوير الأنبوب في الطرد المركزي المبرد مسبقا باستخدام دلاء التدوير بقوة 500 × g لمدة 10 دقائق. أزل 85 ميكرولتر من السوبرناتانت، تاركا خلفه ~15 ميكرولتر. أعد تعليق النوى بالتفريغ بلطف وببطء 10 مرات.
6. عد النوى الموسومة وتحديد رقم الاستهداف
   1. أضف 1 ميكرولتر من تعليق النوى الموسوم إلى 9 ميكرولتر من محلول ملحي مخبأ بالفوسفات وامزج مع 10 ميكرولتر من محلول التلوين AO/PI. احسب النوى الموسومة كما هو موضح في الخطوة 3.1.
   2. استخدم 1.6 ضعف العدد المستهدف من النوى لتوليد GEM في خلية واحدة للحصول على العدد المطلوب من النوى الملتقطة بها.
   3. قم بتدوير الأنبوب في الطرد المركزي المبرد مسبقا باستخدام دلاء السوينغ على حرارة 500 × جرام لمدة 10 دقائق وأخرج السوبرناتانت بحذر، تاركا حجما نهائيا 8 ميكرولتر.

5. ترميز الخلايا المفردة للنوى المميزة والتضخيم المسبق للحمض النووي المرمز

1. أضف 7 ميكرولتر من مخزن ATAC B إلى 8 ميكرولتر من النوى الموسومة مع العدد المتوقع من النوى المستهدفة لتجربتك.
   ملاحظة: انظر المزيد من التفاصيل حول إعدادات التفاعل وتشغيل جهاز Chromium X في بروتوكول "توليد GEM والترميز الشرطي" من دليل المستخدم لمجموعة تعبير الجين متعددة الخلايا Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 Rev G).
2. توليد GEM والترميز باستخدام أداة Chromium X.
   1. أضف 60 ميكرولتر من خليط GEM الرئيسي إلى الأنبوب الذي يحتوي على نوى مميزة. اخلط بلطف عن طريق التوصيل بالماصات وحملها على الصف الأول من شريحة Chromium Next GEM J.
   2. جهز حبات هلام متعددة الخلايا أحادية الخلية وحمل 50 ميكرولتر من خرزات الجل على الصف الثاني. قم بتوزيع 45 ميكرولتر من زيت التقسيم في الآبار في الصف 3.
   3. ضع الشريحة J المجمعة مع الحشية في صينية جهاز Chromium X وشغل الآلة.
   4. استنشق ببطء 100 ميكرولتر من الجواهر الأرضية من أدنى نقاط آبار الاسترداد في الصف العلوي 3. قم بتوزيع GEMs ببطء في أنبوب PCR الجديد على الثلج مع أطراف الماصات على جدران الآبار.
   5. حضن الجواهر المجمعة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 50°م) باستخدام البروتوكول التالي: دورة واحدة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، دورة واحدة بدرجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و4 درجات مئوية للاحتفاظ.
   6. أضف 5 ميكرولتر من مادة التبريد وامزج ببطء عن طريق التوصيل بالماصة 10 مرات.
3. تنظيف حضانة ما بعد GEM وتنقية الحمض النووي
   ملاحظة: انظر المزيد من التفاصيل في بروتوكول "تنظيف ما بعد حضانة GEM" من دليل المستخدم لمجموعة تعبير الجين Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 Rev G).
   1. أضف 125 ميكرولتر من عامل الاسترداد الوردي إلى الأنبوب في درجة حرارة الغرفة وقلب الأنبوب بلطف 10 مرات. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة. قم بإزالة 125 ميكرولتر من عامل الاسترداد/زيت التقسيم (الوردي) ببطء من أسفل الأنبوب.
   2. أضف 200 ميكرولتر من خليط تنظيف Dynabeads إلى الأنبوب وامزج بعمل الماصات 10 مرات. حضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي حتى يتخلص المحلول. أزل السوبرناتانت.
   3. أضف 300 ميكرولتر من الإيثانول الطازج الجاهز بنسبة 80٪ إلى الحبيبة. حضن 30 ثانية وأزل السوبرناتانت. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الحبيبة، واحتضن 30 ثانية، وأزل السوبرناتانت. لف الأنبوب لفترة وجيزة وضعه على المغناطيس. أزل السوبرناتانت المتبقي.
   4. أزل الأنبوب من المغناطيس. أضف فورا 50.5 ميكرولتر من محلول التسهيل. امزج بالماصة وحضنه لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضع الأنبوب على المغناطيس حتى يختفي المحلول. انقل 50 ميكرولتر من المحلول المصفى إلى أنبوب جديد.
   5. تنقية الحمض النووي بواسطة خرزات بارامغناطيسية
      1. أضف 90 ميكرولتر من الخرزات البارامغناطيسية (1.8X) إلى كل عينة وامزج عن طريق التوصيل الدقيق. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضع الأنبوب على المغناطيس حتى يختفي المحلول. أزل السوبرناتانت.
      2. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الحبيبة. حضانة لمدة 30 ثانية. أزل الإيثانول. كرر هذا مرة أخرى.
      3. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة وضع الأنبوب على المغناطيس. أزل السوبرناتانت المتبقي.
      4. أزل الأنبوب من المغناطيس. أضف 46.5 ميكرولتر من مخزن المخزن وامزج عن طريق التوصيل بالماصة. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير الجهاز وضعه على المغناطيس حتى يصفى المحلول.
      5. انقل 46 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى إلى أنبوب جديد.
4. تضخيم مسبق للحمض النووي المشفر.
   1. أضف 54 ميكرولتر من خليط التضخيم المسبق إلى كل عينة. خلط البيبيت والطرد المركزي لفترة وجيزة.
   2. الحضانة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 105 درجة مئوية) مع البروتوكول التالي: دورة واحدة بطول 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورة واحدة بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ إجمالي 7 دورات بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ دورة واحدة بدرجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ وتوقف عند 4 درجات مئوية. خزن عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   3. في اليوم التالي (اليوم الثالث)، قم بتنقية الحمض النووي المضخم مسبقا بواسطة خرز بارامغناطيسي (1.6X) كما هو موضح في الخطوة 5.3.5. أضف 80.5 ميكرولتر من المخزن EB إلى الأنبوب وامزج عن طريق التلوين. حضن لمدة دقيقتين عند 22 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة). لف قليلا وضع الأنبوب على المغناطيس حتى يختفي المحلول.
   4. نقل 80 ميكرولتر من الحمض النووي المضخم مسبقا إلى أنبوب جديد. استخدم 40 ميكرولتر لتوليد مكتبة CUT&Tag. تخزين الحمض النووي المضخم مسبقا المتبقي عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: سيتم استخدام 40 ميكرولتر من الحمض النووي المضخم مسبقا المتبقي لاحقا لتعبير الجينات ومكتبات الباركود المكاني.

6. التحضير المكتبي ل CUT&Tag، والتعبير الجني، والرموز الشريطية المكانية

1. إعداد مكتبة scCUT وTag
   1. انقل 40 ميكرولتر من الحمض النووي المضخم مسبقا إلى أنبوب جديد وأضف 60 ميكرولتر من خليط PCR بمؤشر العينة. اخلط بالإيبوبتي وادور لفترة وجيزة.
   2. الحضانة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 105 درجة مئوية) مع البروتوكول التالي: دورة واحدة بطول 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ إجمالي 12 دورة بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 67 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية؛ دورة واحدة بدرجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ 4 درجات مئوية للثبات).
      ملاحظة: الرقم الأمثل للدورة يعتمد على العدد الابتدائي للنوى وعلامة الهيستون التي يتم تسميتها. تم استخدام اثنتي عشرة دورة تضخيم لعلامة H3K27ac في التجربة.
   3. الانتقاء بالحجم المزدوج وتنقية الحمض النووي بواسطة خرز مغناطيسي (0.6X، 1.55X)
      1. أضف 60 ميكرولتر من الخرزات البارامغناطيسية (0.6X) إلى كل عينة وامزج عن طريق التوصيل الدقيق. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضع الأنبوب على المغناطيس حتى يختفي المحلول.
      2. انقل 150 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب جديد. أضف 95 ميكرولتر من الخرزات البارامغناطيسية (1.55X) إلى كل عينة (سوبرناتانت) وامزج عن طريق التوصيل بالماصات. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب على المغناطيس حتى يتخلص المحلول. أزل السوبرناتانت.
      3. أضف 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الحبيبة. انتظر 30 ثانية. أزل الإيثانول. كررها مرة أخرى. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة وضع الأنبوب على المغناطيس. أزل السوبرناتانت المتبقي.
      4. أزل الأنبوب من المغناطيس. أضف 20.5 ميكرولتر من المخزن EB إلى الأنبوب وامزج عن طريق التوصيل بالماصات. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير الجهاز وضعه على المغناطيس حتى يصفى المحلول.
      5. نقل 20 ميكرولتر من مكتبات CUT&Tag المنقاة والمفهرسة إلى أنابيب جديدة.
2. فحص مراقبة الجودة لمكتبة CUT & Tag
   1. تحليل توزيع حجم الحمض النووي في المكتبة
      1. امزج 1 ميكرولتر من حمض نووي مكتبي منقى مع 1 ميكرولتر من مخزن TE منخفض.
      2. اخلط الحمض النووي المخفف مع مخزن عمل محلل الشظايا وشغل الجهاز باستخدام مجموعة HS NGS عالية الحساسية (1-6000bp) (الشكل 3A).
   2. تقييم إثراء موقع جينوم إيجابي ل H3K27ac قبل التسلسل ورسم الخرائط.
      1. امزج 1 ميكرولتر من حمض نووي مكتبي منقي مع 4 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. استخدم 1 ميكرولتر من حمض نووي مخفف من المكتبة لقياسات qPCR لثلاثة مواقع جينومية.
         ملاحظة: بالنسبة ل H3K27ac CUT&Tag، تم تصميم البرايمر الموجب من موقع Actb-TSS، بينما كانت البادئات التي تستهدف T1-TSS والموقع بين الجينات بمثابة عناصر تحكم سالبة²⁰ (الجدول 1). تم استخدام الحمض النووي الجينومي للفئران كأداة تحكم في الإدخال لتطبيع كفاءة PCR (الشكل 3B).
      2. جهز ما مجموعه 20 ميكرولتر من خليط التفاعل كما يلي: 1 ميكرولتر من حمض نووي مخفف من المكتبة، 2 ميكرولتر من خليط البرايمر 10 ميكرومول، 10 ميكرولتر من 2X SYBR Green Master Mix، و7 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
      3. شغل لوحة qPCR المحضرة على نظام CFX Opus PCR الوقت الحقيقي باستخدام برنامج الدورة المناسب لاكتشاف SYBR الأخضر.
3. تضخيم cDNA وحمض نووي الباركود المكاني.
   1. انقل 35 ميكرولتر من الحمض النووي المضخم مسبقا (الخطوة 5.4.4) إلى أنبوب جديد وأضف 65 ميكرولتر من خليط تفاعل تضخيم cDNA. اخلط بالإيبوبتي وادور لفترة وجيزة. الدليل المستخدم في تضخيم الحمض النووي cDNA والباركود المكاني هو Feature cDNA Primers 2.
   2. الحضانة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 105 درجة مئوية) مع البروتوكول التالي: دورة واحدة بطول 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ إجمالي 8 دورات بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ دورة واحدة بدرجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ 4 درجات مئوية للثبات.
      ملاحظة: يجب تحديد الرقم الأمثل للدورة بناء على نوع الخلية، ومحتوى الحمض النووي الريبي، والعدد الابتدائي للنوى. في هذه التجربة، أجريت 8 دورات تضخيم.
   3. تنقية cDNAs المضخمة
      1. الانتقاء بحجم مزدوج وتنقية الحمض النووي بواسطة خرز بارامغناطيسي (0.6X، 2.0X) كما هو موضح في الخطوة 6.1.3. أضف 60 ميكرولتر من خرزات بارامغناطيسية (0.6X) إلى كل عينة وامزج عن طريق التوصيل بالماصات. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع المغناطيس على المحلول حتى يصفى الماء.
      2. نقل وتوفير 75 ميكرولتر من المادة الفائقة في أنبوب جديد دون إزعاج الحبيبة. حافظ على درجة حرارة الغرفة.
         تحذير: لا تتخلص من السوبرناتانت، لأنه يحتوي على حمض نووي مثري لأجزاء أقصر ستستخدم لإنشاء مكتبة الباركود المكانية.
      3. أزل المادة الفائقة المتبقية من الحبيبة. اغسله ب 80٪ إيثانول مرتين كما هو موضح في الخطوة 6.1.3.
      4. أضف 40.5 ميكرولتر من المخزن EB إلى الأنبوب وامزجه عن طريق التقطيع. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضعه على المغناطيس حتى يصفى المحلول.
      5. نقل 40 ميكرولتر من cDNA المضخم إلى أنبوب جديد. احتفظ بها على الثلاجة لتحضير مكتبة تعبير جيني مفهرسة.
         ملاحظة: هذا الجزء يثري الحمض النووي بالنسبة للحجم النموذجي للcDNA.
   4. تنقية الحمض النووي للرموز الشريطية المكانية المضخمة
      1. أضف 70 ميكرولتر من الخرزات البارامغناطيسية (2.0X) إلى 75 ميكرولتر من المادة الفائقة المحفوظة سابقا (الخطوة 6.3.3.2). اخلط بالإيبوبتي وادور لفترة وجيزة. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب على المغناطيس حتى يتخلص المحلول. أزل السوبرناتانت.
      2. اغسله ب 80٪ إيثانول مرتين كما هو موضح في الخطوة 6.1.3.
      3. أضف 40.5 ميكرولتر من المخزن EB إلى الأنبوب وامزجه عن طريق التقطيع. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضعه على المغناطيس حتى يصفى المحلول.
      4. نقل 40 ميكرولتر من حمض نووي الباركود المكاني المضخم والمنقي إلى أنبوب جديد. تخزين عند −20 درجة مئوية للتوليد التالي من مكتبة الباركود المكانية المفهرسة.
   5. تحليل أحجام cDNA بواسطة محلل الشظايا. امزج 1 ميكرولتر من cDNA المضخم مع 1 ميكرولتر من مخزن TE منخفض. شغل الحمض النووي المخفف بواسطة محلل الشظايا كما هو موضح في الخطوة 6.2.1.
   6. إعداد مكتبة تعبير جينات مفهرسة
      1. نقل 10 ميكرولتر من cDNA المضخم (الخطوة 6.3.3.5) إلى أنبوب جديد. أضف 25 ميكرولتر من المخزن EB و15 ميكرولتر من خليط التجزئة. اخلط عن طريق استخدام الماصات على الثلج. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة وانقل الأنبوب إلى جهاز الدورة الحراري المبرد مسبقا عند 4 درجات مئوية.
      2. الحضانة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 65 درجة مئوية) عن طريق بدء البروتوكول التالي: دورة واحدة بطول 32 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورة واحدة بطول 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ 4 درجات مئوية للثبات.
      3. اختيار حجم مزدوج وتنقية الحمض النووي بواسطة خرز بارامغناطيسي (0.6X، 0.8X) كما هو موضح في الخطوة 6.1.3. أضف 50.5 ميكرولتر من المخزن الكهربائي وامزجه بالمزج بالمزاج. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضعه على المغناطيس حتى يصفى المحلول.
      4. نقل 50 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب جديد. أضف 50 ميكرولتر من خليط ربط المحول وامزج عن طريق التوصيل بالماصات. استدار للحظة. الحضانة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 30 درجة مئوية) مع البروتوكول التالي: دورة واحدة بدرجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة و4 درجات مئوية للحضن.
      5. تنقية الحمض النووي بواسطة خرز مغناطيسي (0.8X) كما هو موضح في الخطوة 5.3.5. أضف 30.5 ميكرولتر من مخزن المخزن الكهربائي وامزج عن طريق التوصيل بأنبوب التقطيع. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضعه على المغناطيس حتى يصفى المحلول. نقل 30 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب جديد.
      6. فهرس PCR لمكتبة التعبير الجيني. أضف 50 ميكرولتر من خليط الأمبير وأضف 20 ميكرولتر من مجموعة TT ذات المؤشر المزدوج A إلى كل عينة.
      7. الحضانة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 105 درجة مئوية) مع البروتوكول التالي: دورة واحدة بطول 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ بمجموع 11 دورة بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 54 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية؛ دورة واحدة بدرجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ 4 درجات مئوية للثبات.
         ملاحظة: يجب تحديد العدد الأمثل للدورة بناء على نوع الخلية، ومحتوى الحمض النووي الريبي، وعدد النوى الابتدائي. في هذه التجربة، تم استخدام ما مجموعه 11 دورة تضخيم.
      8. اختيار حجم مزدوج وتنقية الحمض النووي بواسطة خرز بارامغناطيسي (0.6X، 0.8X) كما هو موضح في الخطوة 6.1.3. أضف 35.5 ميكرولتر من المخزن EB إلى الأنبوب وامزج عن طريق التقطيع. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. لف قليلا وضعه على المغناطيس حتى يصفى المحلول.
      9. نقل 35 ميكرولتر من مكتبة تعبير الجينات المنقاة والمفهرسة إلى أنبوب جديد.
4. تحليل توزيع حجم الحمض النووي في مكتبة التعبير الجيني. امزج 1 ميكرولتر من حمض نووي المكتبة مع 1 ميكرولتر من مخزن TE منخفض. أجر الحمض النووي المخفف كما هو موضح في الخطوة 6.2.1. (الشكل 3A).
5. إعداد مكتبة الباركود المكانية المفهرسة
   1. جهز ما مجموعه 100 ميكرولتر من خليط PCR بمؤشر العينة كما يلي: 50 ميكرولتر من خليط الأمبير (من مجموعة باركود الميزة GEM-X Single Cell 3'، 25 ميكرولتر من مخزن EB، 20 ميكرولتر من البرايمر من مجموعة TT Plate ذات المؤشر المزدوج A، و1 ميكرولتر من حمض نووي الباركود المكاني المنقى (الخطوة 6.3.4.4) مخفف في 4 ميكرولتر من مخزن EB.
   2. الحضانة في جهاز دورة حراري (درجة حرارة الغطاء عند 105 درجة مئوية) مع البروتوكول التالي: دورة واحدة بطول 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ بمجموع 7 دورات بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، و54 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ 4 درجات مئوية للثبات.
   3. تنقية الحمض النووي بواسطة خرز بارامغناطيسي (1.2X) كما هو موضح في الخطوة 5.3.5. أضف 35.5 ميكرولتر من مخزن EB إلى الأنبوب وامزجه عن طريق الطباعة بالماصات. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب على المغناطيس حتى يصبح المحلول شفافا.
   4. نقل 35 ميكرولتر من حمض نووي مكتبة الباركود المكاني المنقاة والمفهرسة إلى أنبوب جديد. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو عند −20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.
6. تحقق من توزيع أحجام الحمض النووي في مكتبة الباركود المكانية المفهرسة. امزج 1 ميكرولتر من حمض نووي مكتبي منقى مع 1 ميكرولتر من مخزن TE منخفض. شغل الحمض النووي المخفف بواسطة محلل الشظايا كما هو موضح في الخطوة 6.2.1 (الشكل 3A).

الشكل 3: تقييمات مراقبة الجودة للمكتبات المفهرسة. (أ) ملفات تعريف الحجم في الحمض النووي المضخم والمكتبات المفهرسة. يتم تحليل الحمض النووي بواسطة محلل شظايا لتقييم جودة الحمض النووي وتوزيع حجمه. تعرض الملفات الشخصية الممثلة لمكتبة CUT&Tag المفهرسة، والحمض النووي المضخم المستخدم في التعبير الجيني وإعداد مكتبة الباركود المكانية، ومكتبة التعبير الجيني المفهرسة، ومكتبة الباركود المكانية المفهرسة. (ب) يتم تحليل مكتبة CUT&Tag بواسطة qPCR لتقييم إثراء منطقة جينومية إيجابية ل H3K27ac (أي ACTB) فوق إشارة خلفية سلبية ل H3K27ac (أي T1 وموقع بين الجينات). يحسب فرق الطية بين المناطق الموجبة والسالبة كإثراء²¹. يعتبر إثراء الطية الأكبر من 10 مثاليا في هذا الاختبار²⁰. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

7. ترتيب المكتبات

1. تسلسل مكتبة الباركود المكانية تريكر على عمق 5,000 زوج قراءة لكل نواة يتم التقاطها.
2. تسلسل مكتبة H3K27ac CUT&Tag على عمق 25,000 زوج قراءة لكل نواة تم التقاطها.
3. تسلسل مكتبة تعبير الجينات على عمق لا يقل عن 20,000 زوج قراءة لكل نواة تم التقاطها.

8. المعلوماتية الحيوية وتحليل البيانات

1. معالجة تعبير الجينات وقراءات CUT&Tag باستخدام Cell Ranger ARC v2.0.2 مع --min-atac-count=100 و --min-gex-count=1000. دمج مخرجات Cell Ranger ARC مع معلومات الباركود الخاص ب Trekker باستخدام خط أنابيب Trekker v1.3.0 مع المعلمات الافتراضية لتعيين المواقع المكانية.
2. قم بإجراء مراقبة الجودة باستخدام Signac. تمت إزالة الخلايا التي استوفت أيا من المعايير التالية من التحليل اللاحق: بالنسبة ل CUT&Tag، كان إجمالي عدد الشظايا ≥ 1,000,000 أو ≤ 100، وتم تخصيب TSS ≤ 2؛ بالنسبة للتعبير الجيني، ≥ إجمالي عدد الجينات المكتشفة 100,000 أو ≤ 1,000، وإجمالي عدد الجينات المكتشفة ≥ 10,284 أو ≤ 200.
3. إزالة الدوبلتات باستخدام scDblFinder للتعبير الجيني وAMULET لتقنية CUT&Tag. تم تصنيف الخلايا التي تستوفي أيا من المعايير التالية كخلايا مزدوجة: (1) درجة scDblFinder ≥ 0.6؛ (2) درجة scDblFinder ≥ 0.3 وAMULET ≤ 0.01؛ و(3) في مجموعات ذات نسبة عالية من الدوبلت.
4. تطبيع بيانات التعبير الجيني باستخدام LogNormalize وبيانات CUT&Tag باستخدام TF-IDF. حساب تضمين LSI ل RNA PCA و CUT&Tag، باستخدام أبعاد LSI من 2 إلى 50 لنمط الكروماتين. قم بإنشاء رسم بياني مرجح لأقرب جار باستخدام FindMultiModalNeighbours وإنشاء تضمينات UMAP بناء على رسم الجيران متعدد الوسائط.
5. قم بالتعليق على بيانات تريكر بعد مراقبة الجودة باستخدام نقل تسميات Seurat بناء على FindTransferAnchors واستراتيجية تعيين إسقاط PCA مع المعلمات الافتراضية. تم استخدام بيانات scRNA-seq من أطلس ABC (الإصدار 20230630) كمرجع. تمت إزالة توقعات نوع الخلايا غير المتوافقة مع تشريح الأنسجة المعروف أثناء التنظيم اليدوي.
   ملاحظة: تتوفر السكريبتات الخاصة بتحليل المعلوماتية الحيوية على GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

باستخدام مقطع إكليلي (سمك 25 ميكرومتر، تغطية تقارب 70٪ من بلاطة مكانية بحجم 10 × 10 مم) من نسيج دماغ الفأر المجمد حديثا، أسفر سير العمل الموضح هنا باستمرار عن 50,100 نواة عالية الجودة (SD = 12,200، n = 8)، وهو ما يكفي للتحليل المتعدد الخلية أحادية الأبعاد في الأسفل (الشكل 1). بعد ترميز تريكر المكاني لقسم الأنسجة، تم عزل النوى باستخدام تفكك لطيف للأنسجة وتم تنقيتها أكثر باستخدام مجموعة العزل ذات النواة الواحدة Invent. أدى هذا الإجراء إلى تقليل الحطام وانخفاض مستويات التجمع النووي، مما أنتج تحضيرات نووية مناسبة للاختبارات على الخلايا الواحدة. تظهر الصور التمثيلية للنوى المعزولة في الشكل 2.

بالنسبة لاختبارات النواة الواحدة في المرحلة اللاحقة، بما في ذلك تحليل الأنماط متعددة الأبعاد بنظام CUT&Tag (CUT&Tag + تعبير الجين)، تم معالجة حوالي 50,000 نواة هنا عادة. لتعظيم التعافي النووي، تم تنفيذ بروتوكول CUT&Tag منخفض المدخلات مبسط ومبسط باستخدام استهداف وتصنيف الأجسام المضادة وpA/Tn5 مباشرة، مما قلل من أوقات الحضانة وخطوات الغسل¹⁹. باستخدام هذا النهج، تم استرداد حوالي 25,000 نواة موسومة، ما يعادل متوسط عائد 48.3٪ (SD = 6.1، n = 3). تم استخدام هذه النوى لاحقا في الترميز الشريطي لخلية واحدة باستخدام خرزات الجل 10x من Genomics Chromium Multiome. لتوليد GEM، تم استهداف حوالي 15,000 نواة مع توقع استعادة ~10,000 نواة مفهرسة مكانيا بعد ترشيح عالي الجودة. استنادا إلى فك الرموز المكانية من تريكر، يمكن تخصيص 81.3٪ من النوى (SD = 9، n = 3) من مجموعة بيانات الخلية الواحدة بثقة إلى مواقع مكانية داخل البلاطة.

ينتج سير عمل الوسائط المتعددة المكانية بين تريكر وCUT&Tag ثلاث مكتبات مفهرسة: مكتبات CUT&Tag، والتعبير الجيني، ومكتبات الباركود المكاني. تم تقسيم الحمض النووي المكبر مسبقا إلى جزئين، كل منهما يستخدم لتحضير المكتبة وفقا لكيمياء التقاط الأهداف على خرزات الهل. تم تضخيم مكتبات CUT&Tag مباشرة من الحمض النووي المضخم مسبقا وأظهرت توزيعات حجم الشظايا المميزة لتصنيف CUT&Tag المقابلة للحمض النووي الخالي من النيوكليوسومات والنوكليوسومية (الشكل 3A). أظهرت المكتبة إثراء جيدا لموقع Actb الإيجابي H3K27ac على المواقع الجينومية^{السلبية} H3K27ac ^20,21 (أي فرق 68 ضعفا، متجاوزا الحد الأقصى البالغ 10 أضعاف الذي تم تحديده سابقا لتحليل تسلسل الكروماتين المناعي ل H3K27ac²⁰) (الشكل 3B). بالنسبة لمكتبات التعبير الجيني والباركود المكاني، تم تضخيم الحمض النووي المضخم مسبقا أولا وفقا لبروتوكول تضخيم cDNA من الجينوم 10x ثم تم تقسيمه إلى جزئين بناء على حجم الشظية باستخدام تنقية خرزات بارامغناطيسية. تم إعداد مكتبة الباركود المكانية المفهرسة من الجزء المغني للأجزاء الأقصر وأظهرت ذروة حادة عند حجم الشظية المتوقع. أظهرت مكتبات التعبير الجيني توزيعا مميزا للحجم يتركز حول شظايا cDNA المضخمة (الشكل 3A).

الشكل 4: تمثيل خلوي واحد ومكاني لاختبار Trekker–CUT&Tag المكاني متعدد النقاط في نسيج دماغ الفأر. (أ) تحديد أنواع الخلايا من خلال تحليل الخلية الواحدة. تظهر مخططات تقريب وإسقاط متعدد الأبعاد الموحد (UMAP) مجموعات خلايا مشروحة مشتقة من H3K27ac CUT&Tag وحده، والتعبير الجيني فقط، ومجموعة البيانات المتعددية المتكاملة (CUT&Tag + تعبير جيني). (ب) التمثيل المكاني لبيانات المجموعات المتعددة المكانية ل Trekker–CUT&Tag. يتم تعيين النوى من مجموعة البيانات المتدرجة متعددة الأبعاد إلى إحداثيات مكانية باستخدام رموز تريكر، مما يكشف عن توزيعات منظمة تشريحية لأنواع الخلايا عبر قسم نسيج دماغ الفأر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم إجراء تسلسل ورسم خرائط مكتبات CUT&Tag وتعبيرات الجينات باستخدام Cell Ranger ARC v2.0.2 وفقا لإرشادات الجينوم 10x، بينما تمت معالجة مكتبات الباركود المكاني باستخدام Trekker v1.3.0 وفقا لتوصيات Takara Treker. تم تطبيق خيارات تعيين ATAC-seq أحادية الخلية المقترحة على مكتبات CUT&Tag. تم توليد مجموعات بيانات لنوى واحدة فقط لبروتوكول CUT&Tag، وللتعبير الجيني فقط، وللمجموعة المجمعة (CUT&Tag + تعبير جيني). تم تصفية الخلايا التي لديها إجمالي UMIs إما ل CUT&Tag (≥ 1,000,000 أو ≤ 100) أو تعبير جيني (≥ 100,000 أو ≤ 1000) باستخدام Signac²². تم إجراء التنبؤ بالمزدوج باستخدام مزيج من scDblFinder²³ للتعبير الجيني وAMULET²⁴ للتعبير الجيني وCUT&Tag. تمت إزالة الخلايا التي تستوفي أحد المعايير التالية: 1) scDblFinder.score > 0.6؛ 2) scDblFinder.score بين 0.3 و0.6، وamulet.score < 0.01. تم إجراء شرح نوع الخلية باستخدام FindTransferAnchors²⁵ من Seurat استنادا إلى البيانات المرجعية²⁶ من أطلس خلايا الدماغ ألين. بالنسبة لمكتبة التعبير الجيني في هذه الدراسة، كان متوسط عدد الجينات في كل خلية 15,378، ومتوسط عدد الجينات لكل خلية 4,378. بالنسبة لمكتبة CUT&Tag، تم اكتشاف 11,860 خلية، بمتوسط 6,631 قطعة عالية الجودة لكل خلية ودرجة إثراء TSS تبلغ 7.66. بالنسبة لمكتبة الباركود المكانية تريكر، تم تخصيص مواقع مكانية ل 92.43٪ من النوى، و51.54٪ من النوى في موقع مكاني واحد. تتوفر بيانات التسلسل الخام والبيانات المعالجة من التحليلات الثانوية عبر GEO تحت رقم الإدخال GSE327406. الكائن الأخير المشروح بعد QC متوفر على زينودو تحت رقم الإدخال 19475899. تظهر الشكل 4A تضمين UMAP التمثيلي مع تعليقات من نوع الخلية. من خلال ربط الباركود الخلوي الواحد مع الرموز المكانية، تم تعيين النوى الفردية إلى مواقعها المكانية داخل النسيج لإنشاء خريطة مكانية (الشكل 4B). تتطابق هذه الخريطة بشكل وثيق مع الميزات التشريحية التي لوحظت في الأقسام المجاورة وتتوافق مع قسم الدماغ الإكليلي في أطلس الدماغ^{ألين 27}، وهو مرجع قياسي لتشريح دماغ الفأر. مكن التحليل المشترك للتعبير الجيني المكاني وملفات H3K27ac بدقة خلية واحدة من تحديد أنواع الخلايا الرئيسية في الدماغ وكشف عن أنماط منظمة تشريحية لتوزيع الخلايا عبر قسم الأنسجة.

Discussion

يصف هذا البروتوكول سير عمل متعدد الوسائط المكاني من Trekker–CUT&Tag يدمج الترميز الباركوزي المكاني، وتحليل CUT&Tag منخفض الإدخال ل H3K27ac، والتقاطها المتزامن لعدة أهداف جزيئية على خرزات الجيلام متعددة الخلايا أحادية الخلية من Genomics 10x، وتحضير مكتبة لاحقة لتسلسل Illumina. من خلال الربط بين الفهرسة المكانية مع قراءات الجينوم والنسخ الوراثي لخلية واحدة، يعالج هذا النهج محدودية أساسية في اختبارات الخلايا المتعددة التقليدية أحادية الخلية، والتي تفتقر إلى السياق الأنسجي الأصلي. تثبت هذه الدراسة بنجاح جدوى التنميط المكاني متعدد الأنماط بتقنية CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + تعبير جيني) وتؤسس أساسا للتنميط المكاني لأهداف التعبير الجيني والتنظيمية مثل علامات الهيستون والبروتينات المرتبطة بالكروماتين.

يعد التحكم الدقيق في الجودة في مراحل متعددة من سير العمل أمرا أساسيا لتنفيذ هذا سير العمل بنجاح (الشكل 1). على الرغم من أن الإجراء الموضح هنا يبدأ بخطوات ما بعد القطع، إلا أن جودة قسم الأنسجة نفسها حاسمة لتحقيق أفضل النتائج. يجب تعديل سمك المقطع بناء على نوع النسيج والخلوية المتوقعة. خلال تفكك الأنسجة وعزل الأنوية، يعد تعظيم عائد النوى مع الحفاظ على سلامة النواة أمرا بالغ الأهمية لأداء اختبارات التنوع الأحادية الخلية المبنية على تريكر. قد ينتج انخفاض إنتاج النوى عن تفكك الأنسجة غير المثالي، أو عزل غير فعال للنوى، أو سمك غير كاف في المقطع. يمكن أن ينشأ ضعف السلامة النووية من الاضطرابات الميكانيكية المفرطة، أو فترات معالجة طويلة، أو الإفراط في التحليل. يمثل عزل النوى نقطة رئيسية لحل المشكلات لتنفيذ سير عمل الخلايا المتعددة المعتمد على تريكر. لذلك، يوصى بشدة بتحسين بروتوكول عزل النوى بشكل خاص بالأنسجة قبل بدء اختبار التنوع الخلوي الواحد القائم على تريكر. يجب تقييم النوى المعزولة كميا ونوعيا. يوفر عد النوى باستخدام الأصباغ النووية تقديرا للإنتاجية، بينما يسمح الفحص المجهري بتقييم سلامة الغشاء النووي، والتجمع، ووجود الحطام غير النووي. بعد إعداد المكتبة، يجب تقييم جميع المكتبات من حيث توزيعات حجم الشظايا وغياب مقاييس المحولات. بالنسبة لمكتبات CUT&Tag، يجب تقييم إثراء المناطق الجينومية المستهدفة مقارنة بالخلفية بواسطة PCR الكمي، مما يوفر مؤشرا مبكرا لخصوصية التحليل وجودة المكتبة العامة قبل التسلسل. يعد التحكم في الجودة بعد التسلسل مهما بنفس القدر لتفسير بيانات المجموعات المكانية المتعددة بدقة. يجب تقييم مقاييس مثل معدلات رسم الخرائط، عدد الشظايا لكل نواة، إثراء موقع بدء النسخ، درجات الشظايا في ذروة CUT&Tag، تعقيد الجينات، وعمق القراءة لكل خلية وفقا للإرشادات الموصى بها من 10x Genomics وTakara Trekker. التقييم المشترك لهذه المقاييس عبر كل من الأساليب فوق الجينية والنقل الجيني، يمكن من تحديد القطع الأثرية التقنية ويضمن تكامل موثوق للمعلومات المكانية وفوق الجينية والنسخ.

بينما تم إثبات جدوى نهج الباركود القائم على تريكر مع اختبار متعدد القيم أحادي الخلية CUT&Tag في هذه الدراسة، إلا أن النهج الموصوف له أيضا بعض القيود. على سبيل المثال، الطريقة حاليا مقصورة على الأنسجة الطازجة المجمدة، ولم يتم إثبات جدواها إلا في تحليل تعديل هيستون واحد (H3K27ac) في نوع نسيج واحد (دماغ الفأر) دون وجود نسخ بيولوجية. علاوة على ذلك، يعتمد النهج على منصتين تجاريتين مملوكتين (Takara Trekker و10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). سيكون من الضروري إجراء تقييم إضافي عبر أنواع الأنسجة المتنوعة وعلامات فوق جينية إضافية لتقييم التطبيق الأوسع والأداء والتعميم وقابلية التكرار لهذه التقنية.

باختصار، يظهر بروتوكول التنوع المكاني Trekker–CUT&Tag المعروض هنا القدرة على التوصيف المشترك المكاني لخلية واحدة للسمات فوق الجينية والترانسكريبتومية. من خلال دمج الترميز المكاني مع الكيمياء متعددة الخلايا الواحدة المعروفة، يمكن من تحقيق ميكانيكي لتنظيم الجينات داخل بنية الأنسجة السليمة ويوفر منصة قوية لتطبيقات علم الأحياء المكاني المستقبلية. تشمل الاستخدامات المحتملة البارزة تقييم تأثير مختلف المحفزات التجريبية والبيئية على التحكم فوق الجيني في التعبير الجيني في أنواع خلايا محددة—على سبيل المثال، يمكن تحليل تأثيرات التحفيز العصبي في أنواع عصبية محددة في الجهاز العصبي المركزي والطرفي، أو يمكن الكشف عن تأثير الخلايا المناعية المؤيدة والمضادة للالتهابات على الخلايا المجاورة في الأمراض الالتهابية والسرطانات.