في المختبر التحليل الوظيفي لخلايا التائية التنظيمية: التركيز على التكاثر والتمايز

ملخص

يوفر هذا البروتوكول استراتيجية زراعة مشتركة في المختبر لدراسة تأثيرات الخلايا التائية التنظيمية على تكاثر وتمايز الخلايا التائية الفعالة.

الملخص

تلعب خلايا التاي التنظيمية (Treg) أدوارا رئيسية في الحفاظ على التوازن المناعي. ترتبط الشذوذات في وظيفة خلايا التريج بأمراض مختلفة، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية، ورفض زراعة الأعضاء، والعدوى، والسرطان. يعتبر التلاعب بخلايا التريج استراتيجية علاجية محتملة لعلاج الأمراض الالتهابية، بما في ذلك اضطرابات المناعة الذاتية، ورفض زراعة الأعضاء الصلبة، ومرض الطعم ضد المضيف، والأمراض التحسسية. تقيم اختبارات كبح خلايا التريج الكلاسيكية في المختبرات بشكل رئيسي التأثير التثبيطي لخلايا التريج على تكاثر خلايا T (Teff) المؤثرة. ومع ذلك، بالإضافة إلى التكاثر، فإن تمايز الخلايا التائية مهم لخلايا تائية لأداء وظائفها المناعية. لذلك، يوفر هذا البروتوكول اختبارا معدل لقمع خلايا التريج في المختبر لدراسة تأثيرات خلايا التريج على تكاثر وتمايز خلايا التيف. في هذا البروتوكول، يتم أولا تقديم تحضير خلايا تريغ الفأرية والخلايا التائية الساذجة، يليه استراتيجية الزراعة المشتركة لدراسة التأثيرات التنظيمية لخلايا التريج على تكاثر وتمايز خلايا التيف، بما في ذلك خلايا Th1 وTh17، وأخيرا يتم تقديم استراتيجية التلوين لقياس تدفق الخلايا بعد الزراعة المشتركة. يمكن استخدام هذا التحليل الوظيفي في المختبر لخلايا التريج لدراسة تأثيرات خلايا التريج على تكاثر واستقطاب الخلايا التائية.

المقدمة

تعد خلايا التستوستيرون التنظيمية CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ وسطاء مهمة للتوازن المناعي¹. خلايا التريج تثبط الاستجابات المناعية المفرطة وتحافظ على تحمل المناعة الذاتية، مما يمنع ردود الفعل المناعية من إلحاق الضرر بالأنسجة والأعضاء الطبيعية². يعتبر التلاعب بخلايا التريج استراتيجية علاجية محتملة لعلاج الأمراض الالتهابية مثل اضطرابات المناعة الذاتية، ورفض زراعة الأعضاء الصلبة، ومرض الطعم ضد المضيف، والأمراض التحسسية ^3,4,5. وفي الوقت نفسه، يعتبر تثبيط وظيفة خلايا التريج استراتيجية فعالة لتنشيط المناعة المضادة للأورام ^6,7. بحثت الدراسات السريرية في العلاج التنظيمي التبني لخلايا التائية أو علاج IL-2 بجرعة منخفضة لأمراض المناعة الذاتية، وزراعة الأعضاء الصلبة، ومرض الطعم ضد المضيف ^8,9,10. علاوة على ذلك، تحظى الدراسات على خلايا تريغ الهندسية، بما في ذلك خلايا مستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR)-Treg وخلايا مستقبلات الخلايا التائية (TCR)-Treg، باهتمام متزايد^11,12.

حتى الآن، لم يتم ترسيخ علاج خلايا التريج على نطاق واسع في العلاج السريري الروتيني. لدعم التطبيق السريري لعلاج خلايا التريج، من المهم البحث المنهجي وتقييم وظائفه. استراتيجية شائعة لتقييم وظائف الخلايا التائية التنظيمية في المختبر هي اختبار كبت التريج في المختبر ،^والذي يمكنه اكتشاف الوظيفة القمعية لخلايا التريج على تكاثر الخلايا التائية (Teff) الفعالة. ومع ذلك، فإن اختبار التثبيط القياسي في المختبر لا يقيم تمايز خلايا تيف. إذا أمكن تقييم تكاثر وتمايز الخلايا التائية الفعالة في نفس الوقت، يمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول وظيفة الخلايا التائية التنظيمية.

هنا، نقدم اختبار معدل لقمع خلايا التريج في المختبر ، يسمى "التحليل الوظيفي في المختبر " لخلايا التريج" (الشكل 1). يوفر هذا البروتوكول استراتيجية زراعة مشتركة في المختبر لدراسة تأثيرات خلايا التريج على تكاثر وتمايز خلايا تيف.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في مستشفى غرب الصين، جامعة سيتشوان (رقم الموافقة 20250814006، 20211212A). جميع الفئران المستخدمة في هذا التجربة كانت على خلفية جينية C57BL/6.

1. تحضير الحلول

1. تحضير محلول فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS): 1× PBS يحتوي على 0.5٪ ألبومين مصل البقري (BSA).
2. تحضير مخزن فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS): 1× PBS يحتوي على 0.5٪ BSA و2 ملليمولار إيثيلينيديامين رباعي الأسيتيك (EDTA).
3. وسط زراعة الخلايا جاهز: وسط RPMI 1640 يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1 ملليمولار بيروفات الصوديوم، 2 ملليمول إل-جلوتامين، 10 ملليمولار HEPES، 55 ميكرومولار β-ميركابتوإيثانول، 100 يوروم/مل بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين.

2. تحضير الخلايا اللمفاوية للفئران C57BL/6

1. خذ الطحال والعقد اللمفاوية الطرفية (LNs) لفأر C57BL/6 عمره 6–8 أسابيع (ذكر أو أنثى) في ظروف معقمة وضعها في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل مع 5 مل من مخزن FACS.
   ملاحظة: يجب إجراء تشريح الطحال والنيبل الخفيف وفقا للإجراءات القياسية.
2. ضع مصفاة خلايا بحجم 70 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل، ثم ضع الطحال والنوابل الخفية على المصفاة، واستخدم مكبس حقنة بسعة 5 مل لطحن الأنسجة بلطف لمدة دقيقة واحدة. أثناء الطحن، اشطف المصفاة 3 مرات باستخدام مخزن FACS. تأكد من طحن جميع الأنسجة بالكامل وشطف الخلايا في أنبوب الطرد المركزي. بعد الطحن، أزل المصفاة.
3. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية، 350 × جرام لمدة 7 دقائق.
4. قم بإزالة السوبرناتانت، وأعد تعليق حبيبة الخلية في 3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء، واترك التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3–5 دقائق.
5. أضف فورا مخزن FACS إلى أنبوب الطرد المركزي إلى حجم 15–20 مل لإنهاء التحلل، وقم بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية، 350 × جرام لمدة 7 دقائق.
6. أزل السوبرناتان، أضف 10 مل من محلول FACS، وأعد تعليق حبيبات الخلية بلطف.
7. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية واستخدم صبغة التربان الزرقاء لحساب إجمالي الخلايا اللمفاوية الحية.
   ملاحظة: هذه الخلايا هي لمفاويات CD45.2⁺ .

3. تحضير الخلايا اللمفاوية للفئران CD45.1

1. خذ الطحال والنيبوبات الصغيرة لفأر CD45.1 عمره 6–8 أسابيع (ذكر أو أنثى) تحت ظروف معقمة وضعها في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل مع 5 مل من محلول FACS.
2. جهز الخلايا اللمفاوية من فأر CD45.1 باتباع نفس الخطوات الموضحة أعلاه.
   ملاحظة: هذه الخلايا هي من خلايا الدم اللمفاوية CD45.1⁺ .

4. تحضير خلايا T ساذجة CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

ملاحظة: العملية بأكملها تستخدم مجموعة عزل الخلايا T CD4⁺CD62L⁺ لأجهزة MAC. يتم تبريد مخزن MACS مسبقا عند 4 درجات مئوية، وجميع ظروف الطرد المركزي هي 4 درجات مئوية، 350 × جرام لمدة 7 دقائق.

1. اجمع تعليق الخلية من فئران C57BL/6، وقم بالطرد المركزي وتخلص من المادة الفائقة، وأضف 400 ميكرولتر من مخزن MACS و100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لخلايا T من CD4⁺ إلى أنبوب الطرد المركزي لكل 1 × 10⁸ خلايا إجمالية أولية. اخلط بلطف وحضن عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في الظلام.
2. أضف 300 ميكرولتر من مخزن MACS و200 ميكرولتر من حبيبات مضادة للبيوتين إلى أنبوب الطرد المركزي من الخطوة 4.1 لكل 1 × 108 خلايا إجمالية أولية. اخلط بلطف وحضن الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام.
3. أضف 10 مل من مخزن MACS وجهاز الطرد المركزي (MACS)، ثم تخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من مخزن MACS.
4. ضع عمود LS على فاصل مغناطيسي الفرز المناسب لنظام MACS. استخدم 3 مل من مخزن MACS لشطف العمود. انتظر حتى يفرغ المخزن في العمود بالكامل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
   ملاحظة: أقصى سعة تحميل خلية لعمود LS هي 2 × 10⁹ خلايا، تشمل الخلايا الموجبة والسالبة، وأقصى عدد من الخلايا الموجبة التي يمكنها التقاطها هو 1 × 10⁸. عادة، الفأرة الواحدة تحتاج فقط إلى عمود LS واحد هنا.
5. قم بتحميل تعليق الخلية من الخطوة 4.3 على عمود LS. عندما يتدفق نظام تعليق الخلية بالكامل إلى العمود، استخدم 3 مل من مخزن MACS لغسل العمود. اجمع كل السائل المتدفق في أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل.
   ملاحظة: هذه هي إجمالي خلايا CD4⁺CD25^– T.
6. قم بطرد المركزي بإجمالي خلايا CD4⁺CD25^– T التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.5، وتخلص من الفائق، والحصول على الحبيبات الخلوية.
7. أضف 800 ميكرولتر من مخزن MACS و200 ميكرولتر من حبات CD62L الدقيقة إلى حبيبات الخلية لكل 1 × 10⁸ خلايا إجمالية ابتدائية. اخلط بلطف وحضن الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام.
8. أضف 10 مل من مخزن MACS إلى أنبوب الطرد المركزي، ثم استخدم الطرد المركزي وتخلص من الفائق، وأعد تعليق حبيبة الخلية في 500 ميكرولتر من مخزن MACS.
9. ضع عمود MS على فاصل مغناطيسي مناسب لفرز MACS واستخدم مخزن MACS بسعة 1 مل لغسل العمود.
10. قم بتحميل نظام التعليق الخلوي على عمود ال MS. عندما يتدفق نظام التعليق بالكامل إلى العمود، استخدم 1 مل من مخزن MACS لغسل العمود مرتين.
11. قم بإزالة عمود MS من المفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل. أضف 1 مل من مخزن MACS إلى العمود وادفع المكبس فورا بقوة لتطهير الخلايا الموسومة بحبيبات مغناطيسية.
12. عد الخلايا، وقم بالطرد المركزي وتخلص من الفائق، وأعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط الزرعة، وحافظ على الأنبوب على الثلج.
    ملاحظة: هذه الخلايا هي خلايا T ساذجة CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ . عادة، يمكن تنقية حوالي 8 × 10⁶ إلى 1 × 10⁷ CD4⁺CD25^–CD62L⁺ من فأرة واحدة؛ يمكن أن يؤدي إدراج العقد اللمفاوية الطرفية إلى زيادة الإنتاجية.
13. حدد نقاء الخلايا المعزولة: خذ 5 × 10⁴ خلايا T معزولة CD4⁺CD62L⁺ وأعد تعليقها في محلول أجسام مضادة بسعة 50 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل.
    ملاحظة: جهز محلول الأجسام المضادة بإضافة الجسم المضاد للفأر CD4 PerCP-Cy5.5، والأجسام المضادة CD62L FITC، والأجسام المضادة CD25 PE المضادة للفأر إلى مخزن FACS بنسبة 1:100.
14. بعد الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام، أضف 1 مل من محلول FACS لغسل الخلايا. قم بعمل الطرد المركزي للخلايا، وإزالة الفائق، وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مخزن FACS.
15. اكتشاف نقاء العينات عن طريق قياس تدفق الخلية.
    ملاحظة: لتفاصيل تحليل مقياس تدفق السيلتومتر، يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم للجهاز أو البروتوكول¹⁴ المبلغ عنه سابقا. يجب أن تكون نقاء خلايا T الساذجة CD4⁺CD25^–CD62L⁺ أكثر من 95٪ في عينة الخلايا التائية المعزولة (الشكل 2).

5. تحضير خلايا CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ الغنية ب Treg وخلايا غير CD4⁺ الغنية بالخلايا العرضية للمستضدات

ملاحظة: تستخدم العملية بأكملها مجموعة عزل الخلايا التائية التنظيمية CD4⁺CD25⁺ ل MACS، وقد تم تحسين التعليمات في المجموعة للحصول على خلايا CD4+ غير غنية ب CD4⁺ وخلايا CD4⁺CD25⁺ غنية ب Treg في نفس الوقت. يتم تبريد مخزن MACS مسبقا عند 4 درجات مئوية، وجميع ظروف الطرد المركزي هي 4 درجات مئوية، 350 × جرام لمدة 7 دقائق.

1. اجمع تعليق الخلايا من فئران CD45.1، وقم بتشغيل الطرد المركزي، وتخلص من المادة الفائقة، وأضف 400 ميكرولتر من مخزن MACS المبرد مسبقا و100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لخلايا T التنظيمية CD4⁺CD25⁺ إلى أنبوب الطرد المركزي لكل 1 × 10⁸ خلايا أولية كلية. اخلط بلطف وحضن الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام.
2. بدون غسل، أضف مباشرة 380 ميكرولتر من مخزن MACS المبرد مسبقا، و200 ميكرولتر من حبيبات مضادة البيوتين، و20 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD25-PE لكل 1 × 10⁸ خلايا أولية كلية إلى أنبوب الطرد المركزي من الخطوة 5.1. اخلط بلطف وحضن الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
3. أضف 10 مل من مخزن MACS إلى أنبوب الطرد المركزي، الطرد المركزي، وتخلص من السوبرناتينت، ثم أعد تعليق الحبيبات الخلوية في 500 ميكرولتر من مخزن MACS لكل 1 × 10^{إلى 8} خلايا إجمالية أولية.
4. ضع عمود LD على فاصل مغناطيسي مناسب لفرز MACS وغسل العمود بسعة 2 مل من مخزن MACS. انتظر حتى يفرغ المخزن في العمود بالكامل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
5. قم بتحميل تعليق الخلية ببطء من الخطوة 5.3 إلى عمود LD. عندما يتدفق نظام تعليق الخلية بالكامل إلى العمود، اغسل العمود مرتين باستخدام مخزن MACS بسعة 2 مل. اجمع كل السائل المتدفق في أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل.
6. أزل عمود LD من الفاصلة المغناطيسية وضعه على أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل. أضف 3 مل من مخزن MACS إلى عمود LD، وادفع المكبس فورا لطرد الخلايا غير CD4⁺ الموسومة ب Microbeads. عد الخلايا، واستخدم الطرد المركزي، وأعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط زراعة الخلايا لتحقيق تركيز خلوي 1 ×^{10 7} خلايا/مل، وحافظ على الأنبوب على الثلج.
   ملاحظة: تتكون هذه الخلايا غير CD4⁺ بشكل رئيسي من خليات APC مثل البلعميات، الخلايا الشجرية، وخلايا B. في هذا البروتوكول، تستخدم هذه الخلايا كجزء غير CD4⁺ محظى ب APC.
7. قم بالطرد المركزي لإجمالي خلايا CD4⁺ T التي جمعت من الخطوة 5.5، ثم تخلص من الفائق، والحصول على الحبيبات الخلوية.
8. أضف 900 ميكرولتر من مخزن MACS و100 ميكرولتر من حبيبات مضادة للPE إلى حبيبات الخلية لكل 1 × 10⁸ خلايا إجمالية ابتدائية. اخلط بلطف وحضن الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
9. ضع عمود MS على فاصل مغناطيسي فرز MACS المناسب وشطف العمود بسعة 500 ميكرولتر من مخزن MACS المبرد مسبقا. انتظر حتى يفرغ المخزن في العمود بالكامل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
10. قم بتحميل تعليق الخلية ببطء من الخطوة 5.8 إلى عمود MS. عندما يتدفق نظام تعليق الخلية بالكامل إلى العمود، اغسل العمود مرتين باستخدام مخزن MACS بسعة 1 مل. اجمع السائل المتدفق في أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل.
    ملاحظة: الخلايا في سائل التدفق في هذا الوقت هي خلايا CD4⁺CD25^– T.
11. فصل عمود MS عن المفاصل المغناطيسي ووضعه فوق أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل. أضف 1 مل من مخزن MACS إلى العمود، ثم اضغط على المكبس فورا لاستعادة الخلايا الغنية ب Treg الموسومة بالخرزات المغناطيسية ^CD4+CD25⁺ .
12. بعد عد الخلايا، قم بطرد المركزي بنظام التعليق وإزالة السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبة في وسط زراعة كاف للحصول على تركيز نهائي 2 ×^{10 6} خلايا/مل، وحافظ على الأنبوب على الثلج.
    ملاحظة: هذه الخلايا هي خلايا غنية ب Treg CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ . عادة، يمكن تنقية حوالي 8 × 10⁵ إلى 1 × 10⁶ خلايا CD4⁺CD25⁺ من فأر واحد؛ يمكن أن يؤدي إدراج العقد اللمفاوية الطرفية إلى زيادة الإنتاجية.
13. حدد نقاء الخلايا المعزولة المغنية ب CD4⁺CD25⁺ ب Treg: خذ 5 ×^{10 خلايا} معزولة من ^CD4+CD25⁺ غنية ب Treg و5 × 10^{إلى 4 خلايا} غير غنية ب APC معزولة على التوالي، وأعد تعليقها في محلول أجسام مضادة بسعة 50 ميكرولتر.
    ملاحظة: جهز محلول الأجسام المضادة بإضافة الأجسام المضادة المضادة CD4 PerCP-Cy5.5 والجسم المضاد للفأر CD25 PE المضاد إلى مخزن FACS بنسبة 1:100. استخدم نفس الجسم المضاد ل الفأر CD25 PE هنا للتأكد من أن خلايا CD4⁺CD25⁺ معلمة بشكل كاف وأنه لا توجد خلايا T من ^CD4+CD25⁺ في الجزء غير CD4⁺ . لتحديد خلايا التريج بشكل أكثر دقة، يمكن أيضا إجراء صبغة داخل الخلايا بجسم مضاد مضاد للفئران Foxp3 PB.
14. بعد الحضانة التي تستمر 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام، أضف 2 مل من محلول FACS لغسل الخلايا. قم بعمل الطرد المركزي للخلايا، وإزالة الفائق، وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مخزن FACS.
15. اكتشاف نقاء العينات عن طريق قياس تدفق الخلية.
    ملاحظة: يجب أن يكون تكرار خلايا CD4⁺CD25⁺ ≥ 95٪ لضمان أن نقاء مجموعة الخلايا الغنية بالتريج يفي بالمتطلبات التجريبية (الشكل 2). يجب أن تحتوي الخلايا غير CD4⁺ المستخدمة كجزء مغني ب APC على لا يزيد عن 5٪ من خلايا T CD4⁺ (الشكل 2).

6. وسم خلايا ^CD4+ T الساذجة بصبغة تكاثر الخلايا

ملاحظة: جميع حالات الطرد المركزي هي 4 درجات مئوية، 350 × جرام لمدة 7 دقائق. مخزن PBS متوازن مسبقا لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. تجرى عملية وضع العلامات تحت حماية ضوئية لتجنب تبريد الصبغة.

1. خذ تعليق خلية T من ^CD4+ الساذج، ثم جهاز الطرد المركزي، ثم تخلص من الفائق، واحصل على الحبيبات المعدنية.
2. قم بتخفيف صبغة تكاثر الخلايا eFluor 450 في PBS للحصول على تركيز 20 ميكرومولار في درجة حرارة الغرفة.
3. أضف 0.5 مل من PBS لكل 1 × 10^{خلايا 7} . حافظ على إمالة الأنبوب بزاوية تقارب 45° وأعد تعليق الخلايا بلطف عن طريق التوصيل للأعلى والأسفل 50 مرة.
4. أضف كمية متساوية من محلول صبغة تكاثر الخلايا بسرعة إلى تعليق الخلية، بحيث يكون التركيز النهائي لصبغة تكاثر الخلايا 10 ميكرومول. حافظ على ميل الأنبوب عند زاوية تقارب 45° وامزج الخلايا عن طريق التوصيل بأنابيب لأعلى ولأسفل 50 مرة لضمان الاتصال الكامل بين الخلايا وصبغة تكاثر الخلية.
5. لف أنبوب الطرد المركزي فورا بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. قم بتدوير الخلايا بلطف كل 5 دقائق لمنع تجمع الخلايا.
6. أضف 10 مل من وسط زراعة الخلايا المبرد مسبقا إلى أنبوب الطرد المركزي، ثم قم بتدوير خفيف لإنهاء التلوين، ثم استخدم الطرد المركزي، وتخلص من السوبرناتانت.
7. أضف 5 مل من وسط زراعة الخلايا المبرد مسبقا إلى حبيبة الخلية، وجهاز الطرد المركزي، وتخلص من المادة الفائقة لغسل الخلايا.
8. أضف 5 مل من وسط زراعة الخلايا المبرد مسبقا إلى حبيبة الخلية مرة أخرى وأعد تعليق الخلايا.
9. عد الخلايا، وقم بعمل الطرد المركزي وتخلص من الفائق الطبيعي، وأعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط الزراعة لتحقيق تركيز خلوي 2 ×^{10 6} خلايا/مل، وحافظ على الأنبوب على الجليد.

7. إعداد التحليل الوظيفي في المختبر لخلايا Treg

1. احسب عدد العينات المطلوبة لزراعة الخلايا، وحضر كمية مناسبة من وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على 2.5 ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة CD3 المضادة للفأر أو السيتوكينات الحثية المشار إليها، وقم بتدوير خلايا T الساذجة CD45.2^+CD4+CD62L⁺ المحضرة، والخلايا CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ الغنية ب Treg، والخلايا غير الغنية ب APC CD4⁺ بلطف الدوران.
   ملاحظة: استخدم خلايا T الساذجة CD45.2⁺CD62L⁺ كخلايا T (Tresp) المستجيبة. تدرس هذه التجربة النموذجية تأثير خلايا Treg على تمايز وتكاثر خلايا Th1 وTh17. لذلك، هناك أربع عينات إجمالية لزراعة الخلايا: خلايا تريسب مزروعة تحت ظروف تحفيز Th1 أو Th17، في غياب أو وجود خلايا غنية ب Treg.
2. أضف 100 ميكرولتر من خلايا T الساذجة CD45.2⁺CD4⁺ (2 × 10⁵ خلايا لكل بئر) إلى صفيحة 48 بئرا.
3. أضف 100 ميكرولتر ^{من خلايا} CD45.1⁺ غير الغنية ب APC (1 ×^{10 6} خلايا لكل بئر) إلى صفيحة 48 بئر.
4. أضف 100 ميكرولتر من خلايا CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ الغنية بالتريج (2 ×^{10 5} خلايا في كل بئر) إلى الآبار التجريبية، وإضافة 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى آبار التحكم. نسبة الخلايا الغنية بالتريج إلى تريسب في العينات التجريبية هي 1:1.
   ملاحظة: يمكن ضبط نسبة خلايا التريج إلى خلايا التريسب حسب الحاجة، أو يمكن تصميم لوحة من نسب متعددة. عدد خلايا تريسب ثابت في الزراعة المشتركة، بينما يمكن تغيير عدد خلايا التريج حسب الحاجة. عادة ما تشمل نسب تريغ إلى تريسب في العينات التجريبية 1:1، 1:2، 1:4، 1:8، 1:16، و0:1. علاوة على ذلك، يمكن إعداد كل شرط تجريبي بثلاث نسخ لتقليل الخطأ التجريبي العشوائي. هنا، من أجل الوضوح، وبناء على الخبرة البحثية السابقة^15,16، يستخدم نسبة 1:1 كمثال.
5. أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على 2.5 ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة CD3 المضادة للفئران إلى كل بئر.
   ملاحظة: التركيز النهائي للأجسام المضادة المضادة CD3 المضادة للفئران هو 0.5 ميكروغرام/مل. بالإضافة إلى العينات التجريبية، ضع عينة ضابطة فارغة بدون جسم مضاد مضاد للفأر CD3. في هذه العينة، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا التائية بدون أجسام مضادة مضادة CD3 مضادة للفئران لتحديد شدة التألق في الخلايا التائية غير المتكاثرة، أو شدة ذروة 0. هذا يسمح بمعايرة دقيقة لتوزيع الانتشار.
6. أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على السيتوكينات المشار إليها إلى كل بئر ليصبح الحجم النهائي لكل بئر 500 ميكرولتر.
   ملاحظة: في هذه التجربة، يستخدم فأر مؤتلف IL-12 p70 بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل لتحفيز خلايا Th1، ويستخدم TGF-β1 المعاد تركيبه في الإنسان بتركيز نهائي 2 نانوغرام/مل، وIL-6 مؤتلف للفأر عند 50 نانوغرام/مل لتحفيز خلايا Th17.
7. أضف PBS إلى الآبار الفارغة المتبقية (500 ميكرولتر/بئر) للحفاظ على رطوبة الصفيحة وتقليل تأثيرات الحواف.
8. حضن صفيحة ال 48 بئرا في حاضنة بتركيز_ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
   ملاحظة: في هذا النظام المشترك، يوفر الجسم المضاد المضاد للفأر CD3 القابل للذوبان إشارة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الأساسية لتنشيط الخلايا التائية، بينما توفر الخلايا غير الغنية ب APC غير CD4⁺ إشارات تحفيزية لتنشيط الخلايا التائية بالكامل. يمكن أيضا تحفيز TCR والإشارات التحفيزية التكلفة بواسطة الجسم المضاد CD3 المضاد المغطى بالفأر المغطى بالصفائح والأجسام المضادة للفأر CD28 القابلة للذوبان. يمكن للباحثين اختيار طريقة التحفيز حسب الحاجة.

8. التحليل الوظيفي في المختبرات لخلايا التريج

ملاحظة: جميع حالات الطرد المركزي هي 4 درجات مئوية، و350 × جرام لمدة 7 دقائق.

1. قم بعمل ماصة برفق على الخلايا المزروعة لإعادة تعليقها وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل. قم بعمل طرد مركزي للخلايا وإزالة المادة الفائقة.
2. أضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا يحتوي على 5 نانوغرام/مل PMA، و1 ميكروغرام/مل أيونومايسين، ومثبط نقل بروتين GolgiPlug مخفف بنسبة 1:1,000 إلى كل أنبوب، ثم استخدم دوامة لطيفة لإعادة تعليق الخلايا، وحضنها في حاضنة 5٪_CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
3. يقوم بالطرد المركزي، ثم التخلص من المادة الفائقة، وإضافة 50 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على اختبار واحد من صبغة زومبي الصفراء وجسم مضاد مضاد للفأر مخفف بنسبة 1:100 لكل عينة ودوامة، ويحتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة لوضع علامات على الخلايا الميتة وحجب مستقبلات Fc.
4. قم بالطرد المركزي، تخلص من الفائق الطبيعي، أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية، دوامة، وحضن عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: أضف أجسام مضادة مضادة لمادة PerCP-Cy5.5 المضادة ل CD4، وأجسام مضادة FITC المضادة CD45.1، وأجسام مضادة لمادة APC-eFluor 780 المضادة CD45.2 إلى مخزن FACS بنسبة 1:200 لتحضير مزيج الأجسام المضادة السطحية.
5. أضف 1 مل من مخزن FACS إلى كل أنبوب طرد مركزي، وجهاز الطرد المركزي، وتخلص من السوبرناتينت.
6. أضف 300 ميكرولتر من محلول التثبيت والنفاذية إلى كل أنبوب طرد مركزي ودوامة، وحضن على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة.
7. أضف 1 مل من محلول نفاذ/غسل 1× (تجمد/غسل) إلى كل أنبوب طرد مركزي، وجهاز الطرد المركزي، وتخلص من السوبرناتينت؛ ثم كرر هذه الخطوة مرة واحدة لضمان إزالة المثبت المتبقي بالكامل.
8. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للسيتوكين، والدوامة، وحضن على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة.
   ملاحظة: أضف الأجسام المضادة المضادة ل IFN-γ PE وIL-17A PE-Cy7 إلى مخزن Perm/Wash بنسبة 1:100 لتحضير مزيج الأجسام المضادة للسيتوكين.
9. اغسل كل عينة ب 1 مل من محلول التجويف أو محلول الغسيل، قم بعمل الطرد المركزي على الخلايا، وإزالة السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبة في 300 ميكرولتر من مخزن FACS.
10. قياس تكاثر وتمايز خلايا تريسب باستخدام قياس خلوي التدفق. استخدم استراتيجية البوابة التالية (الشكل 3): أولا، قم بتهيئة مجموعة الخلايا اللمفاوية بين الخلايا الكلية واستبعاد الحطام والشوائب الخلوية؛ ثانيا، تحديد تجمع الخلايا المفردة بين الخلايا اللمفاوية بناء على إشارات التشتت؛ ثالثا، تنقل مجموعة الخلايا الحية بين الخلايا الفردية؛ رابعا، تنقل مجموعة خلايا T من CD4⁺ بين الخلايا الحية؛ خامسا، تحديد مجموعة الخلايا الغنية ب Treg CD45.1⁺ ومجموعة خلايا Teff CD45.2⁺ بين خلايا T CD4⁺؛ سادسا، خلايا بوابة CD45.2^+CD4+IFN-γ⁺ Th1، خلايا CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17، وخلايا T غير متكاثرة CD45.2⁺CD4⁺ بين خلايا T CD45.2⁺.
11. قم بجمع بيانات قياس التدفق الخلوي وتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي.
    1. استخدم خلايا T المزروعة الموسومة بصبغة تكاثر الخلايا eFluor 450 كصبغة صبغة واحدة للتحكم في صبغة تكاثر الخلية. جهز صبغة زومبي الصفراء للتحكم بصبغة واحدة باستخدام خلايا T مزروعة لم تحمل علامة على صبغة تكاثر الخلايا. جهز أدوات التحكم الأخرى ذات اللون الواحد بحبات تعويضية لكل فلوروفور مستخدم.
    2. استخدم خلايا T موسومة بصبغة تكاثر الخلايا eFluor 450 ومزروعة بدون جسم مضاد مضاد للفأر CD3 لتحديد بوابة الخلايا غير المتكاثرة.
    3. استخدم خلايا T المزروعة الموسومة بصبغة تكاثر الخلايا ومصبوغة بصبغة زومبي الصفراء، والأجسام المضادة لجميع سطح الخلية، وعناصر التحكم في الأنواع المثلية لأجسام مضادة للفئران IFN-γ PE ومضادة للفئران IL-17A PE-Cy7 لتحديد بوابات خلايا IFN-γ⁺CD4⁺ وIL-17A⁺CD4⁺ .

النتائج

في التجربة التمثيلية، تم استخدام خلايا T الساذجة كخلايا تريسب لدراسة تأثيرات الخلايا الغنية بالتريج على تكاثر وتمايز خلايا Th1 وTh17. في هذه التجربة، تم تنشيط خلايا تريسب بواسطة خلايا مضادة للفأر CD3 وخلايا غير CD4⁺ غنية ب APC، ثم تمايزت إلى خلايا Th1 تحت تحفيز IL-12 p70 أو إلى خلايا Th17 تحت تحريض TGF-β1 وIL-6. في ظل هاتين الشرطتين، تمت دراسة التغيرات في تكاثر وتمايز خلايا تريسب بعد إضافة خلايا غنية بتريغ بنسبة 1:1.

عندما تم زراعة خلايا تريسب CD45.2⁺CD4⁺ مع خل...

المناقشة

في هذه الدراسة، تتوافق نتائج الزراعة المشتركة تحت ظروف تحفيز Th1 مع التقارير السابقة التي تشير إلى أن خلايا Treg يمكنها كبح تكاثر وتمايز خلايا Th1 ^17,18. كما أن الخلايا الغنية بالتريج تثبطت تكاثر خلايا تريسب تحت ظروف تحفيز Th17. ومع ذلك، تحت ظروف استقطاب Th17 المستخدمة هنا، زاد تردد خلايا IL-17A⁺ Tresp في وجود خلايا غنية ب Treg، وهو ما يختلف عن التقارير السابقة التي تفيد بأن خلايا Treg يمكنها تثبيط تمايز خلايا Th17

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	أو ما يعادله
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	أو ما يعادله
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	أو ما يعادله
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	أو ما يعادله
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	أو ما يعادله
48-well plates	Corning Incorporated	3548	أو ما يعادله
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	أو ما يعادله
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	أو ما يعادله
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	أو ما يعادله
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	أو ما يعادله
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	أو ما يعادله
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	أو ما يعادله
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	أو ما يعادله
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	أو ما يعادله
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	أو ما يعادله
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	أو ما يعادله
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	لاقتناء البيانات السيتومترية للعينات الخلوية المناعية
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	أو ما يعادله
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	لعزل الخلايا اللمفاوية الأولية ومجموعات الخلايا التائية
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	أو ما يعادله
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	لفرز الخلايا
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	لفرز الخلايا
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	لعزل الخلايا اللمفاوية الأولية ومجموعات الخلايا التائية
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	أو ما يعادله
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	أو ما يعادله
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	أو ما يعادله
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	أو ما يعادله
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	أو ما يعادله
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	أو ما يعادله
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	أو ما يعادله
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	برنامج لتحليل بيانات السيتومترية
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	أو ما يعادله
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	أو ما يعادله
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	أو ما يعادله
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	أو ما يعادله
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	لفرز الخلايا
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	أو ما يعادله
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	لفرز الخلايا
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	لفرز الخلايا
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	لفرز الخلايا
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	لفرز الخلايا
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	أو ما يعادله
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	أو ما يعادله
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	أو ما يعادله
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	أو ما يعادله
PMA	Millipore Sigma	P8139	أو ما يعادله
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	أو ما يعادله
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	لفرز الخلايا
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	أو ما يعادله
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	أو ما يعادله
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	أو ما يعادله
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	أو ما يعادله
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	أو ما يعادله
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	أو ما يعادله
UltraComp eBeads Compensation Beads	Thermo Fisher Scientific	0