الفحص عالي الإنتاجية للطافرات العصية المثلجة التي تنتج حمض اللاكتيك L-اللاكتيك وتعمل باستخدام منصة ميكروفلويدية آلية للقطرات

ملخص

يقدم هذا البروتوكول سير عمل قياسي للفحص عالي الإنتاجية للكائنات الدقيقة الصناعية. يتضمن بناء مكتبة للطفرات عبر الطفرات بتقنية ARTP، وإجراء فحص إيجابي للقطرات باستخدام الميكروفلويديكس الآلي، ثم التحقق من النتائج. تم التحقق من موثوقية سير العمل من خلال فحص سلالات B. coagulans عالية الإنتاجية.

الملخص

يعتمد التصنيع الحيوي الصناعي على الكائنات الدقيقة لتصنيع المنتجات المستهدفة بكفاءة تحت ظروف هندسية. ومع ذلك، غالبا ما تفتقر السلالات البرية إلى القدرة على ذلك بسبب شبكاتها الأيضية الأصلية. لذلك، فإن الفحص السريع والدقيق للسلالات عالية الأداء من مكتبات الطفرات واسعة النطاق هو خطوة حاسمة في التكاثر الصناعي للميكروبات. في السنوات الأخيرة، جذبت تقنية الميكروفلويديك للقطرات اهتماما كبيرا بسبب قدرتها العالية على الإنتاجية، واستهلاكها المنخفض، وقدرتها على تقسيم الخلايا الواحدة، مما أدى إلى تطوير العديد من أنظمة الفرز أحادية الخلية. تم تقديم بروتوكول فحص عالي الإنتاجية للسلالات الميكروبية الصناعية باستخدام منصة ميكروفلويدية قطرية آلية. يتكون سير العمل المتكامل من أربع مراحل رئيسية: بناء مكتبة طفرات عبر الطفرات الجوية وبلازما درجة حرارة الغرفة (ARTP)؛ تغليف خلية واحدة عالي الكفاءة وزراعة دقيقة محكمة داخل قطرات بمقياس بيكوليتر؛ حقن بيكو الدقيق لمستشعر حيوي فلوري، يليه فرز القطرات المنشطة بالفلورية (FADS) لعزل القطرات التي تحتوي على متغيرات عالية الإنتاج؛ والتحقق من صحة السلالات المرشحة المصنفة من خلال التخمير بالميكروبليت والشفرات الشاك-فلاسك. يقصد بوجود سير عمل فحص كامل ومتكامل كقالب موحد، ويتم إثبات التحقق من ذلك من خلال عزل الطفرات المنتجة لحمض اللاكتيك عالية الإنتاج في B. coagulans كمثال محدد. تقدم هذه المنصة الآلية عالية الإنتاجية حلا تقنيا قويا مع إمكانات كبيرة لتسريع التكاثر الصناعي للسلالات عالية الأداء.

المقدمة

تستخدم التكنولوجيا الحيوية الصناعية الكائنات الدقيقة والإنزيمات كمحفزات حيوية لإنتاج منتجات ذات قيمة على نطاق واسع. يعتبر هذا النهج أكثر صداقة للبيئة وكفاءة من التصنيع الكيميائي التقليدي. ومع ذلك، فقد تطورت الشبكات الأيضية الطبيعية للكائنات الدقيقة لتعطي الأولوية لبقائها وتكاثرها بدلا من التخليق الفعال للمنتجات التي يرغب بها البشر. نتيجة لذلك، غالبا ما يكون التربية الميكروبية عالية الإنتاجية ضرورية لتلبية متطلبات بيئات الإنتاج الصناعية ذات الشروط الصارمة ^1,2,3. تتضمن هذه العملية بناء مكتبات طفرات ميكروبية واسعة النطاق بسرعة من خلال الطفرات الفيزيائية أو الكيميائية، تليها زراعة واكتشاف ظاهري للطفرات ذات الأنماط الجينية المميزة. يتم اختيار جزء صغير فقط من السلالات المتفوقة. ومع ذلك، فإن تقنيات الفحص التقليدية القائمة على الألواح والميكرولوح تعاني من الإجراءات المعقدة، وانخفاض الإنتاجية، والتكلفة العالية. هذا الاختناق، إلى جانب الاستهلاك الكبير للمستهلكات والكواشف، يؤدي إلى كفاءة منخفضة بشكل عام لتربية الميكروبات ^4,5.

برزت ميكروفلويدكس القطرات مؤخرا كحل تحويلي لهذا التحدي. على عكس فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS)، الذي لا يناسب فحص المنتجات المفرزة بسبب الانتشار السريع للجزيئات بعيدا عن الخلية، فإن فرز القطرات المنشطة بالفلورة (FADS) يحيط بالخلايا الفردية في مفاعلات دقيقة مقسمة على مستوى بيكوليتر ^6,7,8. يمنع هذا العزل الفيزيائي التنافس بين الإجهاد، ويتيح تراكم محلي للمستقلبات المفرزة، ويسمح بالكشف الكمي عنها عبر حساسات حيوية فلورية. وبالتالي، أثبتت FADS أنها منصة مثالية للفحص عالي الإنتاجية لمختلف المنتجات خارج الخلية، بما في ذلك الأحماض الأمينية، والأحماض العضوية، والإنزيمات. طور فريق جهاز GECFINDER الحيوي المشفر وراثيا الفلوريسنت، وبالدمجية مع FADS نجحوا في فحص السلالات المنتجة للفينيل ألانين العالي وحسنوا كفاءة الفحص بأكثر من 1000^ضعف. أنشأت مجموعة أخرى منصة فرز قطرات منشطة بالفلورة مع مستشعر حيوي مشفر وراثيا لفحص عالي الإنتاجية لسلالات منتجة لحمض 3-ديهيدروشيكيميك في الإشريكية القولونية، كما حسن نظام FADS المحسن بشكل كبير كفاءة الفحص ومكن عزل السلالات الطفرة مع إنتاج محسن^{بشكل ملحوظ 10}. طبق بعض الباحثين تقنية FADS على هندسة بوليميراز Bst DNA، وتم تطبيق الطفرات المكتسبة التي تتمتع باستقرار حراري معزز ونشاط إزاحة الخيوط بشكل كبير على كشف LAMP الذي قلل زمن التفاعل من 40 دقيقة إلى 10 دقائق^و11.

ومع ذلك، لا يزال تحويل هذه التطورات التكنولوجية إلى سير عمل تطوير التيار الصناعي الروتيني تحديا. تفتقر العديد من أنظمة الميكروفلويديك القطرية التجارية، رغم أجهزتها المتطورة، إلى إجراء تشغيل قياسي كامل وبديهي وقابل للتكرار مخصص لفحص الظاهرة الميكروبية. لسد هذه الفجوة، تم اعتماد منصة ميكروفلويدية قطرات آلية تدمج التحكم السائل المعياري والبرمجيات سهلة الاستخدام وتصميم الشرائح الموحد، مما وضع أساسا تقنيا مثاليا لإنشاء سير عمل فحص متكامل بالكامل. تستخدم هذه الدراسة فحص عالي الإنتاجية لمنتجات B. coagulans المنتجة لحمض L-lactic عالية الإنتاجية كحالة تحقق من الواقع. استنادا إلى منصة ميكروفلويدية قطراتية، تم إنشاء سير العمل التالي، الذي يتكون من أربع خطوات رئيسية متسلسلة: (1) بناء مكتبة طفرات متنوعة عبر طفرات البلازما الجوية ودرجة حرارة الغرفة (ARTP)؛ (2) تغليف خلية واحدة عالي الكفاءة وزراعة دقيقة محكمة داخل القطرات تحت ظروف محسنة لنمو B. coagulans وإنتاج حمض L-lactic؛ (3) حقن بيكو دقيق لحساس حيوي فلوري خاص ب L-Lactate، يليه فرز عالي السرعة للقطرات التي تغلف المنتجين المتفوقين؛ و(4) التحقق الدقيق للمرشحين المصنفين من خلال تخمير القارورة المرتجفة لتأكيد تحسين الإنتاج والاستقرار الجيني. يهدف هذا البروتوكول إلى الباحثين والمهندسين المشاركين في تربية الميكروبات الصناعية الذين يحتاجون إلى فحص عالي الإنتاجية للمنتجات خارج الخلية. وهو مناسب بشكل خاص للبكتيريا القابلة للزراعة التي تفرز مستقلبات جزيئات صغيرة أو إنزيمات. يجب تجهيز منصة الفحص بحساسات متوافقة مع البيئة الدقيقة للقطرات لتمكين الكشف الدقيق عن المستقلبات المستهدفة. بالنسبة للسلالات التي تتطلب زراعة خاصة (مثل اللاهوائية الصارمة)، يمكن تعديل معايير الزراعة لتحسين ووضع استراتيجية زراعة مخصصة. من خلال إنشاء هذا السير العملي المغلق والموحد للفحص، تهدف هذه الدراسة إلى توفير حل قوي وقابل للنقل لتسريع التكاثر الصناعي للسلالات.

البروتوكول

لم تكن هذه الدراسة مطلوبة للحصول على موافقة أخلاقية. أجريت جميع التجارب باستخدام مزارع ميكروبية نقية، ولم يشارك أي أشخاص أو حيوانات مختبرية في هذا البحث. راجع جدول المواد لمزيد من التفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في البروتوكول التالي.

1. التحضيرات

تحذير: اتبع ممارسات السلامة البيولوجية. B. coagulans هو كائن حي من مستوى السلامة البيولوجية الأول. ارتد قفازات ومعطف مختبر. قم بجميع عمليات التحريك المفتوحة داخل غطاء تدفق طبقي. قم بتعقيم جميع المواد التي تلامس الخلايا الحية عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل التخلص منها.

1. مصدر الإجهاد والصيانة
   1. اشتر B. coagulans ATCC 7050 من مركز جمع الثقافة التجارية كجيل ثان من ثقافة الميل.
   2. امسح حلقة من الزراعة المائلة على البذور المتوسطة واحتضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. اختر مستعمرة واحدة، وتلقيحها في وسط بذور سائل، وانمو بدرجة حرارة 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة.
   3. اخلط الزراعة الناتجة مع الجلسرول المعقم 40٪ إلى تركيز نهائي 25٪ (v/v) وتخزينه كمخزون مجمد عند –80 درجة مئوية. في كل تجربة، قم بإذابة أليكوت طازجة، ووضعها على أجار متوسط البذرة، وحضنها على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   4. ثم قطف مستعمرة واحدة، وتلقيحها في وسط بذور سائل، وزرعه على حرارة 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة قبل استخدامه للطفرات والفحص (الشكل التكميلي 1).
2. حساس حمض اللاكتيك
   1. التعبير عن وتنقية حساس eLACCO1.1 كما هو موضح في المواد التكميلية¹² (الشكل التكميلي 2).
   2. قم بإضافة جليسيرول 5٪ (v/v) للحساس المنقى وخزنها عند -80 درجة مئوية. لكل تجربة، قم بإذابة أليكوت واحد على الجليد وتخفيفه فورا ب 10 ملليمولار PBS معقم (pH 7.4) إلى تركيز عمل نهائي 0.1 ملغ/مل.
3. إعداد وسائل الإعلام الثقافية
   1. وسط البذور (ج/لتر: جلوكوز 20، مستخلص الخميرة 5، تريبتون 10، أسيتات الصوديوم 2، سترات الصوديوم 2، K₂HPO₄ 2، MgSO_{4.7H 2}O 0.2، MnSO₄· H₂O 0.05، FeSO_{4.7H 2}O 0.01). قم بتعقيم الجلوكوز بشكل منفصل كمخزون بسعة 200 جرام/لتر عند 115 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      1. قم بتعقيم المكونات المتبقية عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد، أضف مخزون الجلوكوز المعقم إلى تركيز نهائي 20 جرام/لتر، ثم تعقيم العناصر النزرة بالفلتر.
      2. تخزين الوسط الكامل عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. استخدامه للتفعيل الليلي، وتحضير اللقاح.
   2. وسط الفحص (جرام/لتر: جلوكوز 20، مستخلص الخميرة 6.66، NaCl 0.333، NH₄Cl 0.665، KH₂PO₄ 2، Na₂HPO₄ 4.46، MgSO₄ 0.12، CaCl₂ 0.074).
      1. قم بتعقيم الجلوكوز بشكل منفصل عند درجة حرارة 115 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم خليط مستخلص الملح/الخميرة على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. بعد التبريد، أضف مرق الجلوكوز المعقم إلى 20 جرام/لتر. خزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. يستخدم كطور مائي لتوليد القطرات وكوسط زراعة داخل القطرات خلال فترة الحضانة التي تستمر 10 ساعات.
   3. وسط التخمير (جرام/لتر: جلوكوز 90، تريبتون 13.33، مستخلص الخميرة 13.33، أسيتات الصوديوم 0.67، NaCl 0.0133، MgSO_4.7H₂O 0.0133، MnSO₄· H₂O 0.0133، FeSO_{4.7H 2}O 0.0133).
      1. قم بتعقيم الجلوكوز كمخزون 500 جرام/لتر عند درجة حرارة 115 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم المعقم على المكونات الأخرى عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. بعد التبريد، أضف مخزون الجلوكوز المعقم إلى 90 جرام/لتر. أضف مسحوق CaCO₃ المعقم (4٪ w/v) قبل التلقيح مباشرة لتقليل الرقم الهيدروجيني. حضر طازجا يوميا. الاستخدام لفحص الميكروبليت الأولي والتحقق من صحة القارورة الشاك-فاك.
         ملاحظة: جهز جميع الأوساط بالماء المقطر إلى حجم نهائي 1 لتر. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.5 مع 1 ميلار هيدروكلوترون.

2. بناء مكتبة متحولين باستخدام ARTP

تحذير: تشغيل ARTP يتضمن بلازما عالية التردد ومصباح UV. يمكن أن يسبب الأشعة فوق البنفسجية إصابات في العين والجلد. تفريغ البلازما يولد الأوزون ودرجات حرارة عالية. دائما أبق باب الحجرة مغلقا أثناء تشغيل البلازما. ارتد معطف مختبر ونظارات واقية للأشعة فوق البنفسجية. استخدم فقط 99.999٪ هيليوم نقي فقط؛ تأكد من التهوية الكافية. بعد كل عملية للطفرة، امسح طاولة العمل والجدران الداخلية لغرفة الطفرات بقطعة قماش خالية من الوبر مغموسة بنسبة 75٪ (v/v) إيثانول. 75٪ إيثانول قابل للاشتعال بشدة. ابتعد عن اللهب المفتوح، الشرر، والأسطح الساخنة.

1. حدد منحنى قياسي يربط OD₆₀₀ بتركيز الخلايا القابل للحياة.
   1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من B. coagulans في وسط بذور وحضانة عند 50 درجة مئوية وسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة حتى تصل الزراعة إلى المرحلة اللوغاريتمية المتوسطة.
   2. تحضير تخفيفات متسلسلة لتعليق البكتيريا عند تدرجات 10⁴ و10^و5 و10⁶.
   3. قم بطباعة 100 ميكرولتر من كل تخفيف وزعها بالتساوي على ألواح الأجار المتوسطة من البذور في ثلاث نسخ.
   4. حضن جميع ألواح الأجار المطلية عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   5. عد وحدات تكوين المستعمرة (CFU) لكل تخفيف.
      ملاحظة: تظهر المعايرة أن OD₆₀₀ = 0.5 يعادل تقريبا 1 × 10⁸ CFU/mL. استخدم هذه العلاقة لتحديد كثافة الخلايا الأولية لتغليف القطرات (الشكل التكميلي 3).
2. تقوم بزراعة B. coagulans إلى المرحلة اللوغاريتمية المتوسطة إلى المتأخرة، ثم تخفف زراعة البذور الطازجة إلى OD₆₀₀ = 0.05 في وسط البذور الطازج.
3. داخل غطاء تدفق طبقي، جهز ثمانية أقراص معدنية صغيرة معقمة وقرص معدني كبير واحد. اشعل الأقراص الثمانية الصغيرة فوق موقد كحولي لمدة دقيقة واحدة، وضعها على القرص الكبير المعقم، ودعها تبرد لمدة 10 دقائق.
4. باستخدام ميكروبايبت، تم نشر 10 ميكرولتر من التعليق البكتيري المخفف بشكل منتظم على كل من الأقراص الصغيرة الثمانية المبردة.
5. انقل القرص الكبير الذي يحمل الأقراص الصغيرة الملقحة إلى طبق بتري معقم.
6. شغل جهاز ARTP وفعل شاشة التحكم الرئيسية. شغل المصباح فوق البنفسجي داخل غرفة الطفرات. ابدأ المبرد وقم بتبريده مسبقا لمدة 20 دقيقة حتى تستقر درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية.
7. افتح بسرعة باب غرفة الطفرات وضع الأقراص الصغيرة بداخله.
8. باستخدام ملقط معقم، انقل كل قرص صغير بشكل تسلسلي إلى مرحلة عينة ARTP.
   ملاحظة: تم تثبيت قدرة التردد الراديوي، ومعدل تدفق غاز الهيليوم، ومسافة الفوهة إلى العينة، ونقاء الهيليوم عند 120 واط، و10 SLM، و2 مم، و99.999٪ على التوالي. تم ضبط زمن إشعاع الهيليوم على 5، 10، 15، 20، 25، و30 ثانية على التوالي.
9. تعرض كل قرص صغير لطفرات ARTP وفقا لمعايير المجموعة. بعد الإشعاع، ينقل جميع الأقراص إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل يحتوي على 10 مل من وسط الاسترداد. الحضانة عند 50 درجة مئوية مع هز 200 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات للسماح بتعافي الخلايا ونموها.
10. تحديد معدل الفتك.
    1. قم بتخفيف الزراعة المستخرجة تدريجيا إلى تدرج من ^10-2 إلى ^10-6.
    2. انشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح أجار متوسطة البذور، وحضر ثلاث نسخ لكل تخفيف.
    3. حضن جميع الألواح عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    4. عد المستعمرات واحسب العدد المقابل CFU/mL.
    5. احسب معدل الموت باستخدام الصيغة:
       (1)
       ملاحظة: قم بإجراء التجربة بثلاث نسخ لكل نقطة زمنية. الوقت الأمثل لحدوث الطفرات ل ARTP في هذه الحالة هو 20 ثانية (الشكل التكميلي 4).

3. تركيب منصة القطرات الميكروفلويدية الآلية والمستهلكات

1. نظام التشغيل (الشكل 1)
   ملاحظة: يتكون من 3 قنوات من وحدات تحكم الضغط عالية الدقة بنطاق ضغط يتراوح بين 0–1000 ملي بار وزمن استجابة ضغط < 50 مللي ثانية (الشكل 1A).
2. نظام التصوير
   ملاحظة: يتميز تصوير CMOS المجهري عالي السرعة بجمع بيانات الصور بسرعة ≥ 2 جيجابايت/ثانية، ومعدل إطارات من 0 إلى 20,000 إطار في الثانية، ودقة قصوى 1280 × 860. يتميز النظام بالتركيز التلقائي لمراقبة حركة القطرات في الوقت الحقيقي ويدعم تسجيل الصور والفيديوهات التي يمكن تصديرها بعدة صيغ مثل BMP وAVI وMP4 وTIF.
3. نظام الكشف
   ملاحظة: يتيح الكشف عن الإشارة الفلورية باستخدام ليزرين: 488 نانومتر و633 نانومتر، وقناتي كشف.
4. نظام التحكم في المضيف
   ملاحظة: يتم التحكم في النظام بواسطة برنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي، ويدمج عدة وحدات، بما في ذلك تشغيل السوائل، التصوير المجهري، الإثارة والكشف، توليد القطرات، حقن البيكو، والفرز. كما يدعم جمع البيانات التجريبية وتسجيلها وتخزينها وعرضها وتصديرها. تظهر وحدات التشغيل الجزئية لمنصة القطرات الآلية الميكروفلويدية (الشكل 1B).
5. المواد الاستهلاكية
   ملاحظة: تشمل المواد الاستهلاكية المستخدمة في هذا البروتوكول: أنبوب الحقن لطور الزيت، العينة، والكواشف (الشكل 2A); أنبوب جمع لحضانة القطرات (الشكل 2B)؛ شريحة توليد القطرات (الشكل 2C)؛ شريحة حقن بيكو بقطرة (الشكل 2D); وشريحة فرز القطرات (الشكل 2E).

4. توليد القطرات

تحذير: نظف منصة الميكروفلويد القطرية الآلية. بعد كل تجربة، امسح المسرح وحامل الرقائق وأي مناطق انسكاب بنسبة 75٪ إيثانول باستخدام مناديل خالية من الوبر. قم بإزالة الزيت المفلور المتبقي، أو تعليق الخلايا، أو محلول الحساسات.

1. تغليف الخلية الواحدة. للحصول على λ = 0.1 في قطرات 14 بيلومتر، قم بتخفيف التعليق البكتيري إلى OD₆₀₀ ≈ 0.04 (OD₆₀₀=0.5 يعادل 1 ×^{10 8} CFU/mL). وفقا لتوزيع بواسون:
   (2)
   عندما يكون λ = 0.1، يكون 90.5٪ من القطرات فارغا، و9.1٪ على خلية واحدة، و0.4٪ على عدة خلايا.
   ملاحظة: في هذه الحالة، كانت كفاءة تغليف الخلية المفردة المقاسة 11.2٪ (الشكل التكميلي 5). يمكن تحديد عدد الخلايا لكل قطرة بواسطة تلوين DAPI. عندما يكون λ = 0.1 ويتجاوز معدل تغليف الخلايا المتعددة 1٪، يجب تقليل OD₆₀₀ لتقليل نسبة القطرات التي تحتوي على عدة خلايا.
2. بيبت 300 ميكرولتر من الزيت المفلور في قارورة مدخل طور الزيت. بيبت 500 ميكرولتر من التعليق البكتيري في قارورة دخول الطور المائي.
3. اقشر الشريط الذي يغطي سطح شريحة توليد القطرات. قم بتوصيل قارورة الزيت، وقارورة العينة، وقارورة التجميع بآبار الشريحة المقابلة بالتسلسل.
4. ضع الشريحة على المسرح وثبتها. قم بتوصيل أنابيب الهواء بقوارير المدخل واحدة تلو الأخرى حسب ملصقات مسار الغاز.
5. افتح برنامج منصة الميكروفلويديك القطرات الآلي. قم بضبط مقبض حركة المسرح وفقا لاتجاهات السهم على الشريحة لنقل مجال الرؤية إلى موقع توليد القطرات.
6. انقر على "ابدأ" في واجهة "توليد القطرات" لبرنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي (الشكل 3A). في واجهة التصوير، قم بسحب أشرطة سطوع "محور Z" ومصدر الضوء لضبط وضوح الصورة وسطوعها.
7. انقر على أزرار "+" و"-" في "سرعة القطرة" و"حجم القطرة" لضبط سرعة التوليد وحجم القطرة.
   ملاحظة: في هذه الحالة، يتم ضبط ضغط طور الزيت وضغط طور العينة لتوليد القطرات تلقائيا على 300 ملي بار و400 ميلي بار على التوالي، لتحقيق معدل توليد 1500 هرتز. تحت هذه الإعدادات، تكون حجم القطرات 14 pL، مع الحفاظ على قطر القطرات CV تحت 5٪، مما يضمن حجم القطرات ثابتا وعمليات موثوقة في المراحل النهائية.
8. انتظر دقيقة واحدة حتى تستقر المعدات وتبقى حالة توليد القطرات ثابتة. استبدل قارورة الجمع بسرعة لبدء جمع القطرات.
   ملاحظة: أضف مسبقا كمية صغيرة من الزيت المفلور إلى أنبوب التجميع الجديد لتغطية المنفذ السفلي لأنبوب التفلون، مع التأكد من عدم ملامسة القطرات مباشرة لجدار الأنبوب وتسبب الاندماج.
9. أوقف جمع القطرات بعد 30 دقيقة من العملية. انقر على "إيقاف" في نافذة النافذة المنبثقة لتأكيد إيقاف توليد القطرات.
10. أزل أنبوب الجمع برفق من الشريحة. ضع الأنبوب وقارورة الجمع عموديا وانتظر حتى تدخل القطرات داخل الأنبوب إلى القارورة.
11. قم بإزالة الشريحة، وقارورة مدخل طور الزيت، وقارورة مدخل الطور المائي من المرحلة. امسح سطح المسرح بنسبة 75٪ كحول. ثم تكتمل مرحلة توليد القطرات.

5. زراعة القطرات

1. أضف 1 مل من الزيت المعدني إلى أنبوب التجميع.
   ملاحظة: تغطي طبقة الزيت المعدني تعليق القطرات لتقليل التبخر وتقليل التعرض للأكسجين، مع السماح بتبادل كمية كافية من الغاز للكائن اللاهوائي الاختياري B. coagulans.
2. ضع أنبوب الجمع بشكل عمودي في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل يحتوي على ماء معقم. حافظ على غطاء أنبوب الجمع بشكل فضفاض واحتضن عند 45 درجة مئوية لمدة 10 ساعات.
   ملاحظة: بعد الحضانة، تأكد من أن قطر القطرات الثانوية هو <10٪ وأنه لا يلاحظ أي تجمع للقطرات. تخلص من الدفعات إذا لم تستوفي هذه المعايير.

6. حقن بيكو بقطرة

تحذير: يتم تطبيق جهد عالي على أقطاب الشريحة عبر اتصال الجهاز أثناء حقن البيكو. المجال الكهربائي يمكن أن يسبب صدمة كهربائية شديدة. لا تلمس الأقطاب الكهربائية أو سطح الشريحة بالأدوات المعدنية أو باليدين العاريتين أثناء تفعيل الجهد العالي. دائما قم بتعطيل خرج الجهد العالي قبل التعامل مع الشريحة. ارتد قفازات معزولة واستخدم أدوات غير موصلة للاتصالات.

1. جهز قارورة مدخل طور الزيت. في غطاء التدفق الطبقي، يتم توصيل 300 ميكرولتر من الزيت المفلور إلى قارورة مدخل طور الزيت.
2. جهز قارورة مدخل العينة. أزل غطاء قارورة المدخل من أنبوب الجمع الذي يحتوي على القطرات. استبدله بغطاء جديد.
3. قم بتقليم طرف قارورة المدخل الجديدة. اقطع جزءا صغيرا من مقدمة قارورة المدخل الجديدة بحيث يصل الطرف إلى ما دون مستوى السائل للقطرات في القارورة العينة.
4. شد القبوة. ثبت الغطاء بإحكام لمنع التسرب.
5. جهز قارورة مدخل الكواشف. بيبت 500 ميكرولتر من حساس حمض اللاكتيك في قارورة مدخل الكواشف.
6. أضف PBS إلى قارورة مدخل الكواشف. في الوقت نفسه، أضف 500 ميكرولتر من مخزن PBS المعقم إلى نفس قارورة مدخل الكواشف.
   ملاحظة: تمت إضافة مخزن PBS في هذه التجربة لموازنة درجة الحموضة للقطرات. كان تركيز العمل النهائي لحساس اللاكتات 0.1 ملغ/مل، وحجم التحميل لحساس اللاكتات 500 ميكرولتر.
7. استخدم شفرة لقطع الشريط الذي يغطي آبار الأقطاب الكهربائية لكشف الأقطاب الكهربائية. اضبط جهاز القياس المتعدد على وضع الاستمرارية واختبر اتصال الدائرة وحالة الدائرة القصيرة في الشريحة.
   ملاحظة: إذا أظهر الجهاز المتعدد اتصالا طبيعيا لأقطاب الشريحة في الدائرة، انتقل إلى الخطوة التالية. إذا كانت الدائرة مفتوحة، استبدل شريحة الحقن وأجر اختبارا مرة أخرى.
8. بعد تأكيد الاتصال الدائري الطبيعي مع جهاز القياس المتعدد، قم بإزالة الشريط الموجود على سطح الشريحة. قم بربط قارورة الزيت، وقارورة العينة، وقارورة الكاشف، وقارورة الجمع بالآبار المقابلة للشريحة بالتسلسل.
9. ضع الشريحة على المسرح وثبتها. قم بتوصيل أنابيب الهواء بقوارير المدخل واحدة تلو الأخرى حسب ملصقات مسار الغاز.
10. افتح برنامج منصة الميكروفلويديك القطرات الآلي. اضبط مقبض حركة المسرح حسب اتجاهات الأسهم على الشريحة لتحريك مجال الرؤية إلى منطقة القطب في شريحة القطرة.
11. انقر على "ابدأ" في واجهة "حقن بيكو القطرة" لبرنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي (الشكل 3B). في واجهة التصوير، قم بسحب أشرطة سطوع "محور Z" ومصدر الضوء لضبط وضوح الصورة وسطوعها.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يقوم الجهاز تلقائيا بضبط ضغط مضخة طور الزيت إلى 400 مللي بار، وضغط مضخة طور العينة إلى 420 مللي بار، وضغط مضخة طور حقن الكواشف إلى 450 مل.
12. في المرحلة الأولى من التشغيل، يتم تفريغ جزء من الهواء في القسطرة إلى الشريحة، وهو أمر طبيعي يستمر لعدة دقائق.
13. انتظر حتى تدخل القطرات مجال الرؤية. انقر على "بدء حقن بيكو". في هذه المرحلة، سيتم تفعيل المجال الكهربائي للجهاز. قم بضبط سرعة توليد القطرات، وتباعد القطرات، وحجم الحقن بالنقر على زري "+" و"-" في "سرعة القطرات"، "تباعد القطرات"، و"حجم الحقن".
    ملاحظة: المجال الكهربائي مضبوط على الحد الأقصى الافتراضي للترس. إذا انكسرت القطرات في منطقة المجال الكهربائي أثناء عملية الاندماج، انتقل إلى الترس المتوسط أو المنخفض. في هذه الحالة، كان معدل حقن القطرات 200 هرتز.
14. راقب في برنامج عرض الصور عالي السرعة. إذا كانت القطرات تستطيع الحقن بشكل مستقر في حساس حمض اللاكتيك بنسبة 1:1، انتظر 5 دقائق حتى تستقر الجهاز. استبدل قارورة الجمع بسرعة لبدء جمع القطرات.
15. بعد الحقن المستقر لمدة ساعتين، اضغط على "توقف" لإنهاء حقن القطرة البيكو.
16. أزل أنبوب الجمع برفق من الشريحة. ضع الأنبوب وقارورة الجمع عموديا وانتظر حتى تدخل القطرات داخل الأنبوب إلى القارورة.

7. فرز القطرات

تحذير: مزيل المولب مهيج وقد يسبب تهيجا في الجلد والعين. كما أنه ضار إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، نظارات أمان). استخدم جهاز إزالة الرطوبة في منطقة جيدة التهوية أو غطاء البخار. اجمع مزيل النفايات في حاوية منفصلة تحمل علامات واضحة. لا تصب الحوض.

1. في غطاء التدفق الطبقي، قم بإزالة 300 ميكرولتر من الزيت المفلور بماصة وإضافته إلى قارورة مدخل طور الزيت. استبدل غطاء قارورة الدخول في أنبوب الجمع الذي يحتوي على قطرات محقونة ميكرو بغطاء جديد.
   ملاحظة: قبل إجراء تجارب فرز القطرات، خذ 5 ميكرولتر من القطرات وراقبها تحت مجهر فلوري. قس قطر ما لا يقل عن 200 قطرة؛ تابع فقط إذا < السيرة الذاتية 10٪.
2. استخدم شفرة لقطع الشريط الذي يغطي آبار الأقطاب الكهربائية لكشف الأقطاب الكهربائية. اضبط جهاز القياس المتعدد على وضع الاستمرارية واختبر اتصال الدائرة وحالة الدائرة القصيرة في الشريحة.
3. بعد تأكيد الاتصال الدائري الطبيعي مع جهاز القياس المتعدد، قم بإزالة الشريط الموجود على سطح الشريحة. قم بتوصيل قارورة الزيت، وقارورة العينة، وقارورة جمع الفرز بآبار الشريحة المقابلة بالتسلسل.
4. ضع الشريحة على المسرح وثبتها. قم بتوصيل أنابيب الهواء بقوارير المدخل واحدة تلو الأخرى حسب ملصقات مسار الغاز.
5. افتح برنامج التصوير عالي السرعة. اضبط مقبض حركة المسرح حسب اتجاهات الأسهم على الشريحة لتحريك مجال الرؤية إلى منطقة القطب في شريحة القطرة.
6. انقر على "ابدأ" في واجهة "فرز القطرات" لبرنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي. في واجهة التصوير، قم بسحب أشرطة سطوع "محور Z" ومصدر الضوء لضبط وضوح الصورة وسطوعها.
   ملاحظة: بعد النقر على "تشغيل"، يقوم الجهاز تلقائيا بضبط ضغط مضخة الزيت إلى 300 ملي بار وضغط مضخة العينة إلى 190 مللي بار، مما يؤدي إلى معدل نقل قطرات يبلغ 100 هرتز.
7. في المرحلة الأولى من التشغيل، يتم تصريف جزء من الهواء في القسطرة إلى الشريحة، والتي تستمر لعدة دقائق وهي ظاهرة طبيعية.
8. انقر لاختيار "ليزر" واختر قناة الكشف 488 نانومتر.
   ملاحظة: قد يختار الطاقم التجريبي ليزر بقطر 488 نانومتر، أو ليزر 633 نانومتر، أو مزيج من الاثنين، حسب تصميم الكشف التجريبي. قوة الليزر: 20 ميلي واط.
9. انقر على "تسجيل البيانات". سيبدأ الجهاز في اكتساب إشارات الفلورة القطرية (الشكل 3C).
   ملاحظة: اجمع إشارات الفلورة من 50,000 إلى 100,000 قطرة؛ يقوم الجهاز تلقائيا بفرز قيم الإشارة وتوليد مخطط إشارة فلوري.
10. استنادا إلى مخطط إشارة الفلورة المولد، اضبط عتبة الفرز على أعلى 0.1٪ من إجمالي إشارات الفلورة، وجمع قطرات ذات قيم إشارة فلورية فوق هذه العتبة.
    ملاحظة: في هذه الحالة، تم ضبط بوابة الفرز لجمع قطرات ذات شدة فلورية > 2750 (a.u.)، والتي تمثل أعلى 0.1٪ من القطرات.
11. اضغط على "تسجيل البيانات" مرة أخرى. سيعيد الجهاز تسجيل إشارات الفلورة من القطرات المتبقية ويفرز القطرات المستهدفة بناء على العتبة المحددة في القسم 7.10.
    ملاحظة: سيتم أيضا فرز ورسم إشارات القطرات المتبقية تلقائيا كمخطط فلوري.
12. بعد اختيار منطقة القطرة المستهدفة، قم بتشغيل "مفتاح الفرز" وضبط قيمة "قوة الانحراف". ستبدأ المعدات في فرز القطرات.
    ملاحظة: يوفر الجهاز ثلاثة مستويات قوة للمجال الكهربائي القابل للاختيار (عالية، متوسطة، منخفضة). للقطرات التي تزيد حجمها عن 30 ميكرومتر، اختر القطرات العليا؛ بالنسبة للقطرات التي تقل عن 25 ميكرومتر، اختر متوسط أو منخفض. هذا يضمن استقرار الانحراف وكفاءة الفرز المثلى.
13. بعد أن تستقر المعدات لمدة 5 دقائق، استبدل قارورة الجمع لجمع القطرات الإيجابية.
    ملاحظة: أثناء الفرز، يقيس الجهاز باستمرار شدة الفلورة لكل قطرة في الوقت الحقيقي ويقارنها بالعتبة المحددة مسبقا. فقط القطرات ذات الشدة الفلورية التي تتجاوز العتبة يتم تحويلها وجمعها في أنبوب الجمع الموجب. تعتبر القطرة موجبة إذا أظهرت الأداة إشارة فلورية تتجاوز عتبة الفرز، وفي الوقت نفسه لوحظ انحراف القطرة في واجهة التصوير، مما يؤكد توجيه القطرة بنجاح إلى قناة الجمع الموجبة.
14. أوقف فرز القطرات بعد 4 ساعات من التشغيل المستقر. انقر على "توقف" في واجهة "فرز القطرات".
15. أزل أنبوب الجمع برفق من الشريحة. ضع الأنبوب وقارورة الجمع عموديا لضمان دخول القطرات داخل الأنبوب إلى قارورة الجمع.
16. بعد الانتهاء من جمع القطرات، انقر على مخطط التشتت لحفظ مخطط التشتت للتجربة، وقيم إشارة الفلورة للقطرات الموجبة المرتبة، وقيم إشارة الفلورة لجميع القطرات.
17. قم بإزالة الشريحة، وقارورة مدخل طور الزيت، وقارورة العينة، وقارورة الكواشف من المرحلة. أغلق البرنامج.
18. تحلل القطرات. أضف 500 ميكرولتر من 1H، 1H، 2H، 2H-بيرفلورو أوكتانول إلى أنبوب جمع القطرات. انتظر 5 دقائق، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط الفحص الجديد للاستعادة.
    ملاحظة: لا تهز أنبوب الجمع بقوة بعد إضافة جهاز إزالة المولبس؛ اخلط برفق. بعد تحلل القطرات، يتشكل واجهة واضحة بين الطور المائي والزيتي.
19. خذ 20 ميكرولتر من التعليق البكتيري المفكك، وقم بتخفيفه عشرة أضعاف، ووزعه على لوحين أجار. حضن عند 50 درجة مئوية لمدة يومين.
    ملاحظة: يمكن تعديل عامل التخفيف حسب عدد القطرات المجمعة. في هذه الحالة، تم الحصول على حوالي 400 مستعمرة منفردة من اللوحة.

8. تصدير البيانات

1. انقر على مخطط إشارة الفلورة في المنطقة الفارغة من واجهة فرز البرنامج. اختر لحفظ مخطط تشتت إشارة الفلورة للقطرات، ومخطط إشارة الفلورة، وجدول بيانات إكسل لإشارة الفلورة، والتي تحتوي على قيم شدة الفلورة المسجلة لعدد القطرات الكلي للقطرات، بالإضافة إلى قيم شدة الفلورة للقطرات الموجبة المفحصة.

9. فحص الميكروبليت الأولي

1. اختر مستعمرات فردية عشوائيا.
2. قم بتطعيم صفيحة البئر العميقة ذات 24 بئر لزراعة التوسع. اختر كل مستعمرة مختارة وقم بتلقيحها في بئر واحد من طبق بئر عميق يحتوي على 2 مل من وسط التخمير. استخدم حلقة التطعيم.
3. أغلق صفيحة البئر العميقة ذات 24 بئرا بغشاء غير قابل للتنفس.
   ملاحظة: لا تستخدم غشاء قابل للتنفس. يسبب تبخر وسط الزراعة.
4. حضن ثقافة التوسع. ضع لوح البئر المغلق ذو 24 بئرا عميقا في حاضنة اهتزاز عند 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
5. الزراعة الفرعية للتحقق من صحة التخمير. بعد 24 ساعة، انقل 200 ميكرولتر من الزراعة من كل بئر إلى صفيحة جديدة بعمق 24 بئر تحتوي على 1.8 مل من وسط التخمير (10٪ v/v لقيح). أضف CaCO₃ المعقم إلى تركيز نهائي 4٪ (w/v) لكل منها قبل التلقيح بفترة كافية لتخفيف الرقم الهيدروجيني.
6. أضف عناصر التحكم. في كل صفيحة جديدة بعمق 24 بئرا، املأ ثلاثة آبار مختارة عشوائيا بالسلالة الأبوية ATCC 7050 كعناصر تحكم سالبة. عالجها بنفس الطريقة التي تتوافق مع السلالات المرشحة.
7. أغلق صفيحة البئر العميقة ذات 24 بئرا بغشاء غير قابل للتنفس.
8. حضن لوحة البئر العميقة ذات 24 بئرا. ضع اللوحة المغلقة في حاضنة هز عند 50 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
9. جهز عينات للكشف عن اللاكتات. قم بطرد مركزي على اللوحة على 5,842 × جرام لمدة 10 دقائق. انقل 10 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى صفيحة سوداء صغيرة بسعة 96 بئر وتخفيفها ب 990 ميكرولتر من الماء فائق النقي. اخلط جيدا.
10. أضف حساس اللاكتات. أضف 100 ميكرولتر من العينة المخففة إلى كل بئر من صفيحة سوداء جديدة بسعة 96 بئرا. ثم أضف 100 ميكرولتر من حساس حمض اللاكتيك. اخلط بلطف.
11. قس التألق. حضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (محمي من الضوء). قس الفلورة باستخدام قارئ ميكروبلويت مع إثارة عند 485 نانومتر وانبعاث عند 515 نانومتر.
12. حدد عتبة اختيار الضربة. احسب متوسط التألق لثلاثة آبار مراقبة أبوية (الوالد) والانحراف المعياري (SD_parent). عرف العتبة بأنها F_parent + 3 × SD_parent.
13. حدد النتائج الأساسية. يعتبر الانفعال المرشح ضربة أولية إذا تجاوزت إشارة الفلورة الخاصة به العتبة. سجل عدد النتائج الأساسية للتحقق من المراحل النهائية.

10. التحقق الثانوي للسلالات عالية الإنتاجية

تحذير: الطور المتنقل يحتوي على حمض الكبريتيك المخفف (5 ملم)، وهو مادة تآكلية. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، نظارات أمان). جهز وتعامل مع الطور المتحرك في منطقة جيدة التهوية أو غطاء بخار. اجمع جميع النفايات التي تحتوي على حمض في حاوية مخصصة للتخلص السليم. لا تصب الحوض.

1. حضر زراعة البذور. اضرب السلالات الأساسية على ألواح البذور متوسطة الأجار. حضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. اختر مستعمرة واحدة من كل طبق وقم بتلقيحها في 30 مل من وسط البذور السائل في قارورة هزة بسعة 250 مل. الحضانة عند 50 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة.
2. جهز عملية التخمير. جهز وسط التخمير وأضف مسحوق CaCO3 المعقم إلى تركيز نهائي 4٪ (بدون جهد) كمعادل لدرجة الحموضة. انقل 5 مل من مزرعة البذور إلى 45 مل من هذا الوسط في قارورة إيرلينماير بسعة 250 مل (لقاح 10٪ v/v؛ حجم العمل النهائي 50 مل).
   ملاحظة: استخدم ثلاث قوارير مستقلة لكل سلالة مرشحة وللسلالة الأبوية ATCC 7050 كضابط.
3. حضن القوارير. ضع القوارير في حاضنة اهتزاز عند 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة. تخمر لمدة 24 ساعة.
4. اجمع عينات. بعد 24 ساعة، خذ 1 مل من الزراعة من كل قارورة. الطرد المركزي عند 13,800 × جرام لمدة دقيقتين. قم بتخفيف المادة الفائقة 100 مرة بماء فائق نقي وترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر.
5. قم بإعداد شروط HPLC. استخدم عمود Aminex HPX-87H. جهز الطور المتحرك: 5 مللي مولار H₂SO₄ في مياه فائقة النقي، وترشيح عبر غشاء 0.22 ميكرومتر، وإزالة الغاز عن طريق الصوت. اضبط درجة حرارة العمود إلى 40 درجة مئوية، معدل تدفق إلى 0.6 مل/دقيقة، حجم الحقن إلى 20 ميكرولتر، ووقت التشغيل إلى 20 دقيقة لكل عينة (يخرج حمض اللاكتيك عند ~12.600 دقيقة). استخدم كاشف معامل الانكسار (RID).
6. جهز المنحنى القياسي. إذابة لاكتات الكالسيوم في مياه فائقة النقاء لتحضير محاليل قياسية من 0، 0.4، 0.8، 1.2، و1.6 جرام/لتر (معبرا عنها كإل-لاكتات الكالسيوم). حقن كل معيار في ثلاث نسخ.
   ملاحظة: رسم مساحة الذروة مقابل التركيز واحصل على معادلة الانحدار الخطي (R² > 0.999). شغل المعايير في بداية ونهاية كل دفعة عينة لتصحيح الانحراف.
7. حقن العينات. حقن المواد الفائقة المختصرة المصفاة (20 ميكرولتر) في نظام HPLC. سجل منطقة الذروة لذروة لاكتات الكالسيوم.
   ملاحظة: حقن عينة مراقبة جودة (1 جم/لتر L-L-L-L-لاکتات) كل 10 عينات لمراقبة استقرار النظام. التغير المقبول في وقت الاحتفاظ هو <0.2 دقيقة وذروة تغير المساحة <5٪ مقارنة بمعيار المعايرة الأولي.
8. احسب عائد حمض اللاكتيك. استيفاء مساحة الذروة لكل عينة في المنحنى القياسي للحصول على تركيز L-Lactate في الكالسيوم (g/L).
   ملاحظة: حول إلى تركيز حمض L-لاكتيك باستخدام نسبة الوزن الجزيئي:
   (3)
   احسب نسبة التحسن:
   (4)
9. حدد السلالات النهائية عالية الإنتاجية. اختر السلالات التي تظهر باستمرار إنتاجا أعلى من حمض L-لاكتيك مقارنة بالسلالة الأبوية كطفرات مثبتة. اختر أفضل مؤدي لمزيد من التوصيف.

11. تقييم الاستقرار الجيني للسلالات عالية الإنتاجية

1. انثر السلالة المتحولة المختارة على ألواح بذور متوسطة الأجار. حضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. هذا هو الجيل الأول.
2. اختر مستعمرة واحدة من صفيحة الجيل الأول وقم بتطعينها في 5 مل من وسط البذور السائل في أنبوب بسعة 50 مل. الحضانة عند 50 درجة مئوية وسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة للحصول على زراعة بذور F1.
3. انقل 10٪ (v/v) من مزرعة البذور من الجيل الأول إلى 50 مل من وسط التخمير (يحتوي على 4٪ مع زيت CaCO₃ معقم) في قارورة هزة بسعة 250 مل. حضانة عند 50 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
4. اجمع 1 مل من الزراعة بعد التخمير. جهاز الطرد المركزي عند 13,800 × جرام لمدة دقيقتين، وتخفيف المادة الفائقة 100 ضعف بماء فائق النقي، وقس تركيز حمض اللاكتيك L-اللاكتيك بواسطة HPLC. استخدم ثلاث قوارير مستقلة لكل جيل.
5. للحصول على الجيل التالي، ضع حلقة من زراعة الجيل الأول على طبق بذور طازجة من الأجار المتوسط. حضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. كرر الخطوات 11.2 و11.3 للجيل الثاني.
6. كرر عملية الزراعة الفرعية للحصول على الجيل الثالث والرابع. لكل جيل، حضر ثلاث قوارير اهتزاز وقوس إنتاج حمض اللاكتيك بواسطة HPLC.
7. قارن نتائج الأجيال الأربعة (1–4) باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه أو اختبار t الطالب. يعتبر السلالة مستقرا وراثيا إذا لم يلاحظ فرق كبير (p > 0.05) في إنتاج حمض اللاكتيك بين الأجيال.

النتائج

استنادا إلى منصة الميكروفلويديك القطرية الآلية، تم إنشاء نموذج فحص عالي الإنتاجية. تم بناء مكتبة طفرة من B. coagulans بواسطة طفرات ARTP بزمن إشعاع مثالي يبلغ 20 ثانية، مما أعطى معدل فتة يقارب 90٪ (الشكل 4A). ثم تم تغليف الخلايا المتحولة في قطرات بحجم 14 بيلومتر، قطرها حوالي 30 ميكرومتر، بمعدل توليد 1500 هرتز (الشكل 4B). بعد الحضانة عند 45 درجة مئوية لمدة 10 ساعات، تم حقن الحساس بتقنية البيكو في كل قطرة بمعدل 200 هرتز (الشكل 4C). تم إجراء فرز القطرات المنشطة بالفلورة عند 100 هرتز باستخدام ليزر 488 نانومتر (الشكل 4D). تم تفكيك القطرات الموجبة المفرزة، وتم اختيار مستعمرات واحدة للتحقق من الواقع. تم زراعة المستعمرات المختارة أولا في ألواح بئر عميقة بطول 24 بئرا تحتوي على وسط تخمير عند 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. تم قياس التألق لكل بئر باستخدام قارئ ميكرولوح عند أطوال موجية للإثارة والانبعاث 485 نانومتر و515 نانومتر على التوالي. تم اختيار نسخ أظهرت فلورة أعلى من متوسط السلالة الأبوية بالإضافة إلى ثلاثة انحرافات معيارية. تم نقل هذه المرشحات لاحقا إلى قوارير الاهتزاز بسعة 250 مل مع لقاح 10٪ وتم تخميرها تحت نفس الظروف لمدة 24 ساعة أخرى. تم تحديد تركيز حمض اللاكتيك إل-لاكتيك أخيرا بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (الشكل 4E).

للتحقق من جدوى استخدام حساس حمض اللاكتيك لفحص السلالات المنتجة لحمض اللاكتيك عالي الإنتاج، تم توصيف الحساس أولا. للتحقق من إمكانية استشعار حمض اللاكتيك للكشف في الصفائح الدقيقة، أضيفت معايير حمض اللاكتيك (1، 10، 100، 1000، 10000، 10000 ميكرومول) إلى صفائح الميكروتيتر، مع إضافة 100 ميكرولتر من خليط حساس حمض اللاكتيك إلى كل بئر. أظهرت النتائج أن شدة الفلورة زادت مع زيادة تركيز حمض اللاكتيك من 100 ميكرومولار إلى 10 مللي مو. أظهر المستشعر استجابات فلورية قوية لكل من حمض L-لاكتيك (الشكل 5A). ومع ذلك، يظل مناسبا تماما للدراسة الحالية لسببين. أولا، B. coagulans ATCC 7050 هو منتج لحمض L-لاكتيك يتميز جيدا بتكوين ضئيل لحمض D-lactic، كما أكدته ملفه الأيضي الذي يهيمن عليه L-LDH. ثانيا، تم التحقق من صحة دقة المستشعر في قياس حمض اللاكتيك في عينات التخمير الفعلية بالمقارنة مع HPLC (الشكل 5B). لذلك، وعلى الرغم من التفاعل المتقاطع في المختبر مع حمض D-لاكتيك، فإن المستشعر يبلغ بشكل موثوق عن مستويات حمض L-لاكتيك في سير عمل الفحص لدينا. للتحقق من إمكانية الكشف الكمي عن حمض اللاكتيك باستخدام حساس حمض اللاكتيك، تم قياس معدلات استرداد المستشعر في كل من المحلول المائي ووسط الفحص. أظهرت النتائج معدل استرداد مرتفع بلغ 108.81٪ في وسط الفحص و98.39٪ في المحلول المائي على التوالي، مع انحرافات معيارية نسبية < 5٪ (الشكل 5C). الارتفاع الطفيف في الوسط يقع ضمن النطاق المقبول بين 90–110٪، مما يشير إلى عدم وجود تداخل مصفوفي كبير. في اختبارات الألواح الدقيقة، تم خلط الحساس بنسبة 1:1 مع معايير حمض اللاكتيك، وتم حضنه لمدة 5 دقائق، وأظهر خطية ممتازة في نطاق 0–0.6 جم/لتر (الشكل 5D). علاوة على ذلك، مكنت طريقة الفلورة من اكتشاف 96 عينة خلال 5 دقائق، مما يمثل انخفاضا بمقدار 384 ضعفا في إجمالي وقت الكشف مقارنة ب HPLC. وللتحقق من جدوى مستشعر حمض اللاكتيك في الفحص القائم على القطرات، تم تصنيع قطرات تحتوي على حمض L-لاكتيك بتركيزات مختلفة، وتم حقن حجم متساو من حساس حمض اللاكتيك في كل قطرة. تم اكتشاف شدة الفلورة للقطرات باستخدام منصة القطرات الميكروفلويدية الآلية. أظهرت النتائج إزاحا ملحوظا نحو اليمين في إشارة الفلورة مع زيادة تركيز حمض اللاكتيك اللاكتيك (الشكل 5E). للتخزين، تم تزويد حساس اللاكتات بجلسيرول بنسبة 5٪ وتم تخزينه عند -80 درجة مئوية، مما حافظ على ثبات الكشف لمدة لا تقل عن شهر واحد (الشكل التكميلي 6).

بالإضافة إلى اختيار حساس مناسب للتكاثر باستخدام تقنية FADS، فإن تحديد مدة الزراعة المثلى للسلالات في القطرات أمر بالغ الأهمية. يمكن أن يؤدي وقت الزراعة غير الكاف إلى إفراز حمض L-لاكتيك غير كاف، مما يؤدي إلى إشارات فلورية منخفضة تفشل في التمييز بين السلالات ذات العائد العالي والمنخفض. وعلى العكس، يمكن أن يؤدي وقت الزراعة الطويل جدا إلى تراكم مفرط لحمض اللاكتيك اللاكتيك، مما يتجاوز نطاق اكتشاف حساس حمض اللاكتيك. لمعالجة هذه المشكلة، تم تحسين مدة زراعة السلالات في القطرات من خلال مراقبة حالة نموها ديناميكيا. دخلت السلالات مرحلة النمو اللوغاريتمي عند 6 ساعات من الزراعة في قطرات، وزادت الكتلة الحيوية البكتيرية في القطرات بشكل ملحوظ عند 10 ساعات (الشكل 6A). على النقيض من ذلك، عندما تجاوزت مدة الزراعة 12 ساعة، أظهرت القطرات انكماش واضحا. يعزى هذا الظاهرة إلى تغيرات الضغط الأسموزي داخل القطرات خلال المرحلة المتأخرة من نمو الإجهاد، مما يؤدي إلى انكماش القطرات. يمكن أن يؤدي هذا الانكماش إلى أحجام حقن بيكو غير متسقة بين القطرات المختلفة في التجارب اللاحقة. لتحديد الوقت الأمثل للزراعة، تم حقن حجم مماثل من حساس حمض اللاكتيك في قطرات مزروعة لفترات مختلفة. وجد أن إشارة الفلورة للقطرات تحسنت بشكل ملحوظ بعد 10 ساعات من الزراعة؛ لذا، تم اختيار 10 ساعات كأفضل مدة زراعة للسلالات في القطرات (الشكل 6B).

في جولة واحدة من الفحص، تم فرز القطرات باستخدام شريحة فرز بمعدل 100 هرتز لمدة 4 ساعات، وتم جمع أعلى 0.1٪ من القطرات ذات أعلى شدة فلورية (الشكل 6C). تم جمع القطرات الموجبة في أنبوب تجميع معقم وعالجت ب 500 ميكرولتر من مزيل البذور و500 ميكرولتر من وسط البذور الطازج. بعد هز لطيف لمدة 5 دقائق، تم أخذ 20 ميكرولتر من الطور المائي العلوي، وتخفيفه 10 أضعاف، ونشره على لوحين صلبين من الأجار. بعد الحضانة عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة يومين، تم اختيار 200 مستعمرة منفردة عشوائيا وتطعينها في صفائح بئر عميقة بعمق 24 بئرا لزراعة التوسع. من بين 200 نسخة مستنسخة، أظهرت 78 سلالة متفرة إنتاجات أعلى من حمض L-لاكتيك مقارنة بالسلالة الأب (الشكل التكميلي 7). ثم خضعت هذه ال 78 طفرة للتحقق من صحة الشفرات الزجاجية، وتم الحصول أخيرا على 17 سلالة ذات إنتاجية محسنة مقارنة بالسلالة الأبوية. من بينهم، أظهر ADC-17 المتحولين أكبر زيادة، من 57.2 جم/لتر إلى 67.04 جم/لتر، مما يمثل تحسنا بنسبة 17.2٪ (الشكل 6D). تم تقييم الاستقرار الجيني ل ADC-17 على مدى أربعة أجيال متتالية. لم يلاحظ فرق ذي دلالة إحصائية بين الأجيال الأربعة (p > 0.05)، مما يشير إلى أن سمة الإنتاجية العالية ل ADC-17 بقيت مستقرة على مدى أربع مزارع فرعية متتالية (الشكل 6E). تظهر هذه النتائج كفاءة وموثوقية منصة FADS، التي تستخدم حساس حمض اللاكتيك لإثراء السلالات عالية العائد من مكتبات طفرة عشوائية في جولة فحص واحدة.

الشكل 1: تركيب منصة القطرات الميكروفلويدية الآلية. (أ) الهيكل الداخلي للمنصة. يتكون من أربع وحدات أساسية: التحكم بالسوائل المدفوعة بالضغط، تصوير CMOS عالي السرعة، كشف الفلورة المزدوج بالليزر 488 نانومتر/633 نانومتر، ونظام تحكم مضيف لمعالجة القطرات وإخراج البيانات. (ب) منصة تشغيل منصة القطرات الميكروفلويدية الآلية. تشمل المكونات الموسومة أ. منصة الوضع، ب. كاميرا عالية السرعة، ج. أقطاب الريب، د. مشبك تثبيت الشريحة، ه. أخدود وضع الشريحة، و. حمام معدني، ز. مضخة الهواء 1: تتحكم في طور الزيت، ح. مضخة الهواء 2: تتحكم في العينة. مضخة الهواء 3: تتحكم في حقن الكواشف. يتم إنشاء الشكل 1A باستخدام Biorender، ويتم توفير ترخيص حقوق النشر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: المستهلكات التجريبية. (أ) أنبوب الحقن: لحقن طور الزيت، وتعليق البكتيريا في العينة، ومحلول الكاشف. (ب) أنبوب الجمع: لجمع القطرات والزراعة اللاحقة. (ج) شريحة تحضير الرذاذ: تولد قطرات بحجم 14 بسول. (د) شريحة حقن قطرات دقيقة: تحقن الكواشف في القطرات. (E) شريحة فرز القطرات: تقوم بفرز السلالات الموجبة عبر الأقطاب الكهربائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: واجهات البرمجيات الرئيسية لمنصة الميكروفلويديك القطرية الآلية. (أ) مقدمة واجهة برنامج توليد القطرات. ج. ابدأ: انقر لبدء توليد القطرات. ب. السرعة: اضبط معدل توليد القطرات. ج. الحجم: اضبط حجم القطرة. د. إيقاف: انقر لإيقاف تكوين القطرات. (ب) واجهة حقن بيكو بقطرة. ه. حجم الحقن: اضبط حجم حقن الكواشف. F. قوة الاندماج: ثلاثة مستويات جهد (عالية/متوسطة/منخفضة). (ج) مقدمة واجهة فرز القطرات. ج. ليزر. اختر نوع الليزر (488 نانومتر أو 633 نانومتر). ه. تسجيل البيانات. I. قوة الانحراف: ثلاثة مستويات جهد (عالية/متوسطة/منخفضة). ج. مفتاح الفرز: انقر لبدء فرز القطرات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: سير عمل الفحص عالي الإنتاجية يعتمد على منصة الميكروفلويديك القطرية الآلية. (أ) بناء مكتبة المتحولين عبر الطفرات ARTP. (ب) توليد القطرات والحضانة. الخلايا المفردة مقسمة إلى قطرات بيكوليتر. (ج). حقن بيكو بقطرة. يتم حقن حساس فلوري بيكو في كل قطرة. (د) فرز القطرات. القطرات ذات الفلورة العالية (مما يشير إلى إنتاج عالي لحمض اللاكتيك) تثرى بواسطة FADS. (ه) التحقق الإيجابي من النسخ في الألواح الصغيرة وقوارير الاهتزاز. الاختصار؛ FADS = فرز القطرات المنشطة بالفلورة. تم إنشاء الشكل 4 باستخدام Biorender، وتم توفير ترخيص حقوق النشر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: توصيف حساس حمض اللاكتيك في المختبر. (أ) نطاق استجابة حساس حمض اللاكتيك لحمض اللاكتيك لحمض اللاكتيك. الإثارة/الانبعاث = 485/515 نانومتر. متوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3، كل منها يحتوي على تكرارات تقنية ثلاثية). (ب) الارتباط مع HPLC. تم تحليل ست عينات تخمير (نقاط زمنية مختلفة) كل منها مرة واحدة بواسطة كل من حساس اللاكتات وHPLC. أعطى الانحدار الخطي R² = 0.9927. الإثارة/الانبعاث = 485/515 نانومتر. (ج) تجربة استعادة حمض اللاكتيك. تم إدخال حمض اللاكتيك L-اللاكتيك في مياه فائقة النقاء ووسط فحص بمعدل 0.5 جم/لتر. البيانات هي متوسط ± SD (n = 3 تجارب مستقلة). كانت معدلات التعافي 98.39٪ (ماء) و108.81٪ (متوسط فحص)، مع < 5٪ من الأمراض المنقولة جنسيا. الإثارة/الانبعاث = 485/515 نانومتر. (د) تحسين وقت الكشف. تم خلط الحساس مع معايير حمض اللاكتيك L-اللاكتيك (0–0.6 جم/لتر) وحضنه لمدة 0، 5، 10، 15، 20، 25، و30 دقيقة. أعلى R² = 0.990 تم الحصول عليه بعد 5 دقائق من الخلط. البيانات مأخوذة من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3). الإثارة/الانبعاث = 485/515 نانومتر. (ه) مخطط فلورة قطرات. تم تحليل ما لا يقل عن 2000 قطرة لكل تركيز من حمض اللاكتيك. قناة الكشف: 488 نانومتر، DC (V) = إشارة الجهد التي تمثل شدة الفلورة للقطرة. الاختصار؛ STD = الانحراف المعياري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: فحص عالي الإنتاجية لبي . كواجولان مع إنتاج عالي لحمض اللاكتيك. (أ) لوحظ شكل الإجهاد داخل القطرات عند 0، 2، 4، 6، 8، و10 ساعات. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. مدة التعرض: 100 مللي ثانية. (B) تغيرات في شدة الفلورة لقطرات تحتوي على B. coagulans بعد الحضانة لفترات مختلفة، مع حقن حساس حمض اللاكتيك. تم التقاط الصور بزمن تعريض يبلغ 2000 مللي ثانية وزيادة 1500٪. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (C) توزيع شدة الفلورة للقطرات. عتبة الفحص: شدة FL > 2750 (a.u.). قناة الكشف: 488 نانومتر (D) عوائد حمض L-لاكتيك (g/L) للسلالة الأبوية (ATCC 7050) وطفرات إيجابية ممثلة. البيانات هي متوسط ± SD (n = 3 قوارير هزة مستقلة لكل سلالة). p < 0.0001 مقارنة بالسلالة الأبوية. أما أفضل متحول أداء، ADC-17، فيظهر زيادة بنسبة 17.2٪. (ه) الاستقرار الجيني للكلب الأعلى أداء B. coagulans ADC-17 على مدى أربعة أجيال متتالية (1–4). تم تحديد إنتاجية حمض اللاكتيك اللي-لاكتيك بواسطة HPLC بعد تخمير الشف-قوارير لمدة 24 ساعة. البيانات هي متوسط ± SD (n = 3 قوارير لكل جيل). لم يظهر تحليل التنويف العشوائي أحادي الاتجاه فرقا ذا دلالة إحصائية بين الأجيال (p > 0.05، نانوثان). الاختصار؛ HPLC = الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء؛ SD = الانحراف المعياري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: تنقية حساس اللاكتات eLACCO1.1. تم تفريغ البروتين بإميدازول 500 ملليمولار وتخزينه عند -80 درجة مئوية مع 5٪ جلسرول. تركيز العمل هو 0.1 ملغ/مل، وحد الكشف هو 2 ملغ/لتر. تم إعادة إنشاء الشكل التكميلي 1 بالكامل من قبل المؤلفين باستخدام أدوات الرسم الأصلية في مايكروسوفت باوربوينت (بما في ذلك الأشكال الأساسية والخطوط وصناديق النص). لم تستخدم أي أيقونات أو قوالب أو مصادر صور خارجية من طرف ثالث. جميع العناصر هي من إبداعات المؤلفين الأصليين. لذلك، لا يتطلب هذا الرقم أي ترخيص نشر إضافي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: منحنى نمو B. coagulans ATCC 7050. تم تربية السلالة في وسط بذور عند درجة حرارة 50 درجة مئوية مع هز عند 200 دورة في الدقيقة. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (n = 3 ثقافات مستقلة). وصلت الثقافة إلى المرحلة اللوغاريتمية المتأخرة عند حوالي 12 ساعة، وتم استخدام هذه النقطة الزمنية لتحضير اللقاح في التجارب اللاحقة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: منحنى معايرة OD₆₀₀ مقابل تركيز الخلايا القابل للحياة ل B. coagulans ATCC 7050. تم إعداد تخفيفات متسلسلة لزراعة طور منتصف اللوغاريتم، وتم قياس OD₆₀₀ . تم تحديد وحدات تكوين المستعمرات المقابلة (CFU/mL) عن طريق نشر 100 ميكرولتر من التخفيفات المناسبة على صفائح الأجار المتوسطة للبذور وحضانها عند 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (n = 3 تجارب مستقلة). وفقا لهذا المنحنى، تعادل OD₆₀₀ = 0.5 تقريبا 1 × 10⁸ CFU/mL. تم استخدام هذا التعديل لتحديد كثافات الخلايا الأولية لتغليف القطرات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4: منحنى الموت ل B. coagulans ATCC 7050 تحت طفرات ARTP. تعرضت الخلايا لبلازما الهيليوم لفترات مختلفة (5، 10، 15، 20، 25، 30 ثانية). بعد التعريض، تم طلاء الخلايا على وسط أجار البذرة، وتم عد CFU بعد 24 ساعة حضانة عند 50 درجة مئوية. تم حساب القاتلة (٪) وفقا للمعادلة (2). تعرض البيانات كمتوسط ± SD (n = 3 نسخ مستقلة). يشير السهم إلى زمن الطفرات المختار (20 ثانية) بمعدل فتة يقارب 90٪. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 5: تحديد كفاءة تغليف الخلية الواحدة بواسطة تلوين DAPI. B. coagulans تم صبغ خلايا ATCC 7050 بمادة DAPI وغلفها في قطرات عند λ = 0.1. تم فحص ما مجموعه 2000 قطرة تحت مجهر فلوري، وتم عد عدد القطرات التي تحتوي على 0 أو 1 أو ≥2 خلية. كانت كفاءة تغليف الخلية الواحدة المرصودة 11.2٪، وهي أعلى قليلا من التوقع النظري لبواسون (9.0٪ ل λ = 0.1). يعزى هذا الانحراف إلى عوامل مثل التشتت النشط للخلايا، وتلوين DAPI غير المحدد، وتفكك التجمعات الصغيرة الناتجة عن القص أثناء تكوين القطرات. شريط المقياس: 30 ميكرومتر. تم تحليل ما لا يقل عن 2000 قطرة صغيرة. تم التقاط الصور بزمن تعريض يبلغ 2000 مللي ثانية وزيادة 1500٪. الاختصار؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 6: استقرار تخزين المستشعرات.  يظهر استجابة الفلورة للحساس المخزن عند -80 درجة مئوية مع 5٪ جليسرول خلال أربعة أسابيع. لم يلاحظ فقدان كبير في الإشارة، مما يؤكد استقرار تخزين جيد (p > 0.05). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: نتائج الفحص الأولية ل 78 سلالة تظهر إنتاج حمض اللاكتيك أعلى من الضابط في صفائح البئر العميقة. تم تحديد ما مجموعه 78 سلالة طفرة تجاوزت إنتاجية حمض اللاكتيك L-اللاكتيك في هذا الفحص الأولي. جميع بيانات السلالات الطفرة تمثل نتائج فحص نقطة واحدة دون وجود نسخ بيولوجية. تم توزيع السلالة الأم (التحكم) عشوائيا عبر 24 صفيحة بئر عميقة كمرجع، وتعرض بياناته كمتوسط انحراف معياري ± عبر ثلاث نسخ مستقلة من الصفائح ذات عمق 24 بئر (n = 3). يظهر المحور y عائد حمض L-لاكتيك (g/L) لكل سلالة على المحور x؛ تظهر أشرطة الخطأ فقط في التحكم في الإجهاد الأب. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول سير عمل موحد لفحص الميكروبات الصناعية يعتمد على منصة ميكروفلويدية آلية للقطرات. يشمل سير العمل المتكامل بناء مكتبات الطفرات، وتوليد القطرات وتغليف الخلية الواحدة، وزراعة المفاعلات الدقيقة، وحقن المستشعرات الحيوية، وفرز القطرات المنشطة بالفلورة، والتحقق النهائي من السلالات المستهدفة. باستخدام فحص عالي الإنتاجية لمادة B. coagulans المنتجة لحمض L-لاكتيك عالية الإنتاجية كحالة تحقق، أظهر هذا السير عدة مزايا مقارنة بطرق الصفائح الدقيقة التقليدية وصفائح الأجار في سياق تحسين سلالات B. coagulans. من حيث معدل الفحص والكفاءة، تستفيد المنصة من رقائق الميكروفلويديك لتوليد ومعالجة آلاف إلى عشرات الآلاف من القطرات في الثانية بالتوازي، محققة زيادة تقارب^{10 أضعاف} في معدل الفحص في جولة واحدة^{مقارنة بالطرق} التقليدية المعتمدة على الميكروبلوت. بالنسبة للب. تخثر، يمكن لسير العمل فحص 10 إلى⁶ قطرات خلال 4 ساعات، مما يقلل دورة تطور السلالة من عدة أسابيع إلى بضعة أيام فقط، ويسرع بشكل كبير عملية التكاثر. كفاءة الفحص في نظام FADS تفوق تقريبا 3 × 10 أضعاف كفاءة نظام الفحص القائم على اللواح، مع تقليل كبير من تكاليف البنية التحتية والعمالة والمواد الاستهلاكية¹³. ومع ذلك، وبسبب الخصائص الجوهرية للكائنات الدقيقة المختلفة، هناك حاجة إلى تحسين مستهدف لهذا سير العمل القياسي. على سبيل المثال، بعد 36 ساعة من زراعة الخميرة، تؤدي تغيرات الضغط الأسموزي إلى تقليل حجم القطرات، مما يستلزم تعديلات على مدة الحضانة لضمان استقرار عمليات الحقن والفرز¹⁴. بالنسبة للفطريات الخيطية، عادة ما يكون من الضروري زيادة حجم القطرات لمنع كسر أو اندماج واجهة القطرات بسبب نمو الميسيليا^15،16.

بالإضافة إلى ذلك، وبسبب الحجم الصغير جدا لقطرات مقياس البيكوليتر، من الضروري تطوير حساسات حيوية فلورية مخصصة لكل منتج مستهدف. تتوفر بالفعل عدة كواشف كشف فلورية كلاسيكية للبروتيازات ومستقلبات الجزيئات الصغيرة تجاريا، مثل تلك الخاصة ببيروكسيد الهيدروجين¹⁷، الجليكوزيداز¹⁸، الإيثانول¹⁹، والجلوكوز²⁰. ومع ذلك، فإن المجسات الفلورية المصنعة كيميائيا لها أنواع محدودة وتميل إلى تسرب القطرات إلى القطرات الفارغة المجاورة، مما يؤدي إلى ارتفاع التألق الخلفي. ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى أن الجزيئات الفلورية الكارهة للماء يمكنها بسهولة اختراق واجهة النفط والماء²¹.

في السنوات الأخيرة، تشمل المستشعرات الحيوية بشكل رئيسي نوعين: الحساسات الحيوية المشفرة وراثيا وأجهزة الاستشعار الحيوية المعتمدة على عامل النسخ (TF). تشير أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية المشفرة جينيا إلى البروتينات الكيميرية التي يمكن التعبير عنها داخل الخلية وهندستها لتعمل كحساسات لمراقبة نقل الإشارات في الجسم الحي. نظرا لاستقرارها الممتاز، واستجابتها السريعة للفلورسنت، وخصوصيتها العالية، تم تطبيق حساسات حيوية فلورية مشفرة وراثيا في سيناريوهات متعددة²². استخدم فريق جهاز الاستشعار الفلوري المعتمد على الشدة (iGluSnFR) ضمن نظام فرز قطرات ميكروفلويدية، مما أسس سير عمل عالي الإنتاجية لفحص طفرات البكتيريا الأميلوليكيفاسيين التي تعزز إنتاج الجلوتاميناز. مكنت هذه المنصة القائمة على المستشعرات الحيوية نسبة إثراء 56 ضعفا وفي النهاية عزلت متحورا يزيد إنتاجه عن 47٪ من مكتبة طفرات جينومية كاملة مكونة من¹⁰ أعضاء مكونة من 5 أعضاء^.

أجهزة الاستشعار الحيوية الكاملة للخلية المعتمدة على عامل النسخ (TF) هي فئة مهمة من أجهزة الاستشعار الحيوية للخلية الكاملة، مبنية حول عوامل النسخ. عوامل النسخ هي فئة من البروتينات التي تنظم التعبير الجيني عن طريق الارتباط بتسلسلات DNA محددة¹⁴. يتم تنشيط بعض عوامل النسخ عند ارتباطها بالمواد المجمعية أو المركبات الخارجية؛ تعرف هذه بعوامل النسخ الألوستيري (aTFs). بمجرد تفعيلها، تخضع aTFs لتغيرات في التكوين تؤدي بدورها إلى انفصالها عن تسلسل الحمض النووي أو ارتباطها بتسلسل الحمض النووي في أعلى مجرى الجينات المستهدفة، مما يؤدي إلى تنشيط أو تثبيط تعبير تلك الجينات. يمكن دمج عوامل النسخ مع عناصر DNA أخرى شائعة الاستخدام في علم الأحياء التركيبي (مثل المحفزات، مواقع ارتباط الريبوسومات، المينائيات، وجينات المبلغ) لبناء دوائر جينية مستشعرة حيوية تعتمد على TF. يمكن لهذه العناصر الجينية استشعار تركيز الروابط المختلفة في الخلية أو البيئة والاستجابة وفقا لذلك²⁴. تم تنفيذ اكتشاف الإريثريتول بنجاح باستخدام حساس حيوي قائم على عامل النسخ مدمج مع منصة FADS، مما يسمح بعزل سلالة طفرة مع تحسن كبير في إنتاج الإريثريتول¹⁴. يحمل تطوير هذين النوعين من أجهزة الاستشعار الحيوية إمكانات كبيرة لتعزيز تطبيق منصات FADS في التكاثر الميكروبي، مع تجاوز قيود المجسات الكيميائية التقليدية وتوسيع نطاق المنتجات المستهدفة التي يمكن فحصها.

باختصار، تم تقديم سير عمل قياسي لفحص عالي الإنتاجية للكائنات الدقيقة الصناعية. وقد أظهرت موثوقية هذا السير من خلال تطبيقه الناجح في فحص سلالات B. coagulans المنتجة لحمض L-lactic عالية الإنتاجية. يوفر هذا السير مرجعا قيما للباحثين المستقبليين الذين يقومون بفحص عالي الإنتاجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	لتحضير الصفيحة الصلبة
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	مسح وتطهير مكاتب المختبرات والأجهزة
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	تم استخدام ARTP  لبناء مكتبة المتحولات لتحور السلالات.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	استخدم B. coagulans ATCC 7050 كسلعة أساسية للتحور وهدف لفحص القطيرات عالي الإنتاج.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	تم استخدام الصفيحة الدقيقة السوداء ذات 96 فتحة لاختبارات مستشعر اللاكتات وتحديد تركيز حمض اللاكتيك.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	لعزل المنتجين المفرطين للحمض اللاكتيك L-
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	يستخدم كلوريد الكالسيوم في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	يستخدم كعينات لتحضير المنحنى القياسي في عملية الكشف.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	يستخدم لتخفيف السائل البكتيري
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	لجمع القطيرات والزراعة اللاحقة
Computer	Lenovo	E450	تركيب البرنامج والتحكم في خلية DREM.
DAPI	Solarbio	c0065	لصبغ الخلايا.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	للتحقق الأولي من عائد B. coagulans المتحولات باستخدام صفائح بعمق جيد
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	يستخدم عامل إزالة استحلاب القطيرات لتكسير القطيرات المائية داخل الزيتية الدقيقة وإطلاق الخلايا أو السلالات أو المحلول فوقي للكشف والتحليل اللاحقين.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	يستخدم D-Glucose في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	يستخدم السترون الهيدروجيني ثنائي الأمونيوم في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	يستخدم الفوسفات الهيدروجيني ثنائي البوتاسيوم اللامائي في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	للتحكم في أداة خلية DREM. يعتبر برنامج DREM برنامجًا تجاريًا مملوكًا حصريًا لأداة DREM Cell من قبل شركة Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. ولا يوجد لديه وصول رسمي أو رابط تنزيل رسمي ويمكن توزيعه فقط مع الأداة تحت التفويض.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	استخدم لتغليف الخلايا الفردية وفرزها عالي الإنتاجية لفحص السلالات عالية الإنتاج بسرعة من مكتبة المتحولات.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	يستخدم شريحة توليد القطيرات لإنتاج قطرات أحادية اللون بحجم بيكوليتر (pL) للتغليف الفردي للخلايا.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	يستخدم شريحة الحقن الدقيقة للقطيرات لتحقيق حقن دقيق وتتبع الكواشف في القطيرات المتكونة مسبقًا لتفاعلات كيميائية حيوية لاحقة.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	يستخدم شريحة فرز القطيرات لفرز القطيرات المستهدفة التي تحتوي على خلايا عالية الإنتاجية بناءً على إشارات الفلوريسنس.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	يستخدم لتوسيع نطاق زراعة التحقق من السلالات المتحولة B. coagulans بعد الفحص الأولي بصفائح بعمق جيد، وذلك لتأكيد استقرار وقابلية تكرار السلالات عالية الإنتاج.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	يستخدم لترشيح محلول التخمير.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	استخدم مجهر الانعكاس الفلوري IX73 من Olympus لمراقبة شكل البكتيريا داخل القطيرات
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	يعمل الزيت الفلوري كمرحلة مستمرة في الميكروفلويديات القطيرية لإنشاء قطرات مائية داخل الزيتية مستقرة وحيدة اللون وغير متداخلة، مما يدعم زراعة الخلايا الفردية والكشف.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	يستخدم لفصل حمض اللاكتيك من المكونات الأخرى في محلول التخمير وفقًا لخصائص الاحتفاظ المختلفة، وذلك لتحقيق الكشف الكمي الدقيق لحمض اللاكتيك.
High-Performance Liquid Chromatography	Shimadzu	228-34001-02	يستخدم HPLC للكشف الكمي والتحليل لحمض اللاكتيك L في عينات التخمير.
Injection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	لحاقن طور الزيت، معلق بكتيريا العينة، ومحلول الكاشف
Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate
Laminar flow hood	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	يستخدم للتشغيل المعقم في زراعة وتخمير B. coagulans.
Magnesium sulfate heptahydrate	Sinopharm	10013018	يستخدم مستخلص الخميرة في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Manganese sulfate monohydrate	MACKLIN	M813856	يستخدم الكبريتات المنغنيزية أحادية الماء في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Microplate reader	TECAN	TCAT92000001	للكشف الفلوري عن خليط مستشعر اللاكتات وحمض اللاك