يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

12.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/904

⸱

أكتوبر 27, 2008

 , 
1Center for Environmental and Genetic Medicine, Institute of Biosciences and Technology - Texas A&M Health Science Center , 2Center for Environmental and Genetic Medicine, Texas A&M University (TAMU)

في هذه المقالة

ملخص

هذا الفيديو يوضح 2 لون جبل بأكمله في الموقع التهجين ، وهي الطريقة التي نمط التعبير المكاني والزماني لل2 جينات مختلفة يمكن تصور افراخ الدجاج في الشباب. وقدم أصلا من قبل هذه الطريقة ويلكنسون ديفيد ، هنريك دومينغوس ، إنجهام فيل وديفيد العش - Horowicz.

الملخص

الجنين الفرخ هو أداة قيمة في دراسة التطور الجنيني المبكر. شفافيته ، وسهولة الوصول وسهولة التلاعب ، وجعلها أداة مثالية لدراسة الجينات في الدماغ ، والأنبوب العصبي ، والقلب الجسيدة تشكيل primordia. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في 2 لون جبل بأكمله في الموقع التهجين ؛ أولا ، يتم تشريح الجنين من بويضة والثابتة في بارافورمالدهيد. الثانية ، يتم معالجة الجنين للprehybridization. غير المهجنة ثم الجنين مع اثنين من تحقيقات مختلفة ، واحدة بالإضافة إلى حفر ، واحد بالإضافة إلى FITC. بعد التهجين بين عشية وضحاها ، وحضنت الجنين مع الأضداد مقرونة DIG. يتم تنفيذ رد فعل اللون لالركيزة DIG ، ومنطقة ذات الاهتمام يظهر اللون الأزرق. ومن ثم حضنت الجنين مع FITC الضد جانب. تتم معالجة الجنين للتفاعل مع اللون FITC ، ومنطقة ذات الاهتمام يظهر باللون الأحمر. أخيرا ، يتم إصلاح الجنين ومعالجتها للphtograph وsectioning. وتقدم أيضا دليلا المشاكل.

البروتوكول

الجزء 1 : تحديد الأجنة

  1. ملء طبق تشريح الجليد الباردة مع depc - PBS. تبقي على الجليد. فتح البيضة من خلال الاستفادة من قذيفة مع ملقط قطع وإزالة القشرة.
  2. إزالة ألبومين سميك بالملقط. إمالة الكيس المحي مع ملقط الجنين الخشنة بحيث تواجه صعودا.
  3. باستخدام مقص ، وقطع مربعة من الكيس المحي حول الجنين.
  4. باستخدام ملعقة ، وإزالة الجنين من صفار البيض وتوضع على الجليد الباردة depc - PBS.
  5. تحت المجهر ، وإزالة الأغشية وصفار البيض ونقل إلى صحن التثبيت.
  6. دبوس باستمرار ، وإزالة depc - PBS. استبدال PFA 4 ٪ في depc - PBS والإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
  7. إزالة مثبت. استبدال الباردة الجليد depc - PBS. باستخدام إبرة حادة نهاية microcapillary أو سكين microdissection ، خرم الجهاز العصبي والقلب تجاويف ، لمنع محاصرة من التحقيق.
  8. غسل 2X 10 مليون depc - PBS بنسبة 0.1 ٪ توين - 20 (PBT). يذوى 10 دقيقة في كل من 25 ٪ و 50 ٪ و 75 ٪ في الميثانول PBT. يذوى الأجنة مرتين في الميثانول بنسبة 100 ٪. المحل في -20 درجة مئوية في الميثانول.

الجزء 2 : Prehybridization

  1. ترطيب الأجنة 10 دقيقة في كل من 75 ٪ و 50 ٪ و 25 ٪ في الميثانول PBT. غسل 2X 10 مليون في PBT.
  2. وفي الوقت نفسه ، تعد مثبت الجليد الباردة (4 ٪ في بارافورمالدهيد PBT). استبدال PBT مع الحل K بروتين (3 مل / فيال ؛ [؟ 5 غ / مل] النهائية في PBT). تأكد من أن يتعرض القارورة بالكامل إلى حل K بروتين من قبل المتداول بلطف القارورة ، وانظر لاستكشاف مرات التعرض.
  3. ريبونوكلياز مجانا باستخدام ماصة باستير إزالة بروتين كاف وإضافة تثبيتي (2 مل). المكان فورا على الجليد عن 20 دقيقة بالضبط.
  4. يتم تنفيذ كافة يغسل RT على nutator. غسل 2X 10 مليون في PBT ، و1X 10mn في PBT يحتوي على 50 ٪ العازلة التهجين.
  5. غسل 1X العازلة في التهجين. احتضان عند 65 درجة مئوية في 2 مل العازلة التهجين للساعة 4-5.

الجزء 3 : الأجنة يهجن مع تحقيقات

  1. ويوصف DIG FITC التوليف التحقيق يقترن في الملحق. لجنة التحقيق من المتوقع أن تعطي إشارة قوية ، ينبغي synhesized مع FITC المحتوية على النيوكليوتيدات ، وينبغي توليفها مع الأضعف التحقيق مع DIG المحتوية على النيوكليوتيدات.
  2. Prewarm تحقيقات في التهجين العازلة (500 نانوغرام / مل لكل منهما) باستخدام قارورة 2 مل. استبدال فورا العازلة التهجين مع الحل التحقيق. لا تدع الأجنة الجافة. احتضان لمدة 16 ساعة عند 65 درجة مئوية.
  3. محل التحقيق مع العازلة التهجين ، يغسل 2 ، 30 مليون في كل 65 درجة مئوية. غسل 15 مليون العازلة في التهجين / MABT (1 / 1 / V / V) عند 65 درجة مئوية.

الجزء 4 : DIG حضانة الأجسام المضادة والتفاعل اللون

  1. غسل 2x20 مليون في MABT. يغسل 1 ساعة 2 ٪ في ببر / MABT. يغسل 5 ساعة في 2 ٪ BBR/20 ٪ هيس / MABT (حظر العازلة). في احتضان الضد DIG 1:2000 مخففة في حجب العازلة ، O / N عند 4 درجات مئوية على nutator.
  2. غسل 3X 10 دقيقة في كل MABT و3X 1 ساعة في كل MABT.
  3. غسل 2X 20 دقيقة في NTMT. إضافة 200ul NBT / BCIP الركيزة لNTMT 10 مل. على الفور بإزالة NTMT من القارورة واستبدال 1-2 العازلة NBT / BCIP مل. تجري في الظلام. رصد رد فعل اللون بعد 20 دقيقة ، وبعد ذلك على فترات 20 دقيقة.
  4. بعد تفاعل الألوان (يجب أن يظهر اللون الأزرق) ، ويغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة ، دبوس باستمرار على تثبيت صحن مليء برنامج تلفزيوني ، واستبدال الحل مع PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني. الإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. نقل إلى قارورة التلألؤ جديدة. يغسل في PBST (PBS مع 1 ٪ توين - 20) مليون 2x10. يغسل في 10 دقيقة MABT 2X.
  6. احتضان MABT في 30 دقيقة في 63 درجة مئوية.

الجزء 5 : FITC حضانة الأجسام المضادة والتفاعل اللون

  1. غسل 2X 10 مليون في MABT ، 1 ساعة في 2 ٪ ببر / MABT ، 5 ساعة في حجب العازلة
  2. في احتضان الفوسفاتيز القلوية ، بالإضافة مكافحة FITC الضد جيم O / N عند 4 درجة (1:500)
  3. غسل 3X 10 دقيقة في كل MABT و3X 1 ساعة في كل MABT.
  4. يغسل في 2X 20 دقيقة في درجة الحموضة TBS 8.45 بنسبة 0.1 ٪ توين - 20 (TBST).
  5. إعداد ناقل الأحمر الحل العمل (5 مل) في TBST باستخدام الكواشف 1،2 و 3 الواردة في المجموعة. على الفور بإزالة TBST من قارورة واستبدالها مع العازلة الأحمر ناقل. تجري في الظلام. رصد رد فعل اللون بعد 40 دقيقة ، وعلى فترات 30 دقيقة بعد ذلك.
  6. بعد تفاعل الألوان (يجب أن يظهر اللون الأحمر) ونقل الأجنة في برنامج تلفزيوني.

الجزء 6 : التثبيت وتجهيز

  1. نقل لتثبيت صحن يحتوي على برنامج تلفزيوني ، والإصلاح في PFA 4 ٪ لمدة 20 دقيقة في RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
  2. يغسل في برنامج تلفزيوني ، 2X 10 مليون سهم. لعملية التصوير ، ونقل إلى الجلسرين 20 ٪ في برنامج تلفزيوني (وهذا سيجعل من أجنة شفافة). لإنشاء الغرفة ، وقطع الشريط 2 شرائح من البلاستيك ، ويطغى عليها على الشريحة. قطع مربعة في وسط باستخدام شفرة. إزالة مربع باستخدام ملقط.
  3. لعملية sectioning الشمع ، ونقل مرة أخرى إلى برنامج تلفزيوني ، وغسل 2X 10 دقيقة ، يذوى في سلسلة متدرجة من الميثانول (25 ٪ ، 50 ٪ ، 75 ٪ و 100 ٪ في برنامج تلفزيوني و 10 مليون لكل منهما).
  4. استبدال بروبانول ، 3mn. تليها 20 دقيقة مع استبدال tetrahydronaphthalene ، 1،2،3،4 ، التي Histoclear (2X 1 ساعة). استبدال histoclear / الشمع 1 / 1 (V / V) 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. استبدال بالشمع عمليةلعلم الأنسجة.

الجزء 7 : حلول

التهجين العازلة ، في مخزن -20 درجة مئوية في فالكون ، و 50 مل : 25 مل formamide ؛ 3.25 مل (20xSSC) 0.5 مل (0.5M EDTA) ؛ 1 مل (10 ٪ توين - 20) ؛ 2.5 مل (1 ٪ SDS) ؛ 125 UL (20mg/ml الحمض الريبي النووي النقال). 100ul (50 ملغ / مل الهيبارين) MABT ، وإعداد حمض المالئيك 100mM ؛ مع حبيبات هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني إلى 7.5. إضافة 150mM كلوريد الصوديوم و 0.1 ٪ توين - 20.

NTMT (الذي فقط قبل الاستعمال) ، و 50 مل : 1ml (كلوريد الصوديوم 5M) 2.5 مل (2M - تريس pH9.5 حمض الهيدروكلوريك) 1.25 مل (2M MgCl 2) و 5 مل (10 ٪ توين - 20).

TBST : 0.1M تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 0.15M ، ودرجة الحموضة 8.45 ، 0.1 ٪ توين - 20.

الجزء 8 : استكشاف

مشكلة سبب علاج
كرة لولبية حتى الجنين عدم كفاية الجفاف / الإماهة الحفاظ على 10 مليون خلال فترات الجفاف الخطوات / الإماهة المتعاقبة
لا يوجد أي إشارة التحقيق المسبار المتدهورة ريبونوكلياز التلوث في قارورة تشغيل المسبار في 1 ٪ هلام Agarose تأكد من أن ما يتعرض له قارورة بأكمله إلى حل K بروتين في الخطوة 2
المسبار التسميات تجاويف القلب أنبوب العصبي تحبس التحقيق في الخطوة 2 ، تأكد من أن جميع التجاويف هي مثقوبة سكين microdissection به أو microcapillary
تفككت الجنين التهجين التالية (الخطوة 3) غادر بروتيناز K الخطوة طويلا تهجين درجة الحرارة مرتفعة جدا لا ينبغي أن يترك بروتيناز K أطول من 1mn (مراحل 3 + و 4) ، 2 مليون (المرحلة 5-7) ، و 3 مليون (المرحلة 8-10) ، و 4 مليون (المرحلة 11-13) لا يهجن س تي في أعلى من 65 درجة مئوية

الجزء 9 : النتائج الممثل

وترد الأجنة ممثل أدناه : (أ) هو المسمى الأجنة (المرحلة HH7) مع التحقيق الذي تجريه DIG - سوكس (الأزرق) وFITC دلتا - 1 التحقيق (الحمراء). (ب) هو المسمى الأجنة (المرحلة HH8) مع التحقيق الذي تجريه - DIG Pax6 (الأزرق) والتحقيق FITC - SHH (الحمراء). NF ، أضعاف العصبية والشرطة الوطنية الأفغانية ، لوحة العصبية الأمامي ، PSM ، presomitic الأديم المتوسط ​​، ن ، notochord ، NT ، الأنبوب العصبي). الهدايا المسبار من مختبرات الدكاترة. جيم تابين ، M. غولدنغ ، وهنريك دال ، وجيه بريسكو.

figure-protocol-1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويستخدم جبل 2 لون كله في أسلوب التهجين لتحديد الموقع على حد سواء الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني ، وذلك باستخدام واحد أو اثنين من الجينات في المصالح. وتشمل التطبيقات تقييم أنماط التعبير الجيني للجينات جديدة (مثلا 1،2 ، فضلا عن التغيرات في التعبير الجيني إهانة التالية (التلاعب الجنينية 3 ، 4 حبات ، وelectroporation من الحمض النووي الريبي DNA أو يبني 5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة مارغريت Alkek M. إلى RHF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بيضحيوانCharles River LaboratoriesPremium Fertile
مجهر ستيريومجهرLeica MicrosystemsMZ9.5
حضانة Marsh الأوتوماتيكيةأداةLyonRX
حضانة تهجينأداةHybaidMicro-4
خلاط مداري Adams NutatorأداةFisher Scientific14-062
ملقط منحني (1)أداةElectron Microscopy Sciences72991-4C
مقص دقيقأداةFine Science Tools14161-10
ملعقةأداةFine Science Tools10370-18
ماصة شعيرية باستورElectron Microscopy Sciences70950-12
أنبوب شعيري دقيقSigma-AldrichP1049-1PAKيُسحب باستخدام ساحب ماصات دقيقة رأسي؛ تُبلد النهاية باستخدام ملقط دقيق
سكين تشريح دقيقFine Science Tools10056-12تُستخدم لثقب التجويفات قبل التهجين الموضعي
دبابيس Minuten بقطر 0.2mmFine Science Tools26002-20تُحفظ الدبابيس معاً باستخدام محرك مغناطيسي؛
عامل تصلب وقاعدة إيلاستومر السيليكون Sylgard 184كاشفDow Corning0001986475يُخلط جزء واحد من عامل التصلب مع 9 أجزاء من القاعدة؛ يُترك للتصلب طوال الليل عند 37C
ثنائي إيثيل بيروكربونات (depc)كاشفAcros Organics10025025يُضاف 1ml من depc إلى 1l من PBS؛ يُرج؛ يُعقم بالأوتوكلاف
16% PFAكاشفElectron Microscopy Sciences15710
Tween-20كاشفSigma-AldrichP1379-100ML
Proteinase KSigma-AldrichP2308-5MGيُحضر كمحلول مركز بتركيز 10 mg/ml في depc-H2O في حصص قدرها 10ul. يُحفظ عند -20C.
فورماميد، منزوع الأيوناتكاشفAmbion9342
tRNA الخميرة-25 mgكاشفInvitrogen15401-011يُحضر كمحلول مركز بتركيز 20 mg/ml في depc-H2O في حصص قدرها 125ul. يُحفظ عند -20C
ملح صوديوم الهيبارينكاشفSigma-AldrichH4784-250MGيُحضر كمحلول مركز بتركيز 50 mg/ml في depc-H2O في حصص قدرها 100ul. يُحفظ عند -20C.
SSC x20 pH5.5كاشفFisher ScientificPR-V4261
EDTA (0.5M)PR-V4231Fisher Scientific
SDSكاشفFisher ScientificBP166-100
حمض المالييككاشفFluka63189
كاشف حجب B–hringerكاشفRoche Group11096176001يُستخدم بتركيز 2% في MABT. للتحضير، يُسخن مع MABT لمدة 20 mn عند 60C. يمكن تحضير محلول مركز وحفظه في حصص 1-5 ml عند 20C.
مصل أغنام مثبط حرارياًكاشفJackson ImmunoResearch013-000-121يُذاب في 10 ml H2O؛ يُسخن عند 550C لمدة 30 mn. يُقسم إلى حصص 1ml، ويحفظ عند -20C.
Anti-Digoxigenin-AP، شظايا FabكاشفRoche Group11093274910
محلول مركز من NBT/BCIPكاشفRoche Group11681451001
Anti-Fluorescein-AP، شظايا FabكاشفRoche Group11426338910
2M TrisBP1759-500Fisher Scientific
طقم ركيزة الفوسفاتاز القلوية Vector RedكاشفVector LaboratoriesSK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthaleneكاشفSigma-Aldrich429325-100MLتحت غطاء سحب الغازات

المراجع

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تشريح جنين الدجاجالتثبيت باستخدام البارافورمالدهيدالمعالجة ببروتيناز كنزع الماء بالميثانولالحضانة في محلول التهجين المنظمالكشف عن الأجسام المضادة لـ DIGالكشف عن الأجسام المضادة لـ FITCتفاعل NBT-BCIP اللونيتفاعل Vector Red اللوني
الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.