طورنا الاستجابة الحسية الحركية لquantitate إخراج السيارات من الزرد اليرقات ردا على الزيادات الخفيفة والتناقصات. فحصنا أيضا المسوخ رؤية الزرد ، بما في ذلك أي optokinetic المسوخ (NRC) ردا على ذلك ، الذي كان يعتقد أن يكون أعمى تماما عند اختباره آخر مقايسة الرؤية ، والمنعكس optokinetic.
مقالة منهجية
والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ردة الفعل optokinetic (OKR) هو منعكس البصرية الأساسية التي أظهرتها معظم الفقاريات ، ويلعب دورا هاما في تحقيق الاستقرار في العين بالنسبة للمشهد المرئي. ومع ذلك ، يتطلب أن OKR حيوان الكشف عن خطوط نقل وأنه من الممكن أن الأسماك التي تفشل أن تظهر OKR قد لا يكون أعمى تماما. واحد الزرد متحولة ، وليس استجابة optokinetic ج (NRC) لا يوجد لديه OKR تحت أي ظروف الإضاءة اختبارها وأفيد أن تكون عمياء تماما. سابقا ، لقد أظهرنا أنه يمكن تسجيل OFF - العقدة نشاط الخلايا في هذه المسوخ. لتحديد ما إذا كان السمك متحولة مع عدم وجود مثل OKR متحولة NRC يمكن الكشف عن زيادات بسيطة وخفيفة التناقصات التي قمنا بتطويرها لفحص المحركات البصرية السلوكية (VMR). في هذا الاختبار ، يتم وضع واحد في كل اليرقات الزرد جيدا لوحة 96 - جيدا مما يسمح للرصد في وقت واحد من اليرقات باستخدام الفيديو الآلي لتتبع النظام. وسجلت ردود الحركي كل يرقة الى 30 دقيقة الضوء على و 30 دقيقة خارج الضوء وكميا. وزن الأسماك لديها ارتفاع وجيزة من النشاط الحركي عند أضواء ، والمعروفة باسم الاستجابة الانزعاجية ، تليها العودة إلى أدنى من النشاط الأساسي ، ودعا الى تجميد. WT الأسماك أيضا ارتفاعا حادا نشاطهم الحركي التالية مباشرة خارج الاضواء تدريجيا وفقط (أكثر من عدة دقائق) العودة الى النشاط الحركي الأساس. والمسوخ NRC الاستجابة للضوء وبالمثل كما OFF WT الأسماك ، ولكن يحمل انخفاض طفيف في متوسط نشاطهم مقارنة WT الأسماك. النشاط الحركي تأخر في الرد على الضوء على المسوخ في المصالحة الوطنية وبطيئا. هناك وقت الارتفاع البطيء للاستجابة لمتحولة NRC الضوء على ضوء مقارنة WT على الاستجابة. وتشير النتائج إلى أن المصالحة الوطنية ليست سمكة عمياء تماما. لأن teleosts يمكن الكشف عن الضوء في شبكية العين عن طريق المنظمات غير الأنسجة ، وأكدنا أن الاستجابة الفورية السلوكية للضوء التغييرات تتطلب كثافة عيون سليمة باستخدام (CHK) المسوخ شوخ ، التي تفتقر تماما العينين من المراحل الأولى للتنمية. في مقايسة VMR لدينا ، والمسوخ CHK يحمل أي رد على أي جفل الضوء أو إيقاف تشغيله ، يظهر أن العيون الجانبية التوسط هذا السلوك. وصف مقايسة VMR يكمل هنا مقايسة OKR الراسخة ، والتي لا اختبار قدرة اليرقات الزرد على الاستجابة للتغيرات في شدة الضوء. بالإضافة إلى ذلك ، التشغيل الآلي للمقايسة VMR يفسح المجال لسرعة عالية الكشف عن عيوب في شدة الضوء استجابات مدفوعة البصرية.
البروتوكول
هذا البروتوكول يحدد الخطوات اللازمة لتنفيذ الاستجابة الحسية الحركية من اليرقات الزرد إلى الزيادات الخفيفة والتناقصات في المختبر الخاص بك. الزرد هي نموذج كبير لنظام الدراسات السلوكية. فهي سهلة للحفاظ على ، لديهم أحجام مخلب كبير ، وأنها تتطور بسرعة. على سبيل المثال ، عيون اليرقات الزرد تستجيب لضوء النهار 3 من التنمية ، وأنها في الوقت الذي يبدي استجابة جفل.
الجزء 1 : التصفيحات الأسماك الفردية في 96 لوحة جيدا
- تنمو اليرقات وزن تحت دائرة الظلام / الضوء عند 28 درجة مئوية على الأقل حتى آخر أيام 4 الإخصاب (DPF). لدينا نموذجية ضوء : دورة الظلام هو 14 ساعة من الأضواء بدءا من الساعة 9:00 صباحا ، و 10 ساعة من خارج الاضواء ، ابتداء من الساعة 11:00. لتحقيق نتائج أفضل والسلوكية ، وتجنب الازدحام ، ونحن عادة لا تبقي أكثر من 50 اليرقات في طبق بتري واحد.
- بعد 4 DPF ، والزرد على استعداد لنقلهم الى لوحة 96 - جيدا. لإعطاء مزيد من غرفة اليرقات السباحة ، ونحن عادة استخدام لوحة 96 - جيدا مع الحجم الكبير جيدا من 650 ميكرولتر ، ومع ذلك ، ومعيار جيد لوحات 96 - تعمل على ما يرام. باستخدام الماصة نقل من البلاستيك ، ونقل بلطف one يرقة لكل بئر.
- بعد نقل الأسماك في الآبار ، وملء كل جيدا مع أسماك المياه ما يكفي من هذا القبيل أن تدفق المياه السطحية تقريبا إلى الجزء العلوي من الآبار. يمكن الملئ أو رتبة أدنى البئر قد يسبب مشاكل بصرية للكاميرا التسجيل. أيضا ، والحرص على عدم إدخال فقاعات في الآبار.
الجزء 2 : مسح للجهاز تسجيل
لهذا الجزء من البروتوكول ، يرجى الرجوع إلى الفيلم لتحديد مكوناتها وللتآلف مع مجموعة لدينا ما يصل من جهاز تسجيل.
- داخل غرفة تسجيل مكانا جيدا لوضع تعريف لوحة 96 - جيدا.
- يتم وضع الكاميرا في الظهر ، وركز على اللوحة باستخدام المرايا خارج منطقة الجزاء. ويمكن تعديل زاوية من هذه المرايا التي تحول البراغي التي تمسك المرايا في المكان.
- غير مضاءة في غرفة التسجيل من أسفل عن طريق المصابيح الحمراء. هذا يسمح للكاميرا لرؤية الأسماك حتى في الظلام. اليرقات لا يمكن الكشف عن ضوء الأشعة تحت الحمراء ، وحتى هذه الإضاءة الحمراء ثابت لا تؤثر على التجربة. تضيء المصابيح البيضاء أيضا من غرفة تسجيل أدناه. يتم التحكم فيها بشكل منفصل عن الاضواء الحمراء. تنير الغرفة مع الضوء الأبيض من فوق أو من الجانبين هو ممكن بالتأكيد ، ولكن في هذه الحالات ، يجب توخي الحذر لتجنب قوي يبرز على نحو فاضح قبالة المياه السطحية التي قد تتداخل مع الكاميرا.
- عن التجارب التي تستمر لفترة أطول من بضع ساعات ، وملء الغرفة مع ادارة المياه برفق للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة ثابتة لفترة تجريبية. طريقة واحدة لتحقيق تدفق مستمر من المياه على ضخ المياه من الخزان بواسطة مضخة ماء صغير يتم تسخينها إلى 28 درجة مع سخان ماء تحت الماء نموذجي.
- لتقليل الاهتزاز طائشة من الغرفة ، وينبغي أن وحدة تسجيل كامل الجلوس على قمة جدول التوازن الثقيلة.
الجزء 3 : محاذاة لوحة 96 - جيدا مع شبكة الكمبيوتر لتعقب الفيديو
البرمجيات
- مكان لوحة 96 - جيدا تحتوي على الأسماك في غرفة تسجيل.
- عند استخدام حمام الماء ، ومكان لوحة ببطء في الماء ، مما يعطي مستوى المياه فرصة للتكيف من دون إراقة على طبق. بدلا من ذلك ، بإغلاق تدفق المياه ، وإضافة لوحة ، ومن ثم استئناف التدفق. أيضا ، تأكد من استخدام الربيع أو الشريط المطاطي لعقد لوحة 96 - جيدا في مكانها.
- في وجهة النظر Videotrack البرمجيات ، والتحقق من أن جميع اليرقات من تجربتك مرئية على شاشة الكمبيوتر. باستخدام عناصر التحكم في البرمجيات ، ومحاذاة الشبكة من برامج فيديو لتتبع مع آبار صحنك ان كل هذه الاسماك هو داخل مربع من الشبكة. وسوف يكون جهاز الكمبيوتر تتبع حركة حساب منفصل لكل من هذه المربعات ، حتى إذا كنت ترفض تعديل شبكة الكمبيوتر قد تفقد بعض الحركات الأسماك. أو حتى أسوأ من ذلك : وسمكتين المتاخمة احتلال المنطقة نفسها ، وتحسب واحدة الأسماك. هذه الخطوة مهمة جدا لجميع التسجيلات الخاصة بك.
- بعد المحاذاة ، برنامج توقيت عندما الاضواء يجب ان تذهب وخارجها. نسمح عادة 3 ساعات من الضوء أو الظلام التكيف في المربع سواء للحصول على مستوى النشاط الأساسي ، ولكن أيضا لإعطاء فرصة ليرقات تهدأ بعد pipetting والتعامل معها. بعد الأساس ، ونحن مع بديل ثم 30 دقيقة من الأضواء على تليها 30 دقيقة من خارج الأضواء ، وكرر عدة مرات.
- المقبل ، وأغلق باب غرفة تسجيل وبدء التسجيل.
- في الممارسة العملية ، نسجل نشاط كل الأسماك في الثانية الواحدة ، ولكن برنامج وجهة نظر في واقع الأمر الإطار سجلات ببيانات الإطار (إشارة إلى فيلممظاهرة لجمع البيانات). وتحديد قيمة العتبة الدنيا للتغيير بكسل لكل إطار تعتمد إلى حد ما على الكاميرا الخاصة والإعداد الخفيفة. الإعداد لدينا ، ونحن عادة استخدام عتبة 4 بكسل ، وهذا هو ، إذا كان أقل من 4 بكسل آخذة في التغير ، فهو يعتبر الخلفية. إذا كان أكثر من 4 بكسل تتحرك ، فهذا دليل على السمك يتحرك. ونحن مصممون ان يكون تجريبيا بالكشف عن قطع ما يقرب من جميع تسبح اليرقات والحركات بدورها.
- على الرغم من أن صناديق تسجيل عزل اليرقات جيدا ، إيقاف الضوء في الغرفة ، والحرص على تقليل الانقطاعات مع الضوضاء الميكانيكية مثل إغلاق وفتح الأبواب في الغرفة ، وجود طرف والرقص ، أو القيام بممارسة إجراءات الخاص بك.
الجزء 4 : تحليل البيانات
- بعد اكتمال التجربة ، ونقل البيانات التي يتم جمعها في ورقة Excel أو في الجناح الخاص بك تحليل المفضلة.
- الورقة المرفقة التفوق هو مثال لما قد تبدو البيانات مثل : أنه يحتوي على الوقت في ثوان من بداية التجربة والنشاط في كل يرقة ثانية للأسماك جميع أنحاء التجربة كلها (انظر على سبيل المثال ملف البيانات التكميلية في ملفات المقطع من هذه الصفحة).
- ويظهر الشكل 1 مثالا للنشاط من يرقة واحدة. الرقم 2 هو تتبع ممثل من متوسط 40 يرقات الزرد WT. متوسط ON OFF والاستجابات بارزة ومتسقة.
الشكل 1 : نشاط سمكة واحدة ونشاط من السمك في وزن واحد في 5 DPF ردا على فترات متناوبة من 30 دقيقة من الضوء على والخروج. وأشارت الردود عليها السهام السوداء والاستجابات OFF مع السهام الحمراء.
الشكل 2 : نشاط متوسط من 40 سمكة نشاط متوسط وزن الأسماك 40 في 5 DPF ردا على فترات متناوبة من 30 دقيقة من الضوء على والخروج. متوسط ON (الأسهم السوداء) وOFF (السهام الحمراء) ردود بارزة ومتسقة.
5. ممثل النتائج
الرقم 3 هو مخطط التخطيطي للمخطط التجريبية المستخدمة في كل من تجاربنا. 
الشكل 3. يتم وضع التصميم التجريبي لاختبار المحركات البصرية (VMR) الاستجابة. سمكة) الفردية في لوحة 96 - جيدا في غرفة تسجيل. ويتم قياس نشاط كل الأسماك في الثانية الواحدة. ب) وتعطى الأسماك فترة التكيف مع الظلام أو الضوء لتسوية بينها والحصول على مستوى النشاط الأساسي. فترات من 30 دقيقة على أضواء والأضواء OFF يتم تقديمها على التوالي ليصبح المجموع 3 ساعات. وقد تم تكييف هذا المخطط من بروبير وآخرون ، 2006.
ماذا الرسوم البيانية للاستجابة البصرية والسيارات تبدو؟
قمنا بقياس ردود الفعل داخل وخارج الأسماك WT إلى الزيادات الخفيفة والتناقصات. لتأكيد أن هذه الردود كانت تعتمد على وظيفة العين ، وقمنا بقياس نشاط المسوخ CHK ، والتي لا تضع أي العينين. الشكل 4 يبين نشاط متوسط المتحصل عليها من الحيوانات WT فضلا عن المسوخ CHK. 
الشكل 4 : WT الأسماك واضحة وإيقاف الاستجابات التي يتم بوساطة العيون الجانبية يتم تسجيل السلوك الحركي لليرقات الزرد في 5 DPF استجابة لمدة 30 دقيقة على ضوء و 30 دقيقة من خارج الضوء في الثانية الواحدة. تتبع كل يمثل متوسطا قدره 480 من 120 WT الردود الفردية (الأزرق التتبع) أو متحولة CHK اليرقات (برتقالي التتبع) التي سجلت ما يزيد على 3 تجارب. والمسوخ CHK لا زيادة كبيرة في نشاطها إما بزيادة أو ضوء التناقصات وتتمتع بمستوى منخفض من النشاط الأساسي. وقد تم تكييف هذا الرقم من عمران وآخرون ، 2007.
والبصرية للسيارات ردود من الأسماك NRC متحولة.
كان يعتقد أن متحولة NRC أن تكون عمياء تماما استنادا إلى اختبار OKR. في متحولة NRC ، المحطات مبصرة لا شكل صحيح وخطر شديد على مسار والمرئية 1. وكشفت تسجيلات خلية الشبكية العقدة من هذه الأسماك الطافرة التي يعرضون في الغالب خارج الخلية من نوع الاستجابات العقدة ، وبعض الشاذ ON - OFF ، ولكن ليس من النوع النقي في الردود 2.
باستخدام اختبار VMR أظهرنا أن متحولة NRC لديه طبيعية خارج الاستجابة وتأخر وبطء الاستجابة ON (SEه الشكل 5). وهكذا ، متحولة NRC ليس أعمى تماما كما كان يعتقد سابقا 2. 
الشكل 5 : mutats NRC زيادة نشاطهم في استجابة للتغيرات في شدة ضوء الاستجابات السلوكية للضوء وإيقاف من وزن اليرقات والمصالحة الوطنية في 5 DPF متحولة. تتبع كل يمثل متوسطا قدره 480 ردود من 120 فرد من الأسماك في كل الوراثي. هو انخفاض طفيف في السلوك الحركي متوسط المسوخ NRC (آثار الوردي) بالمقارنة مع وزن الأسماك (آثار الزرقاء) ولكن لا تزال قوية في أعقاب ضوء OFF التحفيز. لاحظ الوقت ارتفاع بطيء في الاستجابة لمتحولة NRC الضوء على مقارنة الضوء على الاستجابة للأسماك WT.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الإجراءات التجريبية نظهر في الفيلم كلها ممثل الأسماك WT. ومع ذلك ، يمكن القيام بالقياس هذه التجارب على الأسماك متحولة كذلك (انظر القسم ممثل النتيجة). نقترح على الأسماك والأسماك WT وحة متحولة على اللوحة نفسها في مخطط متن المدقق لأغراض التحكم الأمثل.
عند استخدام الأسماك متحولة على لوحة نفس السمك WT تأكد من كتابة ما هو مطلي نوع من الأسماك في كل بئر. هنا اقتراح حول كيفية الحفاظ على المسار من الأسماك في كل بئر مطلي (عرض كتاب المذكرة مع ورقة البيانات).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة EY0081 المنح و5T32UY07145 وعين فرسان مؤسسة فرسان. جايسون Rihel زميل بريستول سكويب لمؤسسة أبحاث علوم الحياة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| أجهزة الأطباق الدقيقة | أداة | Whatman, GE Healthcare | 7701-1651 | |
| ماصّات النقل | أداة | VWR international | 202205 | |
| مياه الأسماك | كاشف | راجع المرجع رقم ٤ | ||
| غرف التسجيل (Zebrabox) | أداة | فيوبوينت لايف ساينسز (Viewpoint Lifesciences) | ||
| برمجيات Videotrack | أداة | فيوبوينت لايف ساينسز (Viewpoint Lifesciences) |
المراجع
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن