تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية

تبدأ هذه العملية بإزالة أي شوائب من محلول فيروس الإنفلونزا عن طريق الطرد المركزي. ثم يتم تمزيق الغشاء الفيروسي باستخدام المنظف، وتُفصل جزيئات vRNps المتحررة على تدرج الجلسرول.

يتم جمع أجزاء الطرد المركزي من التدرج، ثم يُجرى تحليل لعينة من كل جزء. وفي تحليل SDS page، يتم صبغ الهلام بصبغة كوماسي الزرقاء لتحديد الأجزاء التي تحتوي على أعلى تركيز من V nps. بعد ذلك، يتم تركيز الأجزاء التي تحتوي على V NPS عن طريق الطرد المركزي، ثم تُوضع VRPs المنقاة على شبكة عينة نحاسية لجهاز TEM، والتي تُصبغ لاحقاً بالصبغة السالبة لتصوير VRPs باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ. مرحباً، أنا WinCo Wu من مختبر الدكتورة Nellie Pane في قسم علم الحيوان بجامعة كولومبيا البريطانية.

أنا ليندسي ويفر، كنت سابقاً من مختبر بان. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنقية الإنفلونزا، وهي عبارة عن معقدات بروتينية نووية ريبوزومية فيروسية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الاستيراد النووي لفيروس influenza A في خلايا المزارع النسيجية.

لنبدأ الآن. لبدء التجربة، ضع 750 µL من محلول MNT buffer في أنبوب طرد مركزي من البوليكربونات من شركة Beckman بحجم 11 mm × 34 mm. بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول فيروس influenza A بتركيز 2 mg/mL إلى الأنبوب، ثم اسحب السائل وأطلقه بالماصة عدة مرات لخلط الفيروس مع محلول MNT buffer.

بعد الخلط، ضع الأنبوب في دوّار TLA one 20.2 وقم بالطرد المركزي في جهاز Beckman Optima max E لمدة 10 دقائق عند 109,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. وعند انتهاء عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي، ثم أعد تعليق الراسب في 500 µL من محلول منظم التفتيت (disruption buffer). قم برج الراسب المعاد تعليقه بقوة باستخدام جهاز vortex، ثم قم برجّه عند درجة حرارة 31 °C لمدة 20 دقيقة باستخدام جهاز einor thermo mixer.

عند الانتهاء من الرج، ابدأ في عملية طرد مركزي لسرعة الترسيب باستخدام تدرج الجلسرول. ولتحضير تدرج الجلسرول، ضع الكميات التالية من الجلسرول في أنبوب طرد مركزي من نوع Beckman UltraClear بمقاس 13 ملم × 51 ملم: 1 مل من GLYCEROL بتركيز 70% (حجم/حجم)، و0.75 مل من جلسرول بتركيز 50%، و0.375 مل من جلسرول بتركيز 40%، و1.8 مل من جلسرول بتركيز 33%. يتم تحضير محاليل الجلسرول هذه عن طريق خلط الجلسرول النقي مع منظم NM.

قم أيضاً بتحضير أنبوب موازنة يحتوي على كل من الغليسيرول والمحلول المنظم. بعد ذلك، قم برج عينة الفيروس الممزقة مرة أخرى باستخدام جهاز الفورتيكس ثم حمّلها على تدرج الغليسيرول. ضع الأنبوب في دوار Beckman MLS 50 ذو الدلاء المتأرجحة وقم بطرد التدرج مركزياً لمدة ثلاث ساعات و45 دقيقة بسرعة 217,000 ×g عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد اكتمال عملية الطرد المركزي، يتم جمع حصص قدرها 250 µL من المتدرج يدويًا بدءًا من أعلى الأنبوب. تُحفظ الكسور على الثلج أو في درجة حرارة 4 °C. وبمجرد جمع الكسور، نصبح مستعدين لتحليلها باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد SDS.

لبدء تحليل SDS page، انقل 20 µL من كل جزء إلى أنبوب جديد. ثم أضف 5 µL من منظم عينات SDS page بتركيز خمسة أضعاف، وسخن العينة عند 95 °C لمدة خمس دقائق. بعد التسخين، قم بتدوير العينات في جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة ثم قم بتحميلها على هلام Poly acrylamide بتركيز 10%، مع تضمين مؤشرات الوزن الجزيئي في إحدى الآبار. بعد ذلك، قم بتشغيل العينات عبر الهلام حتى يصل صبغ التحميل brom phenol blue إلى ما يقرب من أسفل الهلام.

أخرج الهلام من جهاز SDS page وقم بصبغه بصبغة kumasi blue. وبناءً على نتائج الصبغ، حدد الكسور التي تحتوي بشكل أساسي على البروتين النووي (nucleo protein) الخاص بإنفلونزا.

يبلغ حجم بروتين NP الخاص بإنفلونزا A حوالي 56 كيلودالتون، وهو البروتين الرئيسي الموجود في معقدات البروتين النووي الريبي الفيروسي. لذا، تكون حزمة NP عمومًا هي الحزمة الأقوى في الأجزاء التي تحتوي على VRN ps. وفي الجزء التالي، سنقوم بتركيز أجزاء VRNP هذه.

اجمع كسور الجلسرول التي تحتوي بشكل أساسي على NP، ووزعها على أنبوبي طرد مركزي من بولي كربونات من شركة Beckman وبقياس 11 مليمتر في 34 مليمتر، ثم املأ كل أنبوب بماء فائق النقاء معالج بـ ethyl pyro carbonate أو DEPC. بعد ذلك، استخدم الماصة للسحب والدفع عدة مرات للمزج. ضع الأنابيب في دوّارة Beckman TLA one 20.2 وقم بإجراء الطرد المركزي لمدة أربع ساعات ونصف عند 157,000 ×g في درجة حرارة 4 °C.

عند اكتمال عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب. في حصص مقدارها 50 µL من الماء المعالج بـ DEPC، يتم توزيع جسيمات V NPS المنقاة؛ خصص حصة واحدة جانباً واحفظ الحصص الأخرى في درجة حرارة -80 °C. الآن أصبحنا مستعدين للمضي قدماً في عملية الصبغ السلبي لـ VRPs.

خفف ميكرولتر واحد من VRNP المُنقاة في تسعة ميكرولتر من منظم PBS المُحضّر حديثاً والمُرشح مرتين، ثم قم بتفريغ توهجي لشبكة عينات TEM نحاسية لمدة 30 ثانية. كانت هذه الشبكة مغلفة مسبقاً بطبقة من Parlow Dion وغشاء كربوني. باستخدام ملقط للإمساك بشبكة العينة التي خضعت للتفريغ التوهجي حديثاً، ضع قطرة بحجم خمسة ميكرولتر من VRNP المخففة على شبكة العينة.

اترك القطرة لتُمتص على الشبكة لمدة ثماني دقائق أثناء الانتظار. ضع شريطاً صغيراً من ورق الترشيح (parfum) في صينية، ثم وزع على الورقة قطرتين تحتوي كل منهما على 10 µL من محلول PBS المنظم، بالإضافة إلى قطرة بحجم 80 µL من محلول التلوين المُحضّر حديثاً، والمكون من 1% ammonium melidate. الآن، اغسل شبكة العينة عن طريق خفضها بعناية في قطرتي PBS لمدة دقيقة واحدة إجمالاً.

بعد ذلك، استخدم قطعة من ورق الترشيح لسحب جزء من محلول العينة من شبكة العينة دون السماح بجفاف الشبكة. وفور سحب آخر قطرة من المحلول المنظم من شبكة العينة، اغمر الشبكة بالكامل داخل قطرة الصبغة، ثم انتظر لمدة دقيقة واحدة.

بعد مرور دقيقة واحدة، استخدم قطعة جديدة من ورق الترشيح لسحب محلول الصبغة تماماً من شبكة العينة. اترك شبكة العينة لتجف في الهواء لعدة دقائق قبل الفحص. يظهر هنا، تحت مجهر إلكتروني نافذ، صور تمثيلية بالمجهر الإلكتروني النافذ لجسيمات V nps المصبوغة سلبياً.

كما يظهر هنا، تشبه جسيمات V NPS الجسيمات العصوية ذات الأطوال المتغيرة التي يتراوح طولها تقريبًا بين 30 nanometers إلى 120 nanometers. تنتظم الجسيمات النانوية الأوليغومرية في شكل سلسلة من جزيئات NP التي تنطوي بدورها لتشكل بنية تكرارية لولبية مزدوجة. لذا، يمكن رؤية حلقات على كلا طرفي هذه الجسيمات عصوية الشكل في بعض الأحيان.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تنقية وتصوير البروتينات النووية الريبوزية الفيروسية للإنفلونزا. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم عدم استخدام PBS عند تخفيف البروتينات النووية الريبوزية الفيروسية إذا كنت تستخدم خلات اليورانيا للصبغ السلبي.

هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.