تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية

يبدأ هذا الإجراء بإزالة أي حطام من الأنفلونزا. محلول فيروسي بالطرد المركزي. ثم يتعطل الغشاء الفيروسي مع المنظف ويتم فصل الإطلاق إلى VR nps على تدرج الجلسرين.

يتم جمع كسور الطرد المركزي من التدرج ويتم تشغيل حصة من كل كسر. في صفحة SDS ، يتم بعد ذلك تركيز المواد الهلامية الملطخة باللون الأزرق kumasi لتحديد كسور الذروة التي تحتوي على كسور V nps التي تحتوي على V NPS عن طريق الطرد المركزي ويتم تطبيق VRPs المنقاة على شبكة عينات TEM نحاسية ، والتي يتم تلطيخها بعد ذلك سلبا لتصور VRPs بواسطة المجهر الإلكتروني للإرسال. مرحبا ، أنا WinCo Wu في مختبر الدكتورة Nellie Pane في قسم علم بجامعة كولومبيا البريطانية.

أنا ليندسي ويفر ، سابقا من مختبر بان. سنعرض لك اليوم إجراء لتنقية الأنفلونزا ، وهي مجمعات بروتين نوى الضلع الفيروسية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الاستيراد النووي للأنفلونزا ، فيروس A في خلايا زراعة الأنسجة.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء التجربة عند 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت MNT في أنبوب طرد مركزي من البولي كربونات بيكمان مقاس 11 ملم × 34 ملليمتر. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول اثنين من ملليغرام لكل مليلتر من الأنفلونزا ، وهو فيروس في ماصة الأنبوب لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط الفيروس مع المخزن المؤقت MNT.

بعد الخلط ، ضع الأنبوب في دوار A TLA واحد 20.2 وجهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي Beckman Optima max E لمدة 10 دقائق عند 109،000 مرة G عند أربع درجات مئوية. عند الانتهاء من الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية ، ثم إعادة التشكيل ، وتعليق الحبيبات في دوامة عازلة تعطيل 500 ميكرولتر. الحبيبات المعلقة بقوة ثم رجها على حرارة 31 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في خلاط حراري إينور.

عند الانتهاء من الاهتزاز ، تابع الطرد المركزي لسرعة الرواسب المتدرجة للجلسرين. لتحضير تدرج الجلسرين ، ضع ما يلي من الجلسرين في أنبوب الطرد المركزي Beckman UltraClear 13 ملم × 51 ملم ، ومليلتر واحد 70٪ الحجم من حيث الحجم GLYCEROL 0.75 ملليلتر 50٪ جلسرين 0.375 مليلتر ، 40٪ جلسرين ، و 1.8 مليلتر ، 33٪ جلسرين. يتم تصنيع محاليل الجلسرين هذه عن طريق خلط الجلسرين النقي مع المخزن المؤقت NM.

قم أيضا بإعداد أنبوب توازن يحتوي على كل من الجلسرين والمخزن المؤقت. ثم قم بدوامة العينة الفيروسية المعطلة مرة أخرى وقم بتحميلها على تدرج الجلسرين. ضع الأنبوب في دوار دلو متأرجح Beckman MLS 50 وقم بالطرد المركزي للتدرج لمدة ثلاث ساعات و 45 دقيقة عند 217،000 مرة G عند أربع درجات مئوية.

بعد اكتمال الطرد المركزي ، اجمع يدويا 250 ميكرولتر من التدرج بدءا من أعلى الأنبوب. احتفظ بالكسور على الجليد أو عند أربع درجات مئوية. بمجرد جمع الكسور ، نكون مستعدين لتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS.

لبدء تحليل صفحة SDS ، قم بإزالة 20 ميكرولترا من كل جزء إلى أنبوب جديد. ثم أضف خمسة ميكرولترات من خمس مرات المخزن المؤقت لعينة صفحة SDS ، وقم بتسخين العينة إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق بعد التسخين ، قم بتدوير العينات لفترة وجيزة وتحميلها على هلام بولي أكريلاميد 10٪ بما في ذلك علامات الوزن الجزيئي في أحد الآبار. بعد ذلك ، قم بتشغيل العينات من خلال الجل حتى تصل صبغة تحميل البروم فينول الزرقاء بالقرب من قاع الجل.

قم بإزالة الجل من جهاز صفحة SDS وصمة عار الجل باللون الأزرق كوماسي. بناء على نتائج التلوين ، حدد الكسور التي تحتوي بشكل أساسي على الأنفلونزا. بروتين النواة.

يبلغ حجم الأنفلونزا A NP حوالي 56 كيلودلتون وهي البروتين الرئيسي الموجود في مجمعات البروتين النووي الريبي الفيروسي. لذا فإن نطاق NP بشكل عام هو أقوى نطاق في الكسور التي تحتوي على VRN ps. في الجزء التالي، سنركز كسور VRNP هذه.

اجمع بين أجزاء الجلسرين التي تحتوي بشكل أساسي على NP ، وقم بتوزيعها على أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي من البولي كربونات مقاس 11 ملم × 34 ملم ، واملأ كل أنبوب بكربونات إيثيل بيرو أو مياه فائقة النقاء المعالجة ب DEPC. ثم الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي 20.2 من Beckman TLA لمدة أربع ساعات ونصف عند 157،000 مرة G عند أربع درجات مئوية.

عند اكتمال الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات. في 50 ميكرولترا من المياه المعالجة DEPC ، تضع صافي القدرة على الطاقة المتنقية جانبا واحدة وتخزن الأخرى عند سالب 80 درجة مئوية. نحن الآن على استعداد للمضي قدما في التلوين السلبي ل VRPs.

قم بتخفيف ميكرولتر واحد من VRNP المنقى إلى تسعة ميكرولترات من توهج PBS العازل الطازج والمفلتر مرتين لتفريغ شبكة عينات TEM النحاسية لمدة 30 ثانية. كانت هذه الشبكة مطلية سابقا بفيلم Parlow Dion وفيلم كربوني. باستخدام ملاقط لتثبيت شبكة عينات تفريغ التوهج الطازج ، ضع قطرة من خمسة ميكرولتر من VRNP المخفف على شبكة

اترك القطرة تمتص على الشبكة لمدة ثماني دقائق أثناء الانتظار. ضع شريطا صغيرا من العطر في صينية ، ثم استغني عن قطرتين على العطر تحتوي على 10 ميكرولتر لكل من PBS buffer ، بالإضافة إلى قطرة 80 ميكرولتر من محلول التلوين الطازج ، والذي يتكون من 1٪ تمر الأمونيوم ميلي. الآن اغسل شبكة العينات عن طريق خفضها بعناية إلى قطرتين من PBS لمدة دقيقة واحدة.

ثم استخدم قطعة من ورق الترشيح لإزالة جزء من محلول العينة من شبكة العينة دون ترك شبكة العينة تجف. مباشرة بعد التخلص من آخر قطرة من المخزن المؤقت من شبكة العينة ، غمرت شبكة العينة بالكامل داخل قطرة البقع. وانتظر دقيقة واحدة.

بعد دقيقة واحدة ، استخدم قطعة جديدة من ورق الترشيح لإزالة محلول البقع تماما من شبكة العينات. اترك شبكة العينات تجف في الهواء لعدة دقائق قبل المراقبة. تحت المجهر الإلكتروني للإرسال ، توجد هنا صور مجهرية إلكترونية تمثيلية ل V nps ملطخة سلبا.

كما ترون هنا ، تشبه القدرة النووية الخامسة الجسيمات على شكل قضيب ذات طول متغير يبلغ طولها حوالي 30 نانومتر إلى 120 نانومتر. يتم تنظيم NP قليل القلة كسلسلة من جزيئات NP التي يتم طيها بشكل أكبر في هيكل تكرار حلزوني مزدوج. لذلك يمكن أحيانا رؤية الحلقات الموجودة على طرفي هذه الجسيمات على شكل قضيب.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تنقية الأنفلونزا وتصورها. مجمعات البروتين النووي الضلع الفيروسي عند القيام بهذا الإجراء. من المهم عدم استخدام PBS عند تخفيف VR mps إذا كنت تستخدم أسيتات المبولة للتلوين السلبي.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.