Name: قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: تعلم قياس ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية باستخدام تقنيات المجهر الضوئي المتقدمة. يوضح هذا الإجراء تحضير مزارع مشتركة للخلايا النجمية والعصبونات وملاحظة إشارات الكالسيوم العالمية والقريبة من الغشاء.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة ميموريال أوهارا اليابان (لES) وكذلك مؤسسة وايتهول ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية وجائزة الهبات شتاين - أوبنهايمر (لBSK).

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li>
<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIA%3A+listening+and+talking+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

هو راسخ بأن النجمية عرض ترتفع الكالسيوم داخل الخلايا. ويمكن أن تظهر هذه تحدث بشكل عفوي ، من خلال نشاط الخلايا العصبية أو عن طريق تطبيق منبهات لتنشيط المستقبلات على سطح خلية نجمية 11. مسألة واحدة مهمة ومثيرة للجدل هو ما إذا كانت الخلايا نجمية ترتفع الكالسيوم يمكن أن تؤدي إلى الإفراج عن الجزيئات مما يشير إلى أن تفعيل المستقبلات على الخلايا العصبية في 11 و 12. هذا أمر مثير للجدل بسبب وجود أدلة ضد وجهة النظر هذه ، على النحو المبين في الاستعراضات التي Haydon 7 و 13</su...

<table><tbody><tr><td>أغطية شرائح مجهرية دائرية VWR&amp;#174;، رقم 1</td><td>أداة</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>هيدروبروميد بولي-دي-لايسين</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>لامينين من الغشاء القاعدي لورم ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي متوازن من تركيبة Earle&amp;rsquo; (EBSS) (1X)، سائل</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>وسط أساسي أدنى (MEM) (1X)، سائل، يحتوي على أملاح Earle&amp;rsquo;، ولكن بدون L-glutamine أو أحمر الفينول</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>محلول بنسلين-ستريبتومايسين سائل</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>محلول بيروفات الصوديوم</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>محلول HEPES بتركيز 1 M</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>مكمل N-2 (100X)، سائل</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>مصل حصان، مثبط حرارياً</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>كاشف</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>وسط Neurobasal&amp;#8482; (1X)، سائل بدون أحمر الفينول</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>مكمل B-27 خالي من المصل (50X)، سائل</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X)، سائل</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>مرشحات الخلايا</td><td>أداة</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>أطباق BD Falcon متعددة الآبار ذات قاع مسطح مع أغطية، معقمة</td><td>أداة</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; سداسي الهيدرات</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; سداسي الهيدرات</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES حمض حر</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>محلول Fluo-4, AM بتركيز 1 mM في DMSO</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>محلول Pluronic&amp;#174; F-127 بتركيز 20% في DMSO</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>زيت غمر TYPE DF</td><td>مجهر</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>غرفة مفتوحة لأغطية شرائح دائرية بمقاس 25 mm، بحجم 100 &amp;mu;l</td><td>أداة</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>منصة P-2 لغرف Series 20، بدون سخان</td><td>أداة</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>كريات مجهرية FluoSpheres معدلة بالكربوكسيلات، 0.1 &amp;mu;m، ذات فلورة صفراء-خضراء (505/515)، مواد صلبة بنسبة 2%</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

يحتوي على خلايا الدماغ الدبقية. منذ فترة طويلة النجمية ، وهو نوع من الخلايا الدبقية ، والمعروفة لتوفير دور سلبي داعمة لخلايا عصبية. ومع ذلك ، أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا النجمية ويمكن أيضا المشاركة بنشاط في وظائف المخ من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الوظيفية. ومع ذلك ، العديد من الجوانب الأساسية لعلم الأحياء نجمية تظل مثيرة للجدل ، غير واضحة و / أو غير مستكشفة تجريبيا. مسألة واحدة مهمة هي ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا العابرين في الخلايا النجمية. هذا هو ذات الصلة لأن راسخة الكالسيوم ورسوله في المركز الثاني والمهم أنه تم اقترح أن ترتفع نجمية الكالسيوم يمكن أن تؤدي إلى الإفراج عن الإرسال من الخلايا النجمية. ومع ذلك ، لم يكن هناك أي وصف تفصيلي أو مرضية من الكالسيوم غشاء البلازما بالقرب من الإشارات في الخلايا النجمية. مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهر هو أداة قوية لتحليل الأحداث ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية يشير ضمن حوالي 100 نانومتر للغشاء البلازما للخلايا الحية. هنا ، فإننا نستخدم TIRF المجهري ويصف كيفية مراقبة بالقرب من غشاء البلازما والعالمية ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد تقريبا. لمزيد من الصقل والتطبيق المنهجي لهذا النهج لديه القدرة على إبلاغ عن التفاصيل الدقيقة للإشارات الكالسيوم نجمية. قد يكون فهم مفصل لديناميات نجمية الكالسيوم توفر أساسا لفهم إذا ، كيف ومتى ولماذا النجمية والخلايا العصبية التي تعتمد على الكالسيوم الخضوع تفاعلات وظيفية.

نحن تصف كيفية قياس بالقرب من الغشاء والعالمية ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية في تربيتها باستخدام الانعكاس الداخلي الكامل وepifluorescence المجهري.

يحتوي الدماغ على خلايا دبقية. وقد عُرف منذ فترة طويلة أن الخلايا النجمية، وهي نوع من الخلايا الدبقية، تضطلع بدور داعم سلبي للعصبونات. ومع ذلك، ...

في الجزء الأول من هذا الفيديو، سنوضح كيفية تحضير المزرعة المشتركة للخلايا النجمية والعصبونات. وللقيام بذلك، يتم جمع عدة حصينات من جرذان بعمر P1 في أنبوب، ثم تُهضم باستخدام البروتينيز، وتُفكك عن طريق التحريك، ومن ثم تُزرع على شرائح غطاء. وسيوضح القسم الثاني كيفية قياس ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية، وهو ما يتضمن تحميل صبغة مؤشر الكالسيوم flu oh four في الخلايا النجمية، وقياس ديناميكيات الكالسيوم العامة بواسطة المجهر العاكس (epi microscopy)، وقياس ديناميكيات الكالسيوم القريبة من الغشاء بواسطة مجهر TIRF.من خلال تغيير الإضاءة تلقائياً وبسرعة، يمكن ملاحظة كل من الكالسيوم العام والكالسيوم القريب من الغشاء بشكل متزامن تقريباً. مرحباً، أنا Aji omi، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر Budget COS في قسم الفسيولوجيا بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير الكالسيوم في الخلايا النجمية.نستخدم هذا الإجراء في دراستنا المخبرية لدراسة ديناميكيات الكالسيوم بالقرب من الغشاء والديناميكيات الشاملة في الخلايا النجمية. ومن خلال تغيير الإزالة تلقائياً وبسرعة، يمكننا التمييز بين الكالسيوم الشامل والكالسيوم القريب من الغشاء. وفي الوقت ذاته تقريباً، سأوضح كيفية تطبيق TP للتسبب في رفع مستويات الكالسيوم في الخلايا النجمية.سأقوم بعد ذلك بالختام من خلال تلخيص ومناقشة الحاجز مع الطريقة المستخدمة لدراسة الخلايا النجمية. لذا، دعونا نبدأ الدراسة. لبدء زراعة الخلايا النجمية، قم بإزالة الجلد والجمجمة من رأس جرو جرذ مقطوع الرأس.ضعي الدماغ في طبق بتري مملوء بوسط تشريح بارد، ثم قومي بتشريح كلا الشطرين وإزالة السحايا. بعد ذلك، قومي بتشريح الحصين. قطعي الحصين إلى قطع يبلغ حجمها تقريباً 1 × 1 مليمتر.يتم الهضم في محلول Pappa عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 11 إلى 13 دقيقة. أخرج الأنسجة التي تم تشريحها من الحاضنة. بعد أن تترسب قطع الأنسجة، قم بإزالتها بعناية من محلول هضم البروبان وأضف خمسة ملليلتر من وسط الحصين لغسل قطع الحصين المقطعة.كرر هذه الخطوة، وفي النهاية، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط حصين (hippocampal medium). قم بتفتيت الخلايا حوالي خمس مرات باستخدام ثلاث ماصات مصقولة باللهب ومتدرجة الصغر. بعد ذلك، مرر الخلايا عبر مصفاة خلايا ذات حجم فتحات يبلغ 70 micrometers وأضف أربعة milliliters من الوسط إلى المصفاة.قم بعدّ الخلايا في 10 µL من المعلق. اضبط حجم الوسط الحصيني (hippocampal medium) بحيث يكون هناك 400,000 خلية لكل mL. الآن، قم بتجهيز شرائح التغطية لزراعة معلق الخلايا عن طريق سحب مادة اللامينات (laminate) من شرائح التغطية التي نُقعت في محلول اللامينات طوال الليل.قبل أن تجف الأغطية، ضع 200 µL من معلق الخلايا لكل غطاء ساتر. اتركها لتلتصق لمدة 60 دقيقة في الحاضنة. وبعد الحضانة، أضف 2 mL من الوسط الحصيني (hippocampal medium) لكل بئر.في اليوم التالي، قم بشفط وسط الحصين القديم لإزالة الخلايا الميتة والحطام، وأضف 2 mL من وسط الحصين الطازج والمدفأ مسبقاً. يجب أن تبدأ صيانة المزارع المشتركة من الخلايا النجمية والعصبونات بعد أربعة أيام من الزراعة، وذلك بإضافة 1 mL من وسط neurobasal الطازج مرتين في الأسبوع. تأكد من تحضين الأوساط لمدة 30 دقيقة تقريباً في الحاضنة داخل دورق مهوى لموازنة درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون.قبل دراسة الخلايا النجمية، من المفيد فحص الخرزات الفلورية النانوية لتحسين زاوية الليزر في مجهر turf. وللقيام بذلك، ضع 200 microliters من الماء في طبق بتري وأضف 1 microliter من الخرزات الفلورية بحجم 100 nanometer واخلطها، ثم افحص الخرزات باستخدام مجهر الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence microscopy). بعد ذلك، افحص الخرزات باستخدام مجهر turf.لإجراء تصوير الكالسيوم، ضع المزرعة في بئر ضمن لوحة ذات ستة آبار مملوءة بـ 2 mL من محلول تسجيل الحصين المنظم الذي يحتوي على 2.5 µM من Fluo-4 AM و 0.05% من Pluronic F-127 (محلول 20% في DMSO)، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة، مع مراعاة تغطية اللوحة لتجنب بهتان صبغة Fluo-4. بعد ذلك، قم بإزالة محلول Fluo-4 واغسل شرائح التغطية ثلاث مرات باستخدام محلول تسجيل الحصين المنظم. حضن شرائح التغطية المغسولة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.ضع غطاء الشريحة في الحجرة، ونظف الجانب الآخر من غطاء الشريحة بسائل تنظيف العدسات، ثم أضف 200 µL من محلول hippocampal buffer. ضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على العدسة الشيئية، ثم ضع الحجرة على منصة المجهر. افحص الخلايا باستخدام الضوء النافذ لضبط التركيز ومعاينة مظهر الخلايا.بعد ذلك، قم بإضاءة الخلايا بطول موجي 488 nanometers باستخدام مصدر ضوء أحادي اللون، وحدد ما إذا كانت الإشارة الفلورية لـ flu oh four موحدة وقابلة للكشف. وفي الخلايا النجمية، استخدم إضاءة epi و turf لقياس الكالسيوم في الخلايا النجمية. وهنا، يتم رصد الخرزات الفلورية بواسطة إضاءة epi.بالإضافة إلى إنتاج فلورة خلفية، فإنها تظهر أيضاً حركة براونية ملحوظة مع تغير زاوية الإضاءة. وعندما يقترب الليزر من الزاوية الحرجة، ينعكس شعاع الليزر كلياً من الواجهة الفاصلة بين الزجاج والماء. يولّد هذا الانعكاس الداخلي الكلي مجالاً كهرومغناطيسياً يسمى المجال المتلاشي.يبلغ عمق هذا الجزء داخل الخلية ذات معامل الانكسار المنخفض حوالي 100 nanometers. يمكنك استثارة الفلوروفورات في هذه الطبقة الرقيقة على سطح العينة. تظهر هنا حبيبات فلورية تمت ملاحظتها بواسطة الإضاءة السفلية مقارنة بالإضاءة فوق الهدف.تزداد نسبة إشارة الإضاءة إلى الضجيج بشكل ملحوظ عند تقليل الزاوية. لا ينعكس شعاع الليزر عند السطح، بل ينفذ عبر الغطاء الزجاجي ليصيب الخرزات الفلورية مباشرةً، مما يجعل من الممكن رؤية قدر كبير من الفلورة الخلفية.الآن نقوم بزيادة الزاوية. ومرة أخرى، تنخفض ضوضاء الخلفية بشكل ملحوظ ويمكنك رؤية الخرزات الفلورية بالقرب من سطح الغطاء الزجاجي. تُظهر هذه الصور الخلايا النجمية والعصبونات المحملة بـ flu oh four.تعد الخلايا النجمية خلايا مسطحة ذات استطالات دقيقة، بينما تمتلك الخلايا العصبية أجساماً خلوية مستديرة وتغصنات سميكة وطويلة. تبدو كل من الخلايا النجمية والعصبية صحية ومحملة بـ flu. أو أربعة بشكل صحيح.يُعد فحص الخلايا النجمية باستخدام المجهر الضوئي أو المجهر confocal مفيداً لمعرفة ما إذا كانت الخلايا النجمية سليمة وما إذا كانت مؤشرات الكالسيوم قد حُمّلت في الخلية النجمية بشكل صحيح. في مناطق الخلية النجمية الأكثر قرباً من غطاء الزجاج، وهي المناطق التي تسمى "بصمة الخلية" (footprint)، يُلاحظ أن تطبيق TP يؤدي إلى زيادة الكالسيوم بالقرب من الغشاء البلازمي. ومن المعروف أن الخلايا النجمية في الحصين تعبر عن مستقبلات anergic نقية، وعند تطبيق TP في الحمام المائي، يمكن أن يؤدي ذلك إلى تحرر عالمي للكالسيوم.لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير مستنبت الخلايا العظمية في الحصين وكيفية قياس مستوى الكالسيوم في الخلايا العظمية بشكل عام وبالقرب من الغشاء البلازمي. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر تحسين زاوية الليزر؛ وأفضل طريقة لضمان ذلك على المجهر هي مراقبة سلوك سرعات التدفق التي تبلغ 100 millimeter. إن التسجيل المتزامن لمستوى الكالسيوم العام ومستوى الكالسيوم القريب من الغشاء سيوفر لنا ليس فقط وصفاً تفصيلياً لإشارة الكالسيوم، بل رؤية جديدة لآلية تنظيم الكالسيوم في الخلايا النجمية.لقد تبيّن لنا أيضاً أن النهج الموصوف هنا مفيد لقياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا، سواء بالقرب من الغشاء أو على المستوى العام، في مجالات أخرى من الخلايا المثيرة غير المعروفة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

measuring-near-plasma-membrane-global-intracellular-calcium-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

إعداد شرائح الدماغ الحادة من الحصين معزولة، فضلا عن التسجيلات في وقت واحد من الخلايا النجمية الكهربية والخلايا العصبية...

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

المصدر: Bannai، H.، et. al.، تشريح إشارات Ca2+ المحلية في الخلايا المستزرعة بواسطة مؤشرات Ca2+ المستهدفة بالغشاء. J. Vis. Exp. (2019)يوضح الفيديو التصوير الفلوري لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم العفوية الخاصة بالمقصورة في الخلايا النجمية من خلال المراقبة المتتابعة للبروتينات الحساسة للكالسيوم الموضعية على غشاء البلازما والشبكة الإندوبلازمية.

تصوير الكالسيوم التلقائي للديناميكيات الخاصة بالمقصورة في الخلايا النجمية

نحن هنا وصف للتكيف من البروتوكولات المستخدمة للحث على اللدونة التماثل الساكن في الخلايا العصبية لدراسة اللدونة من G مستقبلات البروتين يقترن نجمي. استخدمت مؤخرا لدراسة التغيرات في مجموعة نجمي أنا mGluRs في الفئران الأحداث، وطريقة يمكن تطبيقها لقياس التحجيم من مختلف GPCRs نجمي، في الأنسجة من الفئران الكبار في الموقع والحية، واكتساب فهم أفضل لحساسية مستقبلات نجمي للتغيرات في نشاط الخلايا العصبية.

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

لا تزال خصائص ووظائف إشارات الخلايا النجمية Ca2+ داخل الخلايا في المخطط غير مستكشفة بشكل كامل. نصف طرق التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا في الخلايا النجمية المخططة باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدة من النمط المصلي 2/5 (AAV2 / 5) ، بالإضافة إلى إجراءات لتصوير إشارات Ca2+ بشكل موثوق داخل الخلايا النجمية المخططة في الموقع.

التصوير الكالسيوم داخل الخلايا 2+ إشارات في الجسم المخطط النجمية من الفئران الكبار باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا

بروتوكول أوسام الموصوفة هنا الأمثل لاستزراع astrocytes مورين بمعزل عن غيرها من خلايا المخ بطريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة. أستروسيتيس أوسام معرض عفوية Ca2 + إشارات ومورفولوجيا والجينات التعبير ملامح مشابهة ل astrocytes في فيفو.

استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة

تظاهر هنا بروتوكولات لعزل (1) طازجة غشائي الدماغية سليمة "أنابيب" والقياسات (2) المتزامنة من الكالسيوم بطانية وغشاء المحتملة خلال المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب. علاوة على ذلك، تسمح هذه الأساليب لضبط الدوائي الكالسيوم غشائي الخلايا والإشارات الكهربائية كمتغيرات تجريبية فردية أو التفاعلية.

قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة

وهنا يقدم بروتوكول ل Ca2 + التصوير في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، الذي يتيح لتشريح Ca2 + إشارات في القرار سوبسيلولار. هذه العملية لا تنطبق على جميع أنواع الخلايا التي تسمح للتعبير عن وراثيا المرمزة Ca2 + المؤشرات.

تشريح المحلية Ca2 + الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca2 +

هنا نقوم بوصف طريقة التصوير الحي في المختبر لتصور النقل داخل الخلايا من العضيات والاتجار ببروتينات غشاء البلازما في الخلايا النجمية المورين. ويقدم هذا البروتوكول أيضا منهجية لتحليل الصور لتحديد مسارات نقل البضائع وحركيتها.

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

يهدف هذا proctocol إلى توفير طريقة للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.

تصوير الميتوكوندريا Ca2 + امتصاص في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام ترميز وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs)

تصف الطرق الحالية نهجا غير متناسب لتصوير الكالسيوم عالي الدقة وشبه المجزأ في الجسم الحي في Caenorhabditis elegans باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المتاحة بسهولة.

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

يوفر هذا البروتوكول وصفا شاملا لطريقة لتسجيل إشارات الكالسيوم المتزامنة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية عبر مناطق دماغية متعددة مرتبطة بالذاكرة ويظهر تطبيقه خلال نموذج سلوك التعلم والذاكرة.

طريقة القياس الضوئي الليفية ثنائية اللون لتسجيل نشاط الخلايا العصبية النجمية عبر مناطق دماغية متعددة أثناء التعلم وسلوكيات الذاكرة

تعلم قياس ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية باستخدام تقنيات المجهر الضوئي المتقدمة. يوضح هذا الإجراء تحضير مزارع مشتركة للخلايا النجمية والعصبونات وملاحظة إشارات الكالسيوم العالمية والقريبة من الغشاء.

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

استكشف المزيد من الفيديوهات