Name: عزلة Protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana Arabidopsis /em (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: تعلم عزل البروتوبلاستات السليمة من شتلات Arabidopsis thaliana عمرها 14 يوماً باستخدام الهضم الإنزيمي والتدرج الكثيف. تبقى الخلايا حية لمدة 96 ساعة على الأقل للدراسات الخلوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل محطة جامعة كورنيل التجربة الزراعية (CUAES) NYC - 125433 هاتش غرانت وكورنيل بدء المنحة لOKV

الجزء 1. إعداد المتوسطة صلبة لنمو النباتات. نحن عادة ما تتركز على النباتات الثقافة المتوسطة (MS) وسكوغ Murasige تستكمل مع السكروز 1 ٪ و 0.7 ٪ أجار. فهو يحتوي على كل العناصر الضرورية للحفاظ على النباتات السليمة. لإعداد MS 1L من وسائل الاعلام الرقم الهيدروجيني 5.7 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2،15 غرام من مسحوق MS في 800 مليلتر من الماء في زجاجة 1.5 2.0L autoclavable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريط التحريك في زجاجة ومسحوق يذوب MS خلال إثارة المتوسطة على طبق من التحريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التحريك ، إضافة ، قطرة قطرة ، 1N KOH لضبط درجة الحموضة من المتوسط ​​إلى 5.7 MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 غرام من السكروز ، والحفاظ على التحريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 7 غرام من آغار *. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الحجم النهائي للمتوسط ​​على استعداد ل1000 مل وتعقيم التعقيم بواسطة.* </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تعقيمها المتوسطة على طبق من التحريك وتبريده مع التحريك ، بحيث آغار ولن يعجل في الجزء السفلي من القمقم. يبرد المتوسط ​​إلى 60 درجة مئوية. ~ * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 100 ملم لوحات بتري. لوحات في الحفاظ على 4 درجات مئوية. </li></ol> * نصيحة 1 : لا تحاول حل آغار. فإنه solubilize خلال التعقيم. * نصيحة 2 : حافظ على شريط التحريك في زجاجة خلال التعقيم ، ستحتاج في وقت لاحق. * نصيحة 3 : إذا كنت يمكن أن تبقي يديك على الزجاجة تعقيمها لمدة 10 ثانية ، فهذا يعني أن متوسط ​​هدأت بما فيه الكفاية ، ويمكنك البدء في صب لوحات. الجزء 2. المواد النباتية وشروط النمو. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم البذور من thaliana Arabidopsis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 100 ملغ من البذور في أنابيب microcentrifuge إيبندورف وإضافة 1 مل من الايثانول 70 ٪. مزيج جيد واحتضان لمدة 2 دقيقة. تدور بذور أسفل ، ونضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من محلول التبييض التي تحتوي على 1.8 ٪ * 0.1 ٪ توين - 20. المزيج لمدة 10 دقيقة. تدور باستمرار البذور ونضح محلول التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه الخطوة لابد من القيام به في تدفق الصفحي هود. إضافة 1 مل من الماء المعقم على البذور وتخلط جيدا. تدور باستمرار البذور ، ونضح الماء. كرر هذه الخطوة 5 مرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتشار البذور على استعداد للفي الخطوة 1 لوحات (100 بذور / لوحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات للحفاظ على المصنف 24-48 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة الطبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو النباتات لمدة 14 يوما في غرفة النمو مع 8 ح ح light/16 الإضاءة الداكنة (على كثافة تدفق الفوتون الضوئي من 250 μmol ق م -2 -1) في 23 / ​​19 ° C درجة حرارة النظام الضوء / الظلام والنسبية 75 ٪ الرطوبة. </li></ol> * نصيحة 1 : يتم متابعة حل عن طريق تخفيف بليتش a كلوروكس المنزلية ، والتي تحتوي على 6 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم واضاف توين - 20 إلى تركيز النهائي من 0.1 ٪. الجزء 3. عزلة protoplasts من الشتلات Arabidopsis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 غرام من شريحة لمدة 14 يوما من العمر الشتلات بشفرة حلاقة جديدة في 15 مل من محلول تعقيم فلتر TVL. نحن ختم المواد النباتية في أطباق بتري معقمة المتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة المقطعة في الدورق 200 مل ، أضف 20 مل من محلول أنزيم فلتر تعقيم ، دوامة الدورق السماح الأنسجة الاختلاط مع محلول أنزيم ، مع تغطية parafilm ورقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اهتزاز الأنسجة النباتية في 35 دورة في الدقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ل16-18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع protoplasts صدر في 50 مل أنبوب فالكون بواسطة النخل من خلال 8 طبقات من القماش والجبن ، وقبل الرطب في W5 الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> protoplasts غربال من مرة واحدة أكثر الجبن القماش بواسطة غسل القماش مع 15 مل من محلول W5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية protoplasts تراكب مع 10 مل من محلول W5 ، لا تعكر صفو التدرج السكر ، لمدة 7 دقائق بنسبة 100 غرام الطرد المركزي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10 مل من protoplasts في واجهة من محلول أنزيم W5 والحل (الشكل 1B) ونقل إلى 50 عضوا جديدا أنبوب فالكون مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل W5 الحلول الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 60 ز إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل protoplasts خالية من محلول أنزيم عن طريق إعادة التعليق في protoplasts 15ml W5 من أجهزة الطرد المركزي ، محلول لل5min عند 60 ز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ، resuspend طاف protoplasts مكعبات في الحل W5 1 - 3ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم العائد الجبلة المجردة من قبل خلية العد مع عدادة الكريات. </li></ol> الجزء 4. الكواشف : TVL : 0.3 M السوربيتول و 50 ملي CaCL 2 - تعقيم وتصفية المحل في -20 درجة مئوية. الحل انزيم : 0.5 M السكروز ، 10 ملي MES - ​​KOH [الرقم الهيدروجيني 5،7] ، 20 ملي CaCl 2 ، 40 ملم بوكل ، سلولاز 1 ٪ (Onozuka R - 10) ، Macerozyme 1 ٪ (R10). فلتر تعقيم واستخدام حديثا. W5 الحل : 0.1 ٪ (W / V) الجلوكوز ، 0.08 ٪ (W / V) بوكل ، 0.9 ٪ (W / V) كلوريد الصوديوم ، 1.84 ٪ (W / V) CaCl 2 ، 2 مم MES - ​​KOH الرقم الهيدروجيني 5.7. فلتر تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة. الجزء 5 : نتائج الممثل : به الظروف Arabidopsis الثقافة وصفها في أجزاء 1 و 2 يجعل الشتلات صحية ، ومناسبة لعزل protoplasts (الشكل 1A). الجبلة المجردة التي يتم تنقيتها السكروز كثافة غراديالطرد المركزي والأنف والحنجرة وجمعها في واجهة W5 والحلول انزيم (الشكل 1B). الجبلة المجردة تستخدم إجراء العزل وصفها في الجزء 3 ونحن الحصاد عادة 05-10 أكتوبر 6 من protoplasts سليمة (الشكل 1C) من غرام واحد من شتلات جديدة. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. عزلة protoplasts من الشتلات Arabidopsis. وكان تم جمعها من الأنسجة لمدة 14 يوما من العمر شتلة من Arabidopsis وتحويلها إلى protoplasts بواسطة إجراء تعديل من (تشن وHalkier ، 2000). باء ، المنقى Protoplasts بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة السكروز وجمعها في واجهة من والحل انزيم W5 uffer (السهام البيضاء). C ، برايت الحقل المجهري لprotoplasts. جمعت Microphotographs باستخدام كاميرا CCD تبريد ربطه مع Axioscope زايس 2 زائد المجهر.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

وقد قدم براءة اختراع مؤقتة واصفا هذا الإجراء لاستخدامها في التحليلات الفنية للجينات النباتية مع مركز كورنيل للمؤسسات التكنولوجيا وتسويقها (CCTEC) ، حزيران 2008. المفكرة لا 50341/015001 : Vatamaniuk ، موافق ، وتشاي ، Z. التحليلات الفنية للأسلوب السريع للجينات النباتية.

لضمان عالية الغلة من الجبلة المجردة سليمة من المهم جدا البدء مع النباتات صحية. استخدام فلتر تعقيم حلول لعزل protoplasts. تذكر أن protoplasts هشة. لذلك ، عندما كنت التعامل مع protoplasts ، لا يختلطان الماصة أو دوامة منهم منذ ذلك بقوة ستحد منها. بدلا من ذلك ، مزيج protoplasts عن طريق تناوب ببطء أو تسجيل أنبوب الطرد المركزي. العائد الداخلي protoplasts سليمة صفها التي هي قابلة للحياة ما لا يقل عن 96 ساعة. ولذلك ، يمكن استخدام protoplasts لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، مثل ...

<table><tbody><tr><td>مزيج أملاح موراشيج وسكوغ الأساسي (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>أجار</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>أطباق بتري (100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>سيلولاز (OnozukaR&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>ماكيروزيم (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>مناديل قماشية من الشاش</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>دوار مختبري</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي AllegraX&amp;#8208;15R</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>مجهر Axioskop 2 Plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

عزلة protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana arabidopsis</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts هي الخلايا النباتية التي كانت جدران الزنزانة لازالة إنزيمي. وكانت أول من العزلة protoplasts من الأنسجة النباتية المختلفة أكثر من 40 عاما<sup&gt; 1</sup&gt; ومنذ ذلك الحين تم تكييفها لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، مثل توطين التحت خلوية من البروتينات ، والعزلة من عضيات سليمة واستهدفت تعطيل الجينات التي تدخل RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (رني)<sup&gt; 2-5</sup&gt;. معظم بروتوكولات العزل الجبلة المجردة استخدام أنسجة نبات من Arabidopsis الناضجة (مثل 35 يوما من العمر النباتات)<sup&gt; 2-4</sup&gt;. نحن تعديل البروتوكولات القائمة من خلال توظيف Arabidopsis الشتلات لمدة 14 يوما من عمره. في هذا الإجراء ، أسفرت عن 14 غراما واحدا من أيام عمره الشتلات 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; protoplasts التي لا تزال على حالها لا يقل عن 96 ساعة. العائد من protoplasts من الشتلات هو مقارنة مع الاستعدادات من أوراق من Arabidopsis ناضجة ، ولكن بدلا من 35-36 يوما ، يتم الانتهاء من العزلة protoplasts في 15 يوما. وهذا يسمح بخفض الوقت ونمو مساحة الغرفة التي مطلوبة من أجل عزل protoplasts عندما تستخدم محطات ناضجة ، ويعجل من الدراسات اللاحقة التي تتطلب protoplasts سليمة.

هذا الفيديو يظهر إجراء لعزل protoplasts سليمة من أنسجة لمدة 14 يوما من العمر شتلة من Arabidopsis. بالنظر إلى أن protoplasts معزولة لا تزال سليمة على الأقل 96h ومعزولة من الشتلات بدلا من شهر واحد من العمر محطات ناضجة ، وهذا الإجراء يعجل المقايسات التي تتطلب protoplasts سليمة.

عزلة Protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana Arabidopsis</em

البروتوبلاست هي خلايا نباتية تمت إزالة جدرانها الخلوية إنزيميًا. وقد تم عزل البروتوبلاست من أنسجة نباتية مختلفة لأول مرة...

تبدأ هذه العملية بزراعة بذور arabidopsis على وسط Ms.Agar في اليوم 14. وبعد إنبات البذور، يتم جمع الشتلات وتقطيعها. ثم يتم هضم المادة النباتية في محلول إنزيمي يعمل على تفكيك الجدار الخلوي.يتم تصفية المزيج الناتج باستخدام قطعة من قماش الجبن لفصل البروتوبلاست عن بقية المواد النباتية. ثم تُنقى البروتوبلاست المجمعة بشكل إضافي باستخدام تدرج كثافة السكروز عن طريق وضعها في طبقة مع محلول W five. تتركز البروتوبلاست عند السطح الفاصل بين الإنزيم ومحلول W five.يتم جمعها وغسلها قبل إجراء التجربة. مرحباً، أنا جانغ جا من مختبر لينا ووك في قسم علوم المحاصيل والتربة بجامعة كورنيل. سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل صور سليمة من TH لعمر 14 يوماً من aro Ana.نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التموضع تحت الخلوي للبروتينات المستهدفة، ولعزل العضيات السليمة، وللتحليل الوظيفي للجينات باستخدام تداخل الـ RNA مزدوج الشريط. لذا، لنبدأ العمل. نبدأ الإجراء بتحضير أطباق MS بتركيز 0.5 مرة، مضافًا إليها 1% sucrose و0.7% agar للتر واحد من الوسط الغذائي.زِن 2.15 grams من مسحوق MS. أضفه إلى 800 milliliters من الماء في زجاجة قابلة للتعقيم سعتها 1.5 liter تحتوي على قضيب تحريك، وحرّك الوسط على لوحة تحريك لإذابة المسحوق أثناء التقليب. أضف هيدروكسيد البوتاسيوم العادي قطرة بقطرة لضبط الـ pH عند 5.7.استمر في التقليب وأضف 10 grams من السكروز. بعد ذلك، أضف سبعة grams من الآجار، وهو لا يذوب، ولكن سيتم إذابته لاحقاً أثناء التعقيم بالأتوكلاف. وأخيراً، اضبط الحجم ليصل إلى 1000 milliliters.قم بتعقيم وسط MS عن طريق التعقيم بالبخار (autoclaving) عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ابقِ قضيب التحريك في الزجاجة بعد التعقيم. قم بتحريك الوسط على لوح تحريك لتبريده حتى يصل إلى 60 درجة مئوية تقريباً.يمنع التقليب أثناء التبريد ترسب الآجار في قاع الزجاجة. إذا تمكن الشخص من إمساك الزجاجة بيديه لمدة 10 ثوانٍ، فهذا يعني أن الوسط قد برد بدرجة كافية ويمكن صبه في الأطباق. انتقل إلى خزانة التدفق الصفحي لصب الوسط في أطباق بتري قياس 150 في 15 مليمتر.90 ملليلتر لكل طبق. تُحفظ الأطباق عند درجة حرارة 4 °C. والآن بعد أن نمت الأطباق، أصبحت النباتات جاهزة.لنقم بتجهيز بذور Arabidopsis. ابدأ بزراعة النباتات عن طريق تعقيم بذور Arabidopsis من أجل وضعها في طبق بتري واحد. ضع البذور في أنبوب طرد مركزي دقيق (eppendorf) بكمية تعادل 50 µL من الحجم.أولاً، يتم التعقيم باستخدام الإيثانول عن طريق إضافة 1 ml من ethanol بتركيز 70% والخلط. تُحضن البذور جيداً مع الإيثانول لمدة دقيقتين، وهي الفترة التي ستترسب خلالها البذور. يتم سحب أكبر قدر ممكن من الإيثانول باستخدام الماصة، ثم تُعقم البذور باستخدام المبيض عن طريق إضافة 1 ml من محلول bleach tween والخلط لمدة 10 دقائق مع الرج باستخدام جهاز vortex كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق.لتسهيل إزالة محلول المبيض، قم بتدوير البذور بسرعة في جهاز الطرد المركزي المركزي (spin down) ثم اسحب أكبر قدر ممكن من المحلول باستخدام الماصة. تُجرى خطوة التعقيم النهائية داخل كبينة التدفق الصفائحي (laminar flow hood)؛ حيث يتم إضافة 1 mL من الماء المعقم إلى البذور وخلطها جيداً.قم بطرد البذور سريعاً باستخدام جهاز الطرد المركزي وشفط الماء. كرر عملية الغسل بالماء هذه أربع مرات أخرى. والآن بعد تعقيم البذور، قم بتوزيعها على طبق MS.بعد توزيع البذور، تُحفظ الأطباق المزروعة لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لعملية التنضيد. وبعد انقضاء 24 ساعة من الحضن، تُنقل النباتات إلى غرفة النمو وتُزرع لمدة 14 يومًا. ومع توفير إضاءة لمدة 8 ساعات وظلام لمدة 16 ساعة، تصبح الشتلات البالغة من العمر 14 يومًا جاهزة للحصاد.بعد نمو الشتلات لمدة أسبوعين، حان الوقت لتحضير البروتوبلاست داخل كبينة التدفق الصفحي. استخدم شفرة حلاقة جديدة لتقطيع جرامين من الشتلات في 15 milliliters من محلول TVL المعقم بالترشيح داخل طبق بتري. بعد ذلك، انقل الأنسجة المقطعة إلى بيكر سعة 200 milliliter ملفوف بورق ألومنيوم.أضف 20 milliliters من محلول الإنزيم المعقم بالترشيح والمحضّر حديثاً لتفكيك الجدار الخلوي للنبات. قم بتحريك الكأس بشكل دائري للمزج، ثم غطِّه بغشاء حيوي ورقائق ألومنيوم للحفاظ على الأنسجة في الظلام. استمر في رج الأنسجة النباتية في محلول الإنزيم لمدة 16 hours في درجة حرارة الغرفة.في نهاية فترة الحضنة مع محلول الإنزيم، يتم تجميع البروتوبلاستات المتحررة في أنبوب فالكون سعة 50 milliliter عن طريق تصفية الخليط من خلال ثماني طبقات من شاش قطني مبلل مسبقاً بمحلول W five. استخلص البروتوبلاستات المتبقية عن طريق غسل الشاش ببطء باستخدام 10 milliliters من محلول W five. الآن تم تجميع البروتوبلاستات في أنبوب الفالكون. قم بتغطية البروتوبلاستات بعناية بـ 5 milliliters من محلول WW five.احرص على عدم تعكير تدرج السكر المتكون عند إضافة محلول W five. بعد ذلك، قم بطرد البروتوبلاستات مركزياً لمدة سبع دقائق عند 100 Gs. تتجمع البروتوبلاستات عند السطح الفاصل بين المحلول الإنزيمي ومحلول W five. قم بجمع 10 milliliters من السائل الموجود عند السطح الفاصل.انقل البروتوبلاستات المجمعة إلى أنبوب فالكون جديد سعة 50 milliliter وأضف 15 milliliters من محلول W five. ثم قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 60 gs. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق البروتوبلاستات في 15 milliliters من محلول W five.مرة أخرى، قم بطرد البروتوبلاستات مركزياً لمدة خمس دقائق عند 60 gs. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي وإعادة التعليق. علّق البروتوبلاستات المترسبة في واحد إلى اثنين ملليلتر من محلول W five.أخيراً، قم بتقييم إنتاجية البروتوبلاستات عن طريق عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) تحت المجهر. ينتج عن إجراء الاستزراع الموصوف هنا شتلات Arabidopsis صحية ومناسبة لعزل البروتوبلاستات بعد عملية الهضم والفصل باستخدام تدرج الكثافة. وعادةً ما ينتج عن حصاد جرام واحد من الشتلات الطازجة ما يتراوح بين 5 إلى 10 × 10⁶ من البروتوبلاستات السليمة.لقد أوضحنا لكم كيفية عزل البروتوبلاست من أوراق نبات aosis في عمر 14 يوماً. عند إجراء هذه العملية، من المهم جداً تذكر أن النجاح يعتمد على صحة النباتات؛ لذا، من الضروري الحفاظ على نسبة ساق إلى طبق دقيقة ومحددة في هذا البروتوكول لـ net mills, ms.الوسط لكل طبق. وأخيراً، تذكر أن مصفوفات البروتين هشة للغاية. بمجرد إزالة الخلية، تعامل مع مصفوفات البروتين بعناية من خلال المزج عن طريق النقر بدلاً من استخدام جهاز الرج (vortexing) أو الماصة للأعلى والأسفل.هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة. بالتوفيق في تجربتكم.

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويتجلى طريقة لعزل أنواع معينة من الخلايا من المواد النباتية. تستخدم هذه التقنية خطوط علامة المعدلة وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية أنواع الخلايا وجه الخصوص ، والإسفار الخلوية تفارق الفرز الخلية المنشط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأسيس الإعداد النمو هنا تسهل...

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

ويجري التحقيق في الأساس الجزيئي للمكانية محددة ردود فيتوكروم استخدام النباتات المعدلة وراثيا التي تظهر الأنسجة والأعضاء القصور فيتوكروم محددة. عزل خلايا معينة العارضة التي يسببها استنزاف حامل اللون فيتوكروم التي الإسفار المنشط الخلية فرز تليها تحليلات ميكروأري يجري استخدامها لتحديد الجينات المسؤولة عن ردود فيتوكروم مكانية محددة.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير...

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

تنظم الساعة اليومية عن ثلث Transcriptome على نبات الأرابيدوبسيس، لكن نسبة الجينات التي تغذي مرة أخرى إلى ضبط الوقت ما زال مجهولا. نحن هنا تصور طريقة لتقييم بسرعة الظواهر الإيقاعية في أي خط متحولة من نبات الأرابيدوبسيس باستخدام التصوير الانارة مراسل الإيقاعية أعرب عابر في جبلة مجردة.

تحليل سريع من الظواهر الإيقاعية في نبات الأرابيدوبسيس جبلة مجردة Transfected مع ساعة مراسل الفلورسنت

هنا، نقدم بروتوكول الالتقاط إنتيراكتوم تطبيقها على أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق ميسوفيل ورقة بروتوبلاستس. هذه الطريقة تعتمد بشكل حاسم على في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك ويسمح لعزل وتحديد البروتينات مرنا مرتبط النبات من بيئة فسيولوجية.

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.

طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر

هنا، يمكننا وصف أسلوب لتنقية المعايشة سليمة من أوراق نبات وعلى المقصورات الفرعية الرئيسية الثلاثة (المغلف، سدى، وثيلاكويدس)، باستخدام مزيج من سينتريفوجيشنز التفاضلية، التدرجات بركل المستمر، و تدرجات السكروز متقطع. الأسلوب قيمة بالنسبة سوببلاستيديال والترجمة سوبسيلولار للبروتينات إيمونوبلوتينج والبروتينات.

إعداد الأقسام الفرعية بلاستيدات الخضراء من نبات لتحليل البروتين التعريب Immunoblotting أو البروتيوميات

تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

يصف هذا البروتوكول تحضير عينات سليمة من طبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا . لا تتطلب هذه الطريقة سوى معدات مختبرية شائعة ، مثل إبرة الحقن والملقط الدقيق ، وتتيح تصوير الخلايا الحية الفلورية عالية الدقة لخلايا السويداء في كل من البذور النامية والناضجة.

تحضير الأنسجة السليمة للتحليل المجهري لطبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس النامية والناضجة

هذه المقالة يوضح الأزهار وتراجع...

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

تعلم عزل البروتوبلاستات السليمة من شتلات Arabidopsis thaliana عمرها 14 يوماً باستخدام الهضم الإنزيمي والتدرج الكثيف. تبقى الخلايا حية لمدة 96 ساعة على الأقل للدراسات الخلوية.

عزلة Protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana Arabidopsis

استكشف المزيد من الفيديوهات