يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

نقوم بتشريح اليرقات عن طريق الإمساك بالنهايتين الخلفية والأمامية، ثم سحب الملاقط في اتجاهين متعاكسين. يتم قص الأنسجة الزائدة باستخدام مقصات دقيقة للغاية، مما يؤدي إلى كشف نصفي الكرة لقرص تخيلي لعين دماغ اليرقة.

الحبل العصبي البطني وكلاليب الفم. يتم نقل مجمع الدماغ والعين اليرقِيّ إلى غرفة استنبات. نقوم بفصل فص الدماغ عن السويقة البصرية لتصور هجرة الخلايا الدبقية داخل قرص تخيلي للعين من النوع البري.

لمراقبة الخلايا الدبقية المتوقفة في السويقة البصرية لطفرة ما، نترك فص الدماغ متصلاً بالسويقة البصرية. مرحباً، أنا باتريك كافرتي من مختبر فانيسا ألس في قسم علم الحيوان بجامعة كولومبيا البريطانية. مرحباً، أنا رين.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير الخلايا الدبقية المهاجرة في عين ذبابة الدروزيلا (drosophila) النامية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تطور الخلايا الدبقية. لذا، دعونا نبدأ.

قبل أسبوع واحد من بدء التجربة، يتم تزويج الذباب لإنتاج يرقات تعبّر عن GFP تحت تحكم محفز متخصص بالخلايا الدبقية. تتضمن هذه التجربة تصور GFP الملحق بتسلسل تحديد الموقع النووي والذي يتم التعبير عنه في الخلايا الدبقية. باستخدام محفز القطبية المعكوسة، يتم تحضير شرائح تغطية مستديرة بقياس 18 مليمتر قبل يوم واحد على الأقل من خلال نقعها لمدة 10 دقائق في محلول poly L lysine بتركيز 1%، ثم تجفيفها بالهواء طوال الليل في اليوم الذي يسبق التجربة.

قم بتنظيف غرفة استنبات مغناطيسية ذات سلسلة متصلة عن طريق نقع مكوناتها طوال الليل في ethanol 70% في يوم التجربة. استخدم تقنيات التعقيم لتحضير وسط الاستنبات. أضف مصل جنين البقر ومحلول penicillin و streptomycin وأنسولين إلى 10 milliliters من وسط شنايدر للحشرات (Schneider's insect medium).

اترك غرفة الزرع المغناطيسية ذات السلسلة النظيفة لتجف في الهواء داخل غطاء زرع الخلايا قبل غسل بقايا الإيثانول عن طريق الشطف بوسط زرع مُحضّر. وبمجرد إتمام هذه التحضيرات، يمكننا البدء في تشريح مجمع العين والدماغ في ذبابة drosophila. لبدء هذا الإجراء، اختر يرقة متجولة في الطور الثالث من جانب قارورة الذباب وضعها في قطرة من وسط زرع مبرد على طبق بتري فوق الثلج لعدة دقائق من أجل التبريد.

يُنصح بتهدئة انقباضات الجسم الدودية لليرقة لتسهيل عملية التشريح. بعد ذلك، ضع اليرقة المبردة في قطرة من وسط استزراع على طبق مغطى بطبقة من السارد تحت مجهر تشريحي، واستخدم ملقط Dumont دقيق للإمساك باليرقة بإحكام. عند مسافة تقارب الثلث من الطرف الخلفي، انتظر حتى تبرز اليرقة خطاطيف الفم من الطرف الأمامي، وعندما تمتد خطاطيف الفم بالكامل، أمسك بها باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط.

لتشريح اليرقات، اسحب زوجي الملاقط ببطء في اتجاهين متعاكسين. سينفصل معقد العين والدماغ، جنبًا إلى جنب مع الغدد اللعابية والأجسام الدهنية والأنسجة التخيلية، عن جسم اليرقة. لا تسحب خطافات الفم بسرعة كبيرة وإلا ستتمزق عن معقد iBrain.

قم بإزالة الغدد اللعابية، والأجسام الدهنية، والأقراص الخيالية. باستخدام مقصات قطع دقيقة للغاية، ستظل نصفا الدماغ وأقراص العين متصلتين بالحبل العصبي البطني وكلاليب الفم. بعد ذلك، ضع غطاء شريحة مقاس 18 مليمتر على شريحة زجاجية، مع ترك حافة واحدة من غطاء الشريحة خارج طرف الشريحة. ومن أجل تسهيل التقاط غطاء الشريحة لاحقاً، أضف قطرة من وسط استزراع فوق غطاء الشريحة.

أمسك خطاطيف الفم باستخدام الملقط وانقل معقد الدماغ (iBrain complex) إلى وسط الزرع الموجود على غطاء الشريحة. وبمجرد نقل معقد العين والدماغ إلى غطاء الشريحة، استخدم مقص تشريح دقيق لقص خطاطيف الفم من معقد العين والدماغ.

تعد إزالة خطاطيف الفم أمراً هاماً للتصوير الحي، حيث ستستمر هذه الخطاطيف في الانقباض داخل وسط الزرع، مما يتسبب في تحريك الأنسجة أثناء الفحص المجهري. ولتجسيد الخلايا الدبقية (GL) داخل السويقة البصرية، اترك السويقة البصرية للدماغ والقرص الخيالي للعين دون مساس. أما لتجسيد الهجرة الدبقية داخل القرص الخيالي للعين، فقم بقطع السويقة البصرية بعناية، وهي النسيج الرقيق الذي يربط الدماغ بقرص العين، ثم ادفع الدماغ بعيداً أو تخلص منه.

أخيرًا، ارفع غطاء الشريحة باستخدام الملقط وارسم دائرة تحته حول النسيج المراد دراسته باستخدام قلم تحديد دائم. ستساعد هذه الدائرة في تحديد موقع النسيج عند الفحص المجهري لاحقًا. الآن أصبح قرص التخيّل للعين جاهزًا للتثبيت في غرفة زراعة مغناطيسية.

لتثبيت قرص العين التخيلي في غرفة استزراع مغناطيسية، استخدم الملقط للإمساك بالحافة المتدلية لشريحة الغطاء ونقل شريحة الغطاء إلى اللوحة السفلية لغرفة الخط المتسلسل المغناطيسية دون تحريك النسيج المستزرع. بعد ذلك، ضع الحلقة المطاطية (o-ring) من السيليكون على الجسم الرئيسي لغرفة الخط المتسلسل. قم بتركيب الجسم الرئيسي فوق اللوحة السفلية ببطء.

أضف الوسط الغذائي إلى الغرفة. لا تضف الوسط الغذائي بسرعة كبيرة لتجنب تحريك النسيج، وذلك للسماح بتبادل الغازات تحت الغطاء. لا تملأ الغرفة بالكامل، ثم ضع الغطاء الشفاف برفق فوق غرفة خط الخلايا.

لتصور الخلايا الدبقية المهاجرة، ضع غرفة المزرعة على منصة مجهر متحد البؤر أو مجهر فلوري. حدد موقع العينة باستخدام الدائرة الموجودة على شريحة التغطية كمرجع عند تكبير منخفض. قم بضبط التركيز على العينة باستخدام عدسة بقوة 40 مرة.

اترك النسيج ليستقر، ثم التقط صوراً لقرص العين أو السويقة البصرية كل 10 إلى 15 دقيقة على مدار ثلاث إلى أربع ساعات في حال تنفيذ الخطوات بشكل صحيح. سينتج عن هذا البروتوكول سلسلة من الصور للخلايا الدبقية الموسومة بـ GFP وهي تهاجر من السويقة البصرية إلى قرص العين التخيلي. وبينما كان التصوير الحي لمدة 60 دقيقة كافياً لملاحظة التغيرات في مواقع النوى الدبقية في قرص العين التخيلي من النوع البري، فإن النوى الدبقية في طفرة لجين ضروري لهجرة الخلايا الدبقية فشلت تماماً في الخروج من السويقة البصرية.

لقد قمنا باستنبات معقدات العين والدماغ لفترات تصل إلى 240 دقيقة قبل ملاحظة تدهور الأنسجة المستنبتة. وبعد نقطة 240 دقيقة، نبدأ في ملاحظة خلايا موجبة لـ GFP في وسط الاستنبات المحيط بمعقدات العين والدماغ المستنبتة. بالإضافة إلى ذلك، سيتراكم GFP في بقع منتشرة عبر الأنسجة، مما يشير إلى حدوث خلل في سلامة الأنسجة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية زراعة الأقراص الخيالية من أجل دراسة هجرة الخلايا الدبقية. شكرًا للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.