قياس سبان الخميرة الحياة الزمني بواسطة خلايا ثمرة المسنين

يتم الحفاظ على مزارع الشيخوخة في أنابيب اختبار عند 30 درجة مئوية مع إثارة مستمرة. Bio ، أسطوانة أسطوانية ، يتم تلقيح مجموعة من الخلايا من كل ثقافة شيخوخة في بئر من لوحة قرص العسل الحيوية التي تحتوي على وسط YEPD. تقوم آلة CMBR ذات الشاشة الحيوية بتحتضن لوحة قرص العسل وتهزها لمدة 24 ساعة أثناء قياس الكثافة البصرية لكل بئر.

كل 30 دقيقة يمكن إنشاء منحنيات النمو من إخراج البيانات بواسطة الشاشة الحيوية ، والتي يمكن استخدامها لحساب جدوى كل ثقافة شيخوخة. بعد كثافة خلايا الحضانة لمدة 24 ساعة في صفيحة قرص العسل ، يمكن أن تختلف الآبار اعتمادا على جدوى ثقافة الشيخوخة الأصلية. مرحبا ، أنا كريس موراكامي من مختبر الدكتور مات كابلين وقسم علم الأمراض هنا في جامعة واشنطن.

سنعرض لكم اليوم إجراء لتحديد العمر الزمني للأوز باستخدام نمو الخلايا العمرية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية تأثير العوامل الوراثية والبيئية على طول عمر الخميرة. لذلك دعونا نبدأ.

لتحضير الثقافات الشيخوخة ، فإن الخط الأول لسلالات الخميرة من المخزونات المجمدة على ألواح المثقاب YEPD تحتضن الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أو حتى تظهر مستعمرات مفردة. بمجرد ظهور مستعمرات مفردة ، اختر مستعمرات مفردة وقم بتلقيحها في خمسة ملليلتر من YEPD. وسط سائل.

في أنابيب الاختبار ، قم بزراعة الثقافات بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية في أسطوانة أسطوانية للحفاظ على التحريض المستمر بعد الحضانة الليلية ، استخدم 50 ميكرولترا من كل ثقافة لتلقيح خمسة ملليلتر من الوسط الاصطناعي الكامل. بشكل عام ، يتم تحضير ثلاث مزارع SC لكل سلالة لتوفير تكرار بيولوجي ثلاثي لتحليل العمر لكل سلالة يتم فحصها. حافظ على الثقافات عند 30 درجة مئوية مع تحريض مستمر على أسطوانة أسطوانية للتجربة بأكملها ، والتي تكون بشكل عام أسبوعين أو أكثر بعد يومين من الزراعة.

في وسائط SC ، يجب أن تكون الخلايا في مرحلة ثابتة وتكون نقطة العمر الأولى جاهزة للأخذ. يجب أن تؤخذ النقاط العمرية اللاحقة كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة أسبوعين على الأقل. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد الشاشة الحيوية.

100 لوح قرص العسل جيدا للتلقيح تملأ كل بئر ب 145 ميكرولتر من YEPD. تأكد من ترك واحدة على الأقل مملوءة ب YEPD فقط ولا توجد خلايا لتحليل البيانات لاحقا. قم بإزالة الثقافات الشيخوخة من الحاضنة.

باختصار ، دوامة أول ثقافة يتم تلقيحها في لوحة قرص العسل. احرص على عدم انسكاب أي من الثقافة. قم بإشعال فم أنبوب الاختبار وإزالة خمسة ميكرولترات من الثقافة ، وقم بتثبيتها في البئر الأول من لوحة قرص العسل.

لا تنس أن تشعل فم أنبوب الاختبار. بعد إزالة خمسة ميكرولتر ، كرر إجراء التلقيح هذا لكل ثقافة شيخوخة. تأكد من ملاحظة موضع البئر المقابل لكل ثقافة متطابقة.

يجب استخدام أوضاع البئر لكل نقطة عمرية لاحقة خلال التجربة بأكملها. أعد الثقافات إلى حاضنة 30 درجة مئوية. عند الانتهاء من التطعيمات ، بعد تلقيح الثقافات في لوحة قرص العسل ، يتم تحميل اللوحة في آلة CMBR ذات الشاشة الحيوية.

للقيام بذلك ، قم بتعريض حجرة الحاضنة عن طريق رفع الغطاء. ثم قم بإزالة الغطاء إلى صينية العينات. أدخل لوح قرص العسل الملقح حديثا في صينية العينات.

استخدم الفتحة اليسرى. إذا كنت تقرأ لوحة واحدة فقط ، فاستبدل الغطاء بدرج العينات وقم بخفض الغطاء إلى حجرة الحاضنة. من المهم التأكد من أن سائل نقل الحرارة أعلى من الحد الأدنى لمستوى التعبئة.

إذا لم يكن الأمر كذلك، فأضف المزيد من سائل نقل الحرارة باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر باستخدام برنامج الشاشة الحيوية تجربة سهلة. قم بتعيين المعلمات التالية للحصول على منحنيات نمو مناسبة ل croce visi. بالنسبة لعدد العينات ، أدخل عدد الآبار ذات الوسائط أو 200 ، واضبط المرشح على أربعة بعرض 20 إلى خمسة 80 نانومتر. شريط.

اضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية. يجب أن تكون مدة التجربة يوما واحدا ، صفر ساعة ، صفر ثانية. يجب أن يكون الفاصل الزمني للقياس 30 دقيقة.

وأخيرا ، يجب ضبط الاهتزاز على الاهتزاز المستمر وبدء النقر العالي لبدء القراءات. احصل على ملفات الإخراج من جهاز CMBR للشاشة الحيوية. سيقوم برنامج التجربة السهلة بإخراج بيانات الشاشة الحيوية كملف محدد بعلامات التبويب متوافق مع Microsoft Excel والبرامج الأخرى.

العمود الأول ، العمود A الوقت الذي تم فيه إجراء قياس OD أثناء التجربة. تمثل الأعمدة اللاحقة كل بئر في الشاشة الحيوية ، وألواح قرص العسل الملقحة بخلايا من الثقافات الشيخوخة. احذف قراءة التطوير التنظيمي الأولى من كل عمود لأن هذه القراءة هي ضوضاء.

تطبيع البيانات عن طريق طرح قيمة الكثافة الضوئية للبئر باستخدام YEPD وحده من قيم الكثافة الضوئية في كل عمود. هذا يزيل امتصاص الخلفية بواسطة مخطط الوسائط. منحنيات النمو.

سوف تتغير المنحنيات كدالة للعمر ، على سبيل المثال ، من خلال رسم منحنيات النمو من العمود الأول ، حسنا واحدة من لوحة قرص العسل على النقاط الزمنية الست ، هناك تحول واضح لليمين للمنحنيات بمرور الوقت. يحدد طول الوقت بين النقطة الزمنية الأولية واليوم الثاني والنقطة الزمنية المتتالية الجدوى في هذا العمر بالذات. احسب وقت المضاعفة لكل بئر بناء على حركية النمو في اليوم الثاني

تبدو المعادلة المستخدمة لحساب زمن المضاعفة كما يلي، حيث يمثل OD واحد و OD الثاني قياسات الكثافة البصرية المتتالية و T واحد و T اثنين هما الوقت بين القياسات. احسب أوقات المضاعفة فقط بين قيم OD 0.2 و 0.5. متوسط هذه القيم هو وقت مضاعفة ذلك.

حسنا ، يجب أن تعطي معظم سلالات الخميرة البرية قيمة زمنية مضاعفة بين 85 إلى 90 دقيقة لكل نقطة عمرية. احسب التحول الزمني دلتا T في منحنيات النمو بالنسبة لنقطة العمر الأولية ، وهي اليوم الثاني. تتمثل إحدى الطرق السهلة للقيام بذلك في تحديد الفرق في طول الوقت الذي يستغرقه كل بئر للوصول إلى OD قدره 0.3 بين نقطة العمر الأولية وكل نقطة عمر لاحقة.

يمكن حساب الوقت الذي وصل فيه بئر معين إلى OD قدره 0.3 من معادلة الانحدار الخطي المقابلة للكثافة البصرية اللوغاريتمية الطبيعية. احسب الكسر الباقي على قيد الحياة في كل نقطة عمرية من أجل إنشاء منحنى البقاء على قيد الحياة مع نقطة العمر الثانية الأولى ، والتي تمثل قابلية البقاء بنسبة 100٪ لكل نقطة عمر متتالية. احسب النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة باستخدام المعادلة التالية.

حيث SN هي نسبة البقاء على قيد الحياة. Delta TN هو التحول الزمني ، و Sigma N هو وقت المضاعفة. قم بإنشاء منحنيات البقاء على قيد الحياة حسب الرغبة لكل منها.

حسنا ، من خلال رسم جزء الخلايا القابلة للحياة كدالة للعمر ، احسب تكامل البقاء على قيد الحياة لكل بئر يتم تعريف SI على أنه المنطقة الواقعة تحت منحنى البقاء على قيد الحياة ويمكن تقديرها بهذه الصيغة حيث العمر N هو نقطة العمر و SN هي قيمة بقائها عند تلك النقطة العمرية تحدد المعلمات الإحصائية للآبار المتماثلة من SI وبيانات البقاء على قيد الحياة. تشمل المعلمات الإحصائية الشائعة ذات الأهمية متوسط الوسيط والتباين لكل مجموعة من التكرارات البيولوجية. يمكن استخدام اختبار T أو تحليل مشابه للمقارنة الزوجية للنظام الدولي للوحدات لمجموعات تجريبية وضابطة مختلفة.

قد يكون من المرغوب فيه أيضا إنشاء منحنيات البقاء على قيد الحياة من التكرار المتوسط إلى التكرار البيولوجي. عند الانتهاء من التجربة ، ستكون قد رسمت منحنى البقاء على قيد الحياة وأجريت تحليلا كافيا للبيانات لتحديد إمكانات الشيخوخة الزمنية للعديد من السلالات أو الظروف المختلفة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يجب أن تبدو منحنيات النمو التي تم الحصول عليها من آلة CMBR للشاشة الحيوية مشابهة لهذا المنحنى. بشكل عام ، سيكون للخلايا البرية المستزرعة في ظل الظروف الموضحة هنا متوسط عمر زمني في حدود سبعة أيام.

لوحظ تباين كبير في البقاء على قيد الحياة في سلالات مختلفة وفي ظل بعض الظروف مثل النمو في 0.05٪ يمكن أن يتجاوز متوسط بقاء وسائط الجلوكوز 30 يوما. لقد أظهرنا لك للتو طريقة إنتاجية عالية لتحديد العمر الزمني للخميرة كميا. القرمشة الكروكية.

من المهم أن تتذكر أنه عند القيام بهذا الإجراء ، فإن الصيانة الروتينية لجهاز CMBR للشاشة الحيوية مهمة لكل من البيانات القابلة للتكرار والدقة. هذا كل شيء. حظا سعيدا في تجاربك.