Dendra2 Photoswitching من خلال نافذة التصوير الثديية

يوضح هذا الفيديو بروتوكولاً يبدأ بحقن خط خلوي ورمي يعبر عن بروتين فلوري في الوسادة الدهنية الثديية للفأر. يتم إنشاء غرفة متخصصة للتصوير الحي ثم زرعها جراحياً في الحيوان، وهي النقطة التي يمكن عندها الحصول على بيانات التصوير. مرحباً، أنا الدكتور Vic من مختبر الدكتور John Condi والدكتور Jeffrey Siegel في مركز Biophotonics في كلية Albert Einstein للطب.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتبديل الضوئي والتصوير الحي داخل الجسم لخلايا سرطانية موسومة بـ DRA two من خلال نافذة تصوير الذاكرة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثير البيئة الدقيقة للورم على حركية الخلايا الورمية. لذا، لنبدأ بتطبيق ذلك مع ارتداء قفازات اللاتكس.

ابدأ بتصنيع نافذة تصوير الثدي، أو MIW، عن طريق تسخين طبق زراعة أنسجة يتراوح قطره من 5 إلى 10 سنتيمتر، وتكوين سطح منحني عن طريق دفع جسم صلب مستدير، مثل ريشة دريميل (Dremel) مقاس بوصة واحدة، مقابل الطبق. استقطع مركز الطبق باستخدام شفرة حلاقة ساخنة. الآن، استخدم ريشة دريميل صغيرة مخروطية الشكل لعمل ثقب بقطر يتراوح من 6 إلى 7 مليمتر في مركز القاعدة البلاستيكية ذات الشكل القبي.

اجعل حواف القاعدة البلاستيكية ناعمة تماماً عن طريق صنفرتها باستخدام جهاز Dremel ثم بردها بشكل إضافي. قم ببرد الجزء العلوي من القاعدة البلاستيكية لإنشاء سطح مستوٍ لغطاء الشريحة الزجاجي. يجب أن يتراوح قطر السطح المستوي المبرود بين 9 إلى 10 مليمترات.

بعد ذلك، قم بلصق الغطاء الزجاجي الدائري الذي يبلغ قطره ثمانية مليمترات. ثبته على السطح المستوي باستخدام الغراء السريع واتركه ليجف لمدة 15 دقيقة. وباستخدام إبرة 26 G مسخنة، اصنع ثماني فتحات خياطة عن طريق الثقب من الخارج إلى داخل القاعدة، مع مراعاة توزيع الفتحات بالتساوي حول الغطاء.

مرر nwt على مسافة تتراوح بين 0.5 إلى واحد مليمتر بعيداً عن حافة غطاء الشريحة. اغسل MIW بالماء منزوع الأيونات، ثم مرة أخرى باستخدام الإيثانول بتركيز 70%. استخدم مسحة قطنية (Q-tip) لتنظيف الزجاج حتى يصبح شفافاً تماماً.

استخدم الأسيتون لإزالة أي بقع ضبابية متبقية ناتجة عن بخار الغراء. وأخيراً، قم بتعقيم MIW عن طريق تعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاث ساعات على كل جانب. وقبل إدخال MIW، يجب أن تكون المنطقة المحيطة بالحلمة الرابعة قد شكلت ورماً صغيراً بقطر يتراوح بين خمسة إلى سبعة مليمتر كـنتيجة لحقن الخلايا الورمية.

في الجزء الأول، تحقق من التأكد من أن الورم ليس نخرياً بشكل مرئي. يجب أن يكون الجلد سليماً مع وجود شعر في المنطقة المحيطة به. للبدء، قم بتجهيز مساحة معقمة للجراحة عن طريق وضع قطعة من القماش المعقم داخل غطاء معقم.

ضع قطعة من الشاش المعقم في المنتصف وجمع الأدوات التي ستحتاجها للجراحة. ستحتاج إلى زوج من مقاص التشريح الصغيرة وزوج من مقاص التشريح الكبيرة، ومقاص زنبركية، وملاقط تشريح دقيقة، وملقط جراحي، وحامل إبر. بعد تخدير الفأر باستخدام 2.5% averting، استخدم ماكينة حلاقة للحيوانات الصغيرة لحلاقة المنطقة التي تعلو الورم. استخدم كريم إزالة الشعر لإزالة بقية الشعر وتنظيف الجلد.

باستخدام أعواد قطنية مغموسة في الإيثانول، انقل الحيوان إلى شاش معقم وضع مرهمًا للعين على العينين لمنعهما من الجفاف والتعرض للعدوى. قم بتعقيم الجلد باستخدام Betadine ثم نظفه بإيثانول 70%.

باستخدام قطعة قماش جراحية معقمة، اسحب الجلد الموجود مباشرة في الجهة الإنسية للحلمة باستخدام الملقط، ثم قم بإجراء شق يبلغ طوله حوالي 2 mm. افصل وسادة الدهون الثدية الموجودة أسفل الجلد باستخدام التشريح والمقص والملقط. عند الفصل، يتمدد الجلد والفتحة إلى حجم يسمح بإدخال MIW.

أدخل نافذة التصوير الدقيقة (MIW) بحيث يكون الجلد فوق قاعدة الـ MIW وقم بتثبيتها بالغرز الجراحية. استخدم لاصق الأنسجة أو سيانوأكريليت لملء ثقوب الغرز وتثبيت الـ MIW بالجلد. يجب ترك الحيوان الآن للتعافي لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة أيام قبل إجراء جلسة التصوير الأولى.

تمهيداً لجلسة التصوير، يمكننا وصف صندوق التصوير لكيفية استخدامه. أولاً، يتم تخدير الحيوان باستخدام isof fluorine ووضع مرهم للعينين. ثم يتم توصيل مخرج isof fluorine من جهاز التخدير بمقدمة صندوق التصوير.

على الجانب الخارجي لفتحة الإدخال. قم بتوصيل أنبوب ثانٍ بفتحة المخرج في صندوق التصوير. يجب توصيل هذا الأنبوب بمرشح الغاز ثم بالمضخة المفرغة.

بعد ذلك، ضع الحيوان بحيث يكون الـ MIW مواجهاً للأسفل. أمسك الصندوق واضبط الأبواب السفلية بحيث يتم تثبيت قاعدة الـ MIW ومنعها من الحركة بينهما. يجب أن تكون قاعدة الـ MIW في نفس مستوى أبواب صندوق التصوير.

بينما يجب أن تكون شريحة التغطية الخاصة بـ MIW على بعد بضعة مليمترات فقط تحت هذا المستوى، تأكد من أن وضع MIW بين الأبواب المنزلقة السفلية يضمن استلقاء شريحة التغطية بشكل مسطح وموازٍ للأبواب السفلية للصندوق. سيتيح ذلك التركيز الصحيح؛ قم بخفض عدسة المجهس objektive لإفساح المجال لوضع الصندوق فوق منصة المجهر. اضبط المنصة بحيث تكون شريحة تغطية MIW فوق العدسة.

يمكننا الآن ضبط بؤرة العدسة الشيئية والبدء في التصوير. إن إجراء التصوير الموضح هنا مخصص لمجهر Leica SP five confocal، وينبغي استخدامه كدليل لتحسين التجربة وفقاً للمجهر المحدد المستخدم. ابدأ بملاحظة الورم من خلال العدسة العينية باستخدام مرشح فلوري أخضر.

حدد الأوعية الدموية الرئيسية التي يظهر تدفقها بوضوح وتكون ممتدة بشكل مسطح في نفس المستوى البؤري. ضع أحد هذه الأوعية في مركز مجال الرؤية، ثم انتقل إلى وضع الكشف باستخدام أنبوب المضاعف الضوئي (PMT). سنقوم بإعداد تجميع الصور المتتابعة لقناتين.

تستخدم إحدى القنوات خط الليزر بطول موجي 488 nanometer وتجمع التشتت من المصفوفة خارج الخلوية والانبعاث من الشكل الأخضر لبروتين dendra two. وتستخدم القناة الثانية خط الليزر بطول موجي 543 nanometer وتجمع الانبعاث من الشكل الأحمر لبروتين dendra two. قم بجمع صور ثلاثية الأبعاد (3D) قبل عملية التبديل الضوئي.

بعد ذلك، استخدم خيار مسح المنطقة المستهدفة (region of interest scan) لإجراء تحويل ضوئي لمجموعة مختارة من الخلايا باستخدام خط الليزر بطول موجي 405 nanometer. قم بجمع الانبعاثات من الشكل الأحمر للبروتين لمراقبة عملية التحويل. الآن، قم بجمع صور ثلاثية الأبعاد (3D) بعد التحويل بنفس الطريقة التي استُخدمت لجمع الصور قبل التحويل.

حسنًا، باستخدام قدرة ليزر تبلغ 20% في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (UV) لتحويل هذه المنطقة إلى مفتاح ضوئي (photo switch)، يتم تحويل أكثر من منطقة واحدة في الورم، ثم تُؤخذ صور عبر العدسات العينية باستخدام كاميرا رقمية في كل من القناتين الخضراء والحمراء. سيساعد ذلك في عملية التوجيه خلال جلسات التصوير اللاحقة. في هذه الصورة، يُلاحظ وجود منطقة مفتاح ضوئي مستطيلة الشكل، موجهة بشكل متعامد بالنسبة للوعاء الدموي الذي لا يظهر أي فلورية.

تظهر الخلايا التي لم يتم تحويلها ضوئياً باللون الأخضر، بينما يظهر التشتت الناتج عن المصفوفة خارج الخلوية باللون الأرجواني. الصورة عبارة عن مسقط لأقصى كثافة لأربع صور عبر المحور Z. لقد عرضنا لكم للتو كيفية التحويل الضوئي وتصوير الخلايا الموصومة بـ RA tool من خلال نافذة تصوير الذاكرة.

يعد استخدام هذا الإجراء أمراً هاماً لمقارنة سلوكيات الخلايا الورمية في مناطق مختلفة من الورم على مدار عدة أيام. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.