الجمع بين الأعصاب الطرفية التطعيم والتحوير ماتريكس لإصلاح الحبل الشوكي المصاب الجرذ

تبدأ التحضيرات لزراعة عصب طرفي في موقع إصابة بالنخاع الشوكي بعملية تنكس مسبق للعصب الطرفي (PNG) قبل سبعة إلى 10 أيام من عملية الزراعة. يتم قطع فرع العصب الظنبوبي من جرذ مانح. كما يتم إجراء قطع نصفي عند المستوى الرقبي الخامس أو C5 عن طريق الشفط.

يتم استئصال العصب الوركي (PNG) من الجرذ المانح ووضعه مقابل الجدار المنقاري لتجويف الآفة وتثبيته عن طريق خياطة الذهب بالغشاء الأم (dura mater). وبعد ثلاثة أسابيع، يتم إحداث آفة في الربع الظهري عند المستوى C7، حيث توضع رغوة هلامية مشبعة بـ C-H-A-B-C في التجويف لمدة 15 دقيقة لهضم البروتيوغليكانات في الندبة الدبقية. وبعد يومين، يتم حقن C-H-A-B-C مجهرياً بجوار موقع الآفة، ويوضع الطرف القاصي للعصب الوركي (PNG) مقابل آفة الربع الظهري.

مرحباً، أنا جون هولا، مدير مركز أبحاث إصابات النخاع الشوكي في كلية الطب بجامعة دريكسل. وأنا الدكتورة فيرونيكا توم من مختبر هولا، وأنا مارثا مين.

من مختبر hula. سنقوم اليوم بشرح إجراء لزراعة قطعة من عصب طرفي في النخاع الشوكي المصاب لجرذ بالغ. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تجدد المحاور العصبية واستعادة الوظائف بعد إصابة النخاع الشوكي.

حسناً، لنبدأ. للتحضير للجراحة المجهرية، قم بتطهير محطة الجراحة وتعقيم جميع الأدوات الجراحية بجهاز الأوتوكلاف. قم بتجهيز الحاجز الحراري وقطع رغوة الجيلاتين الصغيرة التي يقل حجمها عن 2 مم³ لإرقاء الدم المجهري.

قم بتجهيز مسحات قطنية، وضمادات شاش، وأدوات جراحية. ضع الجرذ المخدر على طاولة التحضير بعد التأكد من تخدير الحيوان تماماً عن طريق قرص الإصبع. احلق منطقة واسعة من الفراء في المجال الجراحي المستهدف، ثم اغسل موقع الجراحة باتباع تقنية الفرك المطهرة الموضحة في البروتوكول النصي المصاحب.

بعد ذلك، ضع الجرذ على الغطاء العازل للحرارة وقم بتغطية أنفه وفمه بمخروط الاستنشاق، وخفّض نسبة الـ isof fluorine إلى 3% ومعدل التدفق إلى 0.2 liters per minute. أعطِ الجرعة المناسبة من المضاد الحيوي ampicillin عن طريق الحقن تحت الجلد، والمسكن buprenorphine عن طريق الحقن في العضل. يتم قطع العصب الطرفي أو PN قبل إزالته بسبعة إلى 10 أيام لتحفيز التحلل، مما يوفر بيئة أكثر ملاءمة للنمو المحوري مقارنة بما توفره تحضيرات الأعصاب الحديثة.

لبدء قطع العصب الوركي (pn)، ضع الحيوان على جانبه. استبدل القفازات بأخرى معقمة وضع غطاءً جراحياً معقماً حول موقع الجراحة. قم بإجراء شق خطي مستقيم من رأس الفخذ إلى الركبة، مع الحفاظ على مسار موازٍ للفخذ وبمسافة ثلاثة مليمترات تقريباً منه، ثم اقطع عبر عضلات العضد ذات الرأسين السطحية على طول نفس خط شق الجلد للكشف عن العضلة المتسعة الوحشية الكامنة تحتها.

بمجرد كشف العضلة المتسعة الوحشية، استخدم المقص لإجراء قطع صغير فيها بالقرب من الركبة ومد هذا القطع للأعلى باتجاه رأس الفخذ. افصل العضلة المتسعة الوحشية برفق باستخدام المباعدات حتى تظهر الفروع المشتركة للعصب الظنبوبي والعصب الشظوي من العصب الوركي وهي تسير بموازاة عظم الفخذ. بعد ذلك، تتبع فروع هذه الأعصاب باتجاه رأس الفخذ حتى يتم تحديد الجذع الرئيسي للعصب الوركي.

أسفل تفرع العصب الوركي مباشرةً، استخدم ملقطاً دقيقاً لفصل النسيج الضام أو غلاف العصب المحيط بفرع العصب الظنبوبي بعناية. هذا هو الفرع الأكبر. وبمجرد عزل فرع العصب الظنبوبي، مرر رابطة حريرية بمقاس 6-0 حوله ثم أحكم ربطها.

استخدم مقصات دقيقة لقطع العصب عند الطرف القريب من الرباط. مرر خيط الجراحة عبر العضلة المتسعة الوحشية واربطه على شكل عقدة. سيوفر هذا خيطاً يسهل من خلاله تحديد موقع الطرف المقطوع من العصب الظنبوبي.

عندما يتم استئصال العصب. لاحقاً، يتم إغلاق العضلة المتسعة الوحشية بغرز حريرية 6-0. بعد ذلك، يتم إغلاق العضلة ذات الرأسين الفخذية (biceps femoris) بغرز حريرية 6-0.

أخيرًا، أغلق الجلد باستخدام مشابك ميشيل للجروح. أوقف تدفق isof fluorine وأزل قمع الاستنشاق الأنفي. ضع الحيوان في قفص احتجاز على حاجز حراري.

أعِد الحيوان إلى قفصه. وبمجرد أن يصبح يقظاً ونشطاً، وبعد مرور سبعة إلى 10 أيام، يكون الجزء PN جاهزاً للاستئصال. لبدء عملية الزرع، ضع الحيوان المخدر على الحاجز الحراري.

بعد التأكد من تخدير الحيوان تخديرًا كاملاً، قم بإزالة مشابك الجرح وفصل شق الجلد. قد لا يكون حلاقة المنطقة مسبقاً أمراً ضرورياً حيث يجب أن ينفصل الجلد بسهولة مع تجنب التلوث. ومن خلال تجنب الحاجة إلى القطع عبر الفرو، قم بالقطع عبر غرز العضلة السطحية للكشف عن العضلة المتسعة الوحشية (vastus laterals) ثم اقطع عبر الغرزة الموجودة في هذه العضلة.

تتبع خط الغرز وصولاً إلى الطرف المقطوع من العصب الظنبوبي وقم بإزالة الغرزة من العصب. استخدم ملقطاً دقيقاً لتشريح غلاف العصب (epineurium) من طول 15 millimeter من العصب الظنبوبي ثم اقطع هذا الطرف القاصي. أزل قطعة العصب واغمرها في محلول هانك الملح المتوازن (hank's balanced salt solution) المعقم.

نحن الآن مستعدون للخطوة التالية، وهي إحداث إصابة في النخاع الشوكي تمهيداً لعملية الزرع؛ وقد يكون زرع الـ PN ذاتياً أو مغايراً. ضع الجرذ المخدر على الحاجز الحراري وقم بإعطاء المضادات الحيوية والمسكنات كما هو موضح في القسم السابق لإحداث إصابة بنصف قطع في النخاع الشوكي (HEMI section). أولاً، حدد موقع الثلمة القفوية والنتوء الفقري الظهري البارز في الفقرة الصدرية الثانية T two.

قم بإجراء شق بطول المسافة الكاملة بين هذه المعالم الخارجية. اقطع عبر الخط الناصف للعضلة شبه المنحرفة السطحية وافصل عضلات ardis العنقية الكامنة تحتها. أدخل مباعداً لإبقاء العضلات متباعدة.

يجب قطع العضلات فوق الشوكية العميقة من النتوءات الشوكية للفقرات العنقية الرابعة والخامسة والسادسة. وباستخدام مقصات R jurors، يتم إجراء استئصال جزئي للصفائح الفقرية في الفقرة العنقية الخامسة لكشف الجانب الأيمن بالكامل والجزء الإنسي من الجانب الأيسر للنخاع الشوكي. استخدم الوريد الظهري البارز كعلامة لتحديد الخط الناصف للنخاع الشوكي.

بعد ذلك، استخدم شفرة مشرط دقيقة لثقب الأم الجافية وتوسيع الشق فوق النخاع الشوكي في المستوى C five. قم بإجراء شق صغير في الحيز تحت العنكبوتية والأم العنكبوتية الكامنة أسفلها باستخدام كانيولا زجاجية دقيقة مسحوبة. ابدأ في شفط الجانب الظهري الأيمن من النخاع الشوكي باستخدام ضغط خفيف وملاقط دقيقة لفصل النسيج وتسهيل إزالته.

استمر في القطع عبر الأجزاء المتوسطة والبطنية من الحبل الشوكي لإنشاء تجويف بطول 2 mm يكون كاملاً من الجهة الظهرية إلى البطنية ومن الخط الناصف إلى السحايا الجانبية. ضع رغوة هلامية (gel foam) مشبعة بمحلول ملحي داخل تجويف الآفة في قسم HEMI. ولتحقيق الإرقاء، قم بإزالة قطعة العصب الطرفي التي تم حصادها مسبقاً من محلول Hank.

تحسس برفق غشاء العصب (epi) من الثلاثة مليمترات القريبة من قطعة العصب، ثم اجعل هذه النهاية مقابلة للجدار المنقاري (rostral wall) لفجوة الآفة في مقطع HEMI. قم بتثبيت القطعة باستخدام غرز من قياس 10-0 عبر غشاء العصب (epi uum) إلى الأم الجافية. بعد ذلك، قم بخياطة الأم الجافية لإغلاقها فوق الطرف المزروع من الطعم، مع وضع الطعم بين قطعتين من غشاء cel المرن.

ضع الطعم بجانب النتوءات الفقرية C6 وC7 وT1. لا تجعل الطرف العصبي القاصي ملامساً للنخاع الشوكي أو الأنسجة العضلية. أغلق العضلات على شكل طبقات باستخدام غرز 4-0، ثم أغلق شق الجلد باستخدام مشابك الجروح.

أخيرًا، ضع الحيوان في قفص احتجاز فوق حاجز حراري ثم أعِده إلى قفصه الأصلي. بمجرد أن يصبح الحيوان يقظًا ونشطًا، غالبًا ما تفشل المحاور العصبية المتجددة التي تصل إلى النهاية القاصية لطعم العصب الطرفي (PN graft) في الامتداد عائدة إلى الحبل الشوكي. لذا، نستخدم حقنًا دقيقة من chondroitin ACE لتحليل النسيج الندبي المحيط بمنطقة الإصابة.

يتم تنفيذ هذا الإجراء بعد 21 يوماً من زراعة العصب الوركي (PN)، ابدأ بالتأكد من تخدير الحيوان بشكل كامل. بعد ذلك، قم بإزالة مشابك الجرح وإعطاء المضادات الحيوية والمسكنات كما تم توضيحه سابقاً. استخدم ملقطاً دقيقاً ومقصاً نابضاً لقطع الغرز السطحية بهدف كشف الغشاء المرن المحيط بطعم العصب.

قم بتحرير طول العصب بعناية من الأغشية المرنة الخلوية. أبعد العصب عن المجال الجراحي. قم بإجراء استئصال جزئي للصفيحة الفقرية على الجانب الأيمن من النتوء الفقري C seven.

اثقب السحايا باستخدام شفرة مشرط دقيق، وبواسطة الشفط، قم بإعداد تجويف إصابة في الربع الظهري بمقاس 1 mm³ في النخاع الشوكي عند مستوى الفقرة C7. ضع إسفنج جيلاتيني مشبع بالمحلول الملحي داخل تجويف الإصابة لتحقيق الإرقاء. بعد ذلك، استبدل الإسفنج الجيلاتيني بآخر مشبع بـ chondroitin nace.

أ ب ج. قم بمعالجة موقع الإصابة لمدة 15 دقيقة، مع توفير رغوة هلامية مشبعة بـ chondroitin جديدة كل خمس دقائق. قم بتغطية الطول الخارجي للطعم العصبي بغشاء scholastic. أغلق العضلات السطحية بغرز 4-0 وشق الجلد بمشابك الجروح.

ضع الحيوان في قفص احتجاز على حاجز حراري، وأعيده إلى قفصه الأصلي بمجرد أن يصبح يقظاً ونشطاً. بعد يومين، أي بعد 23 يوماً من زراعة الـ PN، تُجرى جراحة أخرى للحيوان لحقن chondroitin NA مجهرياً في الحبل الشوكي. وكما سبق، يتم إزالة مشابك الجرح من الحيوان المخدر مع إعطائه المضادات الحيوية والمسكنات.

اقطع الغرز السطحية للكشف عن الغشاء المرن المحيط بطعم العصب. اكشف عن موقع طعم الفقرة العنقية السابعة C seven دون المساس بالطعم. ثم استخدم حقنة Hamilton ذات كانيولا زجاجية مسحوبة لحقن ميكروي لكمية 1 µL من chondroitin ace A BC في الجانب الأيمن من النخاع الشوكي، على بُعد 1 mm تقريباً من الطرف القاصي لنقطة التقاء الطعم بالنخاع الشوكي.

قم بتقشير غمد العصب (EUR) برفق من الميليمترين الطرفيين لقطعة العصب، ثم قم بمطابقة هذه النهاية مع تجويف الإصابة في الفقرة العنقية السابعة (C7). ثبّت القطعة باستخدام غرز جراحية من مقاس 10-0 عبر غمد العصب (epineurium) إلى الأم الجافية (dura mater). أغلق العضلات السطحية بغرز جراحية من مقاس 4-0، وأغلق شق الجلد باستخدام مشابك الجروح.

ضع الحيوان في قفص احتجاز على حاجز حراري، ثم أعيده إلى قفصه الأصلي بمجرد أن يصبح يقظاً ونشطاً. وعند تحسين هذا الإجراء، سيتكامل جزء العصب الطرفي بشكل وثيق مع النخاع الشوكي للمضيف لتصوير المحاور الشوكية التي تتجدد داخل الطعم. لقد قمنا بملء الطعم عن طريق الانتشار باستخدام biotinylated dextrin amine أو BDA صعوداً وهبوطاً.

ستدخل المحاور العصبية الشوكية عموماً إلى الطُعم وتنمو في خط مستقيم نسبياً موازٍ لطول الطُعم، وتمتد إلى الطرف القاصي للطُعم بمعدل يبلغ حوالي 1 mm في اليوم. بينما ستخترق المحاور العصبية الطرفية النخاع الشوكي المجاور. وإذا تم استخدام chondroitin NACE لإزالة البروتيوغليكانات المثبطة من نسيج الندبة المحيط، فعند الوصول إلى الطرف القاصي، يمتد عدد قليل جداً من المحاور العصبية الطرفية إلى أنسجة المضيف بعد العلاج مقارنةً بتلك التي عولجت بالمادة الناقلة.

ومع ذلك، إذا عولجت الواجهة القاصية بالكندرويتين، فإن عددًا أكبر بكثير من المحاور العصبية يخرج من الطعم لإعادة تعصيب الحبل الشوكي. وكما هو موضح هنا في هذا المقطع التمثيلي الواحد من بين 15 إلى 20 مقطعًا لكل حيوان لوحظ فيها نمو المحاور العصبية، يظهر هذا الرسم البياني العمودي زيادة ملحوظة في نمو المحاور العصبية بعد العلاج بـ conjoin nace A BC. ويمكن استخدام الكشف الكيميائي المناعي عن العلامات المشبكية على عصبونات الحبل الشوكي استجابةً للتحفيز الكهربائي للمحاور العصبية داخل الطعم لتقييم الاتصال الوظيفي بين الطعم المزروع والحبل الشوكي للمضيف.

تم صبغ هذه المنطقة من النخاع الشوكي التي تحتوي على موقع الالتصاق القاصي مناعياً خلوياً لكل من dextrin amine المبيوتين كل منهما باللون الأخضر، والعلامة المشبكية synapsin باللون الأحمر؛ وتشير رؤوس السهام إلى المناطق التي حدث فيها تموضع مشترك للعلامات، مما يشير إلى أن بعض الألياف التي تجددت من الطعم قد شكلت اتصالات مشبكية وظيفية. كما تم إثبات الاتصال الوظيفي بين الطعم وعصبونات النخاع الشوكي من خلال مقايسة تعبير CFOs. فبعد التحفيز المشبكي لعصبونات المضيف فيما وراء الواجهة القاصية، يمكن التعرف على علامة التنشيط عبر المشبكي هذه من خلال العديد من العصبونات الموجبة لـ CFOs في الأنسجة الموجودة في نفس جانب موقع الطعم، وعند التكبير العالي، يمكن ملاحظة عدد قليل جداً من العصبونات الموجبة لـ CFOs في الأنسجة الموجودة في الجانب المقابل للطعم.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير موقع إصابة الحبل الشوكي استعداداً لزراعة طعم عصب طرفي لتعزيز التجدد بعد إصابة الحبل الشوكي. عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر توفير طول عصبي كافٍ قبل عملية الزرع، وضمان التقارب الشديد بين الطعم وموقع إصابة الحبل الشوكي. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.