مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

لقد تم دمج بروتوكول التهجين الموضعي المتألق في نوى الحيوانات المنوية البشرية على نطاق واسع في مجال التشخيص السريري. وأحد تطبيقات هذه المنهجية هو فحص تعدد الصيغ الصبغية في الحيوانات المنوية. وكجزء من المشورة الإنجابية المقدمة للذكور الذين يعانون من العقم، فإن وجود تشوهات عددية يكون أعلى لدى هؤلاء الأفراد مقارنة بعامة السكان، وغالبًا ما تظهر لديهم معايير سائل منوي غير طبيعية.

يمثل هذا زيادة في خطر نقل هذه الشذوذات إلى أي نسل. سنقوم اليوم بتوضيح بروتوكول التهجين الموضعي المتألق (fluorescence in situ hybridization) في نوى الحيوانات المنوية منزوعة التكثيف لتحليل الكروموسومات 13 و18 و21 وx وY. بمجرد جمع العينة، يجب تركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة حتى تحدث عملية الإسالة. لبدء البروتوكول، يجب نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي.

المحاليل التي سنستخدمها في الجزء الأول من التجربة هي محاليل عالية التوتر مُسخنة مسبقاً عند 37 °C، ومزيج من الميثانول وحمض الأسيتيك بنسبة ثلاثة إلى واحد. يجب تحضير هذه المحاليل حديثاً. بعد ذلك، تصبح العينة جاهزة للطرد المركزي عند 1000 ×g لمدة خمس دقائق.

الآن، قم بإزالة الطافي برفق وأضف المحلول عالي التوتر قطرة تلو الأخرى حتى يصل الحجم إلى حوالي 10 milliliters. يجب أن يبقى هذا الأنبوب عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة، ثم يتم طرد العينة مركزياً مرة أخرى. يؤدي الطرد المركزي إلى تجمع الحيوانات المنوية في قاع الأنبوب، مما يسمح لنا باستبدال المحلول منخفض التوتر بالميثانول.

يجب تكرار عملية الطرد المركزي بحمض الأسيتيك لتغيير الميثانول وحمض الأسيتيك بالعدد اللازم من المرات حتى يتم الحصول على راسب أبيض. وعند حدوث ذلك، يجب إضافة المزيد من الميثانول وحمض الأسيتيك. كما ينبغي ضبط الحجم النهائي وفقاً للتشتت الخلوي الذي ترغب في الحصول عليه في التوسعات اللاحقة.

تتمثل الخطوة النهائية في إعداد المسحات عن طريق إسقاط العينة المثبتة على شرائح Reed المحفوظة في الميثانول عند درجة حرارة -20 °C. ومن المفيد تحديد المنطقة التي تحتوي على مسحة الحيوانات المنوية على الشريحة لغرض إعادة تحديد المواقع مستقبلاً، ويمكن القيام بذلك بسهولة باستخدام قلم ألماس على الجانب الآخر من الشريحة. وبمجرد التحقق من التشتت الخلوي الأمثل، يجب تخزين الشرائح عند درجة حرارة -20 °C لمدة لا تقل عن 24 ساعة.

قبل المتابعة في البروتوكول. في هذا الجزء من التجربة، سنستخدم محلول سترات الصوديوم الملحي وسلسلة من الإيثانول وDRE fatal وfide. بمجرد إذابة الشرائح من التجميد، يجب غسل العينات المثبتة وإزالة الماء منها عن طريق غمرها في وعائين متتاليين من كوبلان يحتويان على 2× SSC.

تستغرق هذه العملية ثلاث دقائق لكل وعاء كوبلان. بعد ذلك، يجب غمر الشرائح لمدة دقيقتين في كل وعاء من أوعية كوبلان المحتوية على الإيثانول، وذلك بترتيب التركيزات التصاعدي. وفي هذه المرحلة، ومن أجل المتابعة في المراحل التالية، يجب تجفيف الشرائح.

نظراً لأن الحمض النووي DNA في نواة الحيوان المنوي يكون مكثفاً للغاية، فمن الضروري فك تكثيف الكروماتين قبل عملية مسخ الحمض النووي. يمكن القيام بذلك باستخدام محلول DTT عند درجة حرارة 37 °C. يعمل هذا المنتج عن طريق تكسير الجسور الكبريتية للبروتامين التي تقوم بلف DNA في نواة الحيوانات المنوية. يجب ضبط وقت تحضين الشريحة في محلول DTT وفقاً لمدى استجابة عينة السائل المنوي لهذا المنتج.

عادةً ما تستغرق هذه العملية حوالي ثماني دقائق، على الرغم من أنها قد تتفاوت من دقيقتين إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، يجب نقل الشرائح فوراً إلى محلول 2×SSC لمدة ثلاث دقائق، ثم مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق إضافية، يليه غمرها لمدة دقيقتين في كل جرة من جرار Coplan التي تحتوي على الإيثانول. وبالنسبة لتهجين المسبار، من الضروري العمل باستخدام سلاسل DNA مفردة؛ وهذا يتطلب مرحلة تمسخ قبل إضافة المسابير، تتضمن فترة تحضين لمدة خمس دقائق في محلول Formamide عند درجة حرارة 73 °C. ولختام معالجة الشرائح، يلزم إجراء نقل نهائي إلى محلول الإيثانول عن طريق غمر الشرائح لمدة دقيقة واحدة في كل جرة Coplan.

تصبح الشرائح بعد ذلك جاهزة لعملية التهجين في دراسات التهجين الموضعي المتألق (FISH) التي تُجرى للتشخيص السريري. وتشمل الكروموسومات الأكثر تحليلاً الكروموسومات الجنسية والكروموسومات 13 و18 و21. ولتحليل هذه الكروموسومات، سنستخدم طقم مسابير DNA متعدد الألوان من شركة Vysis.

يحتوي هذا على أنبوب واحد به مزيج من المسابر لمنطقة القمر الصناعي ألفا (alpha satellite) في الكروموسومات X وY و18، والموسومة باللونين الأخضر والأكوا على التوالي، وأنبوب آخر به مزيج من المسابر للكروموسومات 13 و21 الموسومة باللونين الأخضر والبرتقالي على التوالي. يختلف حجم مزيج المسابر المضاف وفقًا لمساحة المنطقة المراد تهجينها؛ فكـمرجع لشريحة غطاء بمقاس 15 في 15، يكون حجم 5 µL كافيًا.

يتم إجراء عملية مسخ مسبق لكل من خليطي المسبار في محلول منظم للتهجين لسهولة الاستخدام، بحيث يمكنك إضافتهما مباشرة إلى الشرائح المكثفة والمسوخة. تتوفر أيضاً مسابير تجارية أخرى لمجموعة واسعة من الكروموسومات ومواقع Loki والتي يمكن استخدامها في هذه التجارب. ومع ذلك، تتطلب هذه المسابير عادةً معالجة مسخ مسبق قبل إضافة الخليط إلى العينة المستهدفة.

في هذه الحالات، يكفي اتباع تعليمات الشركة المصنعة. يجب تغطية المنطقة المستهدفة بشريحة غطاء وإحكام إغلاقها باستخدام الأسمنت المطاطي. بعد ذلك، تصبح الشرائح جاهزة لوضعها في غرفة التهجين، التي يتم تسخينها مسبقاً إلى 37 °C، وتحضينها عند درجة الحرارة هذه لمدة تتراوح من ست إلى 24 ساعة.

في الجزء الأخير من البروتوكول، سنستخدم هذين المحلولين الغاسلين المكونين من تركيزات مختلفة من محلول سترات الصوديوم الملحي والمنظف NP 40. وبعد انتهاء وقت الحضن، يمكن إخراج الشرائح من غرفة التهجين لإزالة الغراء المطاطي. ثم يتم نزع الشريحة الغطاء بعناية.

كما هو موضح، يتم غمر الشرائح لمدة دقيقتين في محلول الغسيل الأول، المسخن مسبقاً إلى 73 °C. ثم تُنقل إلى محلول الغسيل الثاني في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة إضافية. ستساعدنا هاتان الغسلتان في التخلص من أي إشارات تهجين غير نوعية. بعد هاتين الغسلتين، يجب الانتظار حتى تجف الشرائح لإتمام الخطوة الأخيرة من البروتوكول.

في هذه المرحلة، يتم إضافة منتج صبغ تبايني لتسهيل رؤية نواة الخلايا. ومن أكثر المنتجات شيوعاً المستخدمة لهذا الغرض هو dpi. كما يجب ضبط الحجم المضاف وفقاً لمساحة التهجين، وذلك بالاستناد إلى شريحة غطاء بمقاس 18 في 18.

يكفي استخدام حجم قدره 8 µL من DPI. يمكن إغلاق شريحة التغطية بإحكام باستخدام طلاء الأظافر، وبذلك تصبح التحضيرات جاهزة للفحص المجهري. وخلاف ذلك، يمكن تخزينها عند درجة حرارة 20- °C لحين تحليلها لاحقاً.

المجهر الذي سنستخدمه للتصور هو مجهر Olympus BX 60 epi fluorescent المجهز بمرشح ثلاثي النطاق لـ dpi وTexas Red وFITC، ومرشحات أحادية النطاق لـ aqua وFITC وTexas Red. من خلال المرشح ثلاثي النطاق، تظهر العينة التي تمت تهجينها مع x وY و18 إشارات لهذه الكروموسومات الثلاثة. وباستخدام المرشح أحادي النطاق لـ aqua، يمكننا فقط رؤية الإشارات الفلورية للكروموسوم 18. ومن المتوقع وجود إحدى هذه الإشارات في كل حيوان منوي طبيعي.

ومع ذلك، عند استخدام مرشح النطاق الواحد لـ FITC فقط، تظهر بعض الحيوانات المنوية إشارة خضراء فلورية تقابل الكروموسوم X. أما الحيوانات المنوية التي تفتقر إلى الإشارة الخضراء فيجب أن تظهر إشارة حمراء للكروموسوم Y، والتي يمكن تصورها تحديداً من خلال مرشح Texas red. ومن خلال تصور تهجين 1321 عبر مرشح النطاق الثلاثي، يمكننا تمييز الإشارات الخاصة بهذين الكروموسومين.

تتوافق الإشارة الخضراء مع الكروموسوم 13 ويمكن تصورها بشكل محدد باستخدام مرشح النطاق الواحد لـ FITC. أما مرشح النطاق الواحد لـ Texas Red فيسمح لنا بتصور الإشارات الخاصة بالكروموسوم 21 بشكل محدد. يجب أن تظهر جميع الحيوانات المنوية الطبيعية إشارة واحدة لكل مسبار من هذين المسبارين.

وختاماً، إليكم المراحل الرئيسية للبروتوكول. نؤكد مجدداً على ضرورة تنفيذ عملية التثبيت بدقة للحصول على امتدادات عالية الجودة من خلال إضافة حمض الخليك الميثودولي قطرة بقطرة. ولتجنب تكون تجمعات حيوانية منوية خلال عملية إزالة التكثيف، يجب ضبط وقت الحضانة في محلول DTT وفقاً لمدى تفاعلية عينة السائل المنوي مع هذا المنتج.

سيؤدي التعرض المفرط للحيوانات المنوية لـ DTT إلى تشتت الإشارات في نهاية البروتوكول، بينما سيؤدي التعرض غير الكافي إلى عدم تهجين المسبار وغياب بعض الإشارات. وبينما يعد تمسخ عينة الحيوانات المنوية أمراً إلزامياً، يجب مواءمة تمسخ المسبار وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة. ومن المهم الحفاظ على تحكم صارم في وقت ودرجة حرارة غسلتَي ما بعد التهجين.

يمكن أن تؤدي درجة الحرارة المرتفعة أو زيادة وقت الغسل إلى إزالة بعض الإشارات، بينما لن يؤدي العكس إلى إزالة الإشارات غير النوعية. وأخيرًا، يعد استخدام مجهر فلوري انعكاسي مجهز بمرشحات نوعية مناسبة أمرًا ضروريًا لتحقيق تصور جيد وتفسير دقيق للإشارات. وهذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.