Name: العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: تعلم عزل خلايا الفأر الجنينية البدائية من الغدد التناسلية النامية عند 10.5-11.5 يومًا بعد التلقيح. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تطور الخلايا الجرثومية والخصوبة والسرطان.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أن نعترف مساعدة لا تقدر بثمن من : الدكتور نيل الأولى ويلكنسون Kourtney للتحرير المخطوط ، والدكتورة لوسي سنتر ، والدكتور Willeford بريجيت ومايك Basett للمساعدة في تدريب ورعاية الحيوان في جامعة ولاية ميشيغان مرفق ALAC الماوس المعتمدة ، والدكتور دواين وايز للحصول على المساعدة مع المجهري والتقاط الصور ؛ سيزار مونروي ، Swoope هانا ، وبوبي هدلستون لمساعدتها في إنتاج الفيديو في جامعة ولاية ميشيغان. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب البحوث المؤسسية وإدارة العلوم البيولوجية في جامعة ولاية ميسيسيبي.

الجزء 1 : الحوامل البطن ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلع به عنق الرحم ، والموت ببطء ماوس C57BL6J الإناث الحوامل في DPC 10،5-11،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف البطن مع الصابون المضادة للميكروبات ، ثم حلقها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحلاقة ، وغسل البطن بمحلول ملحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم جافة والبطن مع شاش معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الفأر مع حقل معقمة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق بطني باستخدام ملقط ومقص تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد وإزالة الرحم بأكمله من تجويف البطن. وسوف تكون مرئية أجنة الفئران داخل الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم في طبق بتري مليئة مد برنامج تلفزيوني ، وابقائه على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط معقم وملقط ، إزالة المشيمة والأنسجة الجنينية اضافية لكل جنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في طبق بتري جديدة مليئة D - PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس طول أجنة الفئران. وجدنا أن أحجام تختلف تبعا لعمر الجنين. قياس 10.5 DPC على سبيل المثال 8.5 DPC يقاس بمتوسط ​​6mm ، بمتوسط ​​11mm ، و 12.5 DPC يقاس بمعدل 16 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم ، إزالة ذيولها لاستخراج الحمض النووي. </li></ol> الجزء 2 : الغدد التناسلية تشريح ريدج وبموجب stereomicroscope مصدر الضوء Fostec شوت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة تصفية في طبق بتري. ثم وضع الجنين الماوس على أعلى ورقة الترشيح لتجفيف الجنين وشل للتشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط معقم ، وجعل قطع عرضية من جنين فأر فوق المنشأ من الحبل السري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope ، وذلك باستخدام ملقط معقم وغرامة إبرة معقمة إغاظة غرامة ، وإزالة الأمعاء والكبد بحيث الجهاز البولي مرئيا. تقع الكلى أفقيا في تجويف البطن ، ويقع في المثانة الإنسي والذيلية بالمقارنة مع الكليتين. يمكن التعرف على الجنين ذكرا لأن تقع الغدد التناسلية التلال على جانبي المثانة. في الأنثى ، وترد بحزم التلال الغدد التناسلية لانهاء الوحشي الذيلية الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر خارج التلال الغدد التناسلية عن طريق تحريك إبرة وراء ذلك. تتم إزالة الحرف الغدد التناسلية عن طريق خفض بعيدا الأنسجة التي تعتمد عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التلال الغدد التناسلية إلى طبق بتري جديدة مليئة الطازجة D - PBS. المجهر ، يجب أن يكون الحرف الذكور الغدد التناسلية جردت ، كبيرها وبيضاوية الشكل. في المقابل ، ينبغي أن رصدوا الحرف الإناث الغدد التناسلية ، وقد شكل طولي وتكون أصغر بالمقارنة مع الحرف والغدد التناسلية للذكور. </li></ol> الجزء 3 : الغدد التناسلية الهضم ريدج تحت stereomicroscope : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mesonephros تشريح : فصل الغدد التناسلية من mesonephros والحرف باستخدام إبرة رفيعة وحادة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن المهم لإزالة mesonephros من التلال الغدد التناسلية لأنه هو نسيج الجسدية التي سوف اكتسى في عملية الاشتقاق PGC. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغدد التناسلية الهضم ريدج : جمع التلال الغدد التناسلية النظيفة في انخفاض 0.5ul العذبة D - PBS. إضافة 20 مل من كولاجيناز / Dispase محلول (تركيز النهائي في 1mg/ml). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي معالجة الأجنة بشكل فردي. وينبغي أن يكون لكل جنين الخاصة طبق بيتري منفصل وصفت. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغدد التناسلية ريدج الثرم : قص الحرف الغدد التناسلية الى قطع صغيرة باستخدام إبرة معقمة وملقط معقم غرامة رقم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحضانة : أن يتم نقل أطباق بتري لحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن فترة حضانة تتراوح بين الأنسجة. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipetting : بعد 15 دقيقة ، والأنسجة يمكن فصلها عن طريق pipetting. باستخدام ماصات زجاجية سحبت الشعرية بأقطار بين 40 ملم -100 تفكك القطع التي pipetting صعودا وهبوطا. وهذا شكل كتل صغيرة. نقل كتل 0.5ml لهبوط قبل D - PBS استعد لغسل النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل ، نقل كتل لأنابيب إيبندورف. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تعرض على الأنسجة لكولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تجعل تعليق خلية واحدة. هذا هو المهم لتكوين مستعمرة. إذا كان تعليق خلية واحدة ، PGCs تميل إلى التفريق والهجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن لا تكون هذه العملية وقتا أطول من 20 دقيقة ، أو خلايا الخاص بك وسوف تفقد قدرتها على البقاء. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، وإزالة طاف ، وresuspend الكرية في 0.5 مل من يطرق تستكمل بها وسائل الاعلام (ما قبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية). </li></ol> الجزء 4 : البدائي الثقافة خلايا بيرشوت "يجب تنفيذ الخطوات التالية بسرعة للحفاظ على استمرارية PGCs عن العزلة والاشتقاق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل 24 ساعة من هذه العملية يجب أن تعد المعطل mitotically MEF - CF1 تغذية الطبقة التالية من البروتوكول تشانغ جي وآخرون 2008. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق لمدة 20 pregnaNT الإناث الماوس (6-8 أجنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEFs يفقد القدرة على أن تكون طبقة وحدة التغذية (تعزيز النمو ومنع التمييز) بعد 5-6 الممرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تستخدم MEFs مضى عليها أكثر من 48 ساعة. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة قبل PGCs الطلاء ، لا بد من إزالة ببطء MEF المتوسطة من الطبقة المغذية MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم ، يضاف 0.5 مل / جيدا قبل حرارة متوسطة استكمال خروج المغلوب على طبقة MEF المغذية. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEF الوسائط تحتوي مصل بقري جنيني الذي يؤدي الى التفريق بين PGCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجب أن يكمل المتوسطة خروج المغلوب مع عوامل النمو مسكوكة المحددة على الفور قبل استخدامه للتأكد من نشاط عامل النمو. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام توزيع متناظرة ، PGCs وحة فوق طبقة MEF المغذية. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت هذه القطع هي قريبة جدا ، فإنها تميل إلى تجميع وجعل المستعمرات الكثيفة التي تربط سيئة أو تبدأ التفرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يكون المسمى الأطباق الثقافة مع الخلية الجنينية بيرشوت اسم الخط ، ورقم المرور ، والتاريخ. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية ، ونقل الأطباق الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد خلايا كل 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة ، وإزالة 250 مل من وسائل الإعلام من أعلى جدا من الثقافة لتجنب القلق تعلق المستعمرة. ثم ، يضاف 250 مل من جديد وسائل الاعلام خروج المغلوب تستكمل (ما قبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة 7 ، انتظر 48 ساعة أخرى ، ثم إزالة جميع وسائل الإعلام واستبدالها جديدة تستكمل وسائل الاعلام خروج المغلوب (ما قبل حرارة عند درجة 37). تفعل ذلك كل يوم لمدة 8-10 2 أيام حتى شكل مستعمرات PGC. </li></ol> الجزء 5 : خلايا الجنينية بيرشوت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 يوما من العزلة PGC ، تتشكل الخلية الجنينية المستعمرات جرثومي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبقى الخلية الجنينية جرثومي على قيد الحياة عن طريق الممرات دليل كل يوم 8-10. استمروا في تقديم التشكل غير متمايزة والتعبير عن علامات تعدد القدرات مثل الفوسفاتيز alkalyne أكتوبر - 4 ، SSEA - 1 ، وSOX 2 </li></ol> تلاحظ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ظروف معقمة / العقيم ضرورية في غرفة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاشتقاق والثقافة ، وتتم معالجتها في مجلس الوزراء PGCs منقيات الفئة الثانية السلامة الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حضانات هي في ترطيب 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تصفية جميع وسائل الإعلام والكواشف قبل استخدامها في تصفية 0،2 ميكرون ، وتخزينها في 4 درجات مئوية ، وقبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء تشريح الخطوات ، يجب أن تظل جميع الأجنة والأنسجة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تطهير جميع القوارير كاشف مع الايثانول قبل وضعه في خزانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعمال القفازات ، معطف المختبر ، وقبعات ممرضة إلزامية. </li></ul> استنتاج لقد قدمنا ​​الفيديو الذي يظهر لك كيفية عزل واستخلاص ، والثقافة الخلايا الجنينية من التلال جرثومي الغدد التناسلية من 10،5-11،5 DPC أجنة الفئران. عزلة استنساخه وطويلة الأجل للثقافة خطوط الخلايا الجنينية جرثومي يوفر أساسا حاسما لدراسة التطور الجنيني المبكر ، وأنماط وراثية وجينية جرثومي ، وتشكيل الغدد التناسلية ، والآثار البيئية الناجمة عن الأجهزة المحيطة بها خلال العملية التنموية من تكون الأعراس في أجنة من الذكور والإناث ، وتحديد المسارات التي تؤدي إلى الإصابة بالسرطان والعقم. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

وقد أجري هذا البحث بعد استعراض والمؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC) الموافقة على بروتوكول لدينا الماوس # 08030 (دور أنواع الأكسجين التفاعلية ، ريوس في تطوير خط الجرثومية وتكوين الورم : القابضة وتربية البروتوكول) في جامعة ولاية ميسيسيبي.

ملقط رقم 14 و 15 و 35 مم مشرط ، مقص تشريح والحقول الجراحية والصابون المضادة للميكروبات ، المحلول الملحي 0.9 ٪ والشاش ، والجليد حاوية الرغوة ، شفرة الحلاقة ، مشرط 35 ملم ، ملقط غرامة رقم 4 و 5 ، مع غرامة إبرة إغاظة التعامل معها ، وتصفية ورقة ورقة ، وسحبت ماصات زجاجية.<br /<br /&gt; المعدات : stereomicroscope تشريح ، وعلى ضوء مصدر شوت Fostec ، مجهر مقلوب ، micropipette 10 و 200ul ، الطرد المركزي ، والبيولوجية مجلس الوزراء السلامة.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

قدرة الخلايا الجنينية جرثومي (مصر) على التمايز إلى خلايا بدائية جرثومي (PGCs) ولاحقا في الأمشاج خلال مراحل النمو المبكرة هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في آخر أيام 10،5-11،5 الأجنة coitum الماوس (DPC). النامية التلال الغدد التناسلية من أجنة الفئران (C57BL6J) تم فصلها عن اضطراب الميكانيكية مع كولاجيناز ، ثم في مطلي بطبقة جنين الفأر تغذية الخلايا الليفية (MEF - CF1) الذي كان سابقا مع المعطل mitotically C mitomycin في حضور وسائل الإعلام وتستكمل مع خروج المغلوب المانع اللوكيميا عامل (LIF) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، والخلية الجذعية عامل (SCF). باستخدام هذه الأساليب الأمثل لتحديد PCG ، والعزلة ، وتهيئة الظروف ثقافة تصاريح الثقافات على المدى الطويل من الخلايا المصري لأكثر من 40 يوما. وأظهرت خطوط الخلايا الجنينية جرثومي النمط الظاهري الجنينية والتعبير عن علامات مشتركة تستخدم الدولة المحفزة. العزلة واشتقاق خلايا جرثومي في الثقافة توفير أداة لفهم تنميتها في المختبر ، وتتيح الفرصة لرصد الأضرار المتراكمة على المستويات الجينية واللاجينية بعد التعرض لالاكسدة.

قدرة الخلايا الجنينية جرثومي على التمايز إلى خلايا جرثومي البدائية خلال مراحل النمو المبكر هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في الأجنة 10،5-11،5 أيام آخر coitum الماوس.

إن قدرة الخلايا الجرثومية الجنينية (EG) على التمايز إلى خلايا جرثومية بدائية (PGCs)، ثم لاحقاً إلى أمشاج خلال مراحل النمو المبكرة...

أهلاً بكم، اسمي هار مورينو من مختبر الوراثيات التناسلية والخلايا الجذعية في جامعة ولاية ميسيسيبي. وأنا كلارا سانت، أيضاً من مختبر الوراثيات التناسلية والخلايا الجذعية في جامعة ولاية ميسيسيبي. تُعد الخلايا الجرثومية الأولية أو PGC هي الخلايا السلفية للحيوانات المنوية والبويضات في الخصية والمبيض على التوالي.في أجنة الفئران، تهاجر الخلايا الجرثومية الأولية (PGC) من المعى الخلفي وعبر العرف التناسلي في الفترة من 8.5 إلى 9.5 يوم. وتصل الخلايا الجرثومية الأولية اللاحقة إلى العرف التناسلي في الفترة من 10.5 إلى 11.5 يوم.تنتقل الخلايا الجرثومية الأولية (PGCs) وتبدأ في تشكيل القناة التناسلية في الأنثى. تهاجر هذه الخلايا إلى الطرف الجانبي للكلية لتبدأ في تكوين القناة التناسلية الأنثوية. وفي المقابل، تهاجر الخلايا الجرثومية الأولية في الذكر إلى كلا جانبي المثانة.للبدء في التشكيل. تُعد الخلايا الجرثومية للذكور في خط Alridge نموذجاً بحثياً ممتازاً لدراسة مسارات التطور الخلوي في ظل وجود الإجهاد التأكسدي كسبب للعقم والسرطان. لذا، فلنبدأ.سنوضح لكم اليوم كيفية جمع وعزل الخلايا الجذعية الأولية (PV Cs) من الأعراف التناسلية النامية في أجنة الفئران في المرحلة ما بين 10.5 إلى 11.5 يوماً بعد الإخصاب. يتم تفكيك الأعراف التناسلية لأجنة الفئران عن طريق التدمير الميكانيكي لزراعتها على طبقة من أرومات ليفية جنينية للفئران. وبعد 10 أيام من الزراعة في ظل ظروف مُحسّنة، ستظهر المستعمرات الجرثومية الجنينية أنماطاً ظاهرية جنينية. كما يمكن التعرف عليها بعد عدة ممرات من الزراعة من خلال تعبيرها عن علامات تعدد القدرات.المواد التالية مطلوبة لهذه الخطوة المتعلقة بالتشريح العقيم: حزمة تحتوي على حقول معقمة، وملاقط، ومقصات، وشفرات حلاقة، وصابون مضاد للميكروبات، ومحاليل ملحية، وأطباق بتري مملوءة بـ PBS Pep على الثلج، وشاش. يتم القتل الرحيم لأنثى فأر C57BL/6 حاملة في اليوم 10.5 إلى 11 من الحمل عن طريق خلع الفقرات العنقية. يتم تنظيف البطن بالصابون المضاد للميكروبات، ثم يتم حلاقته بعد ذلك.اغسل منطقة البطن باستخدام المحاليل الملحية. جففها باستخدام شاش معقم. قم بتغطية الفأر بحقل تعقيم جديد.قم بإجراء شق بطني باستخدام الملاقط ومقصات التشريح. حدد الرحم وقم بإزالته بالكامل من التجويف البطني. ستكون الأجنة مرئية داخل الرحم.بحرص شديد. قم بالقطع عبر الأربطة التي لا تزال متصلة بقرن الرحم. أكمل عملية التشريح بإجراء قطع مستعرض على طول المهبل.انقل الرحم إلى طبق بتري محكم الإغلاق يحتوي على GPVS واحفظه في الثلج. افصل الأنسجة خارج الجنينية عن الأجنة الموجودة في الفتحة، باستخدام مشرط وملقط معقمين.انقل أجنة الفم إلى طبق بتري جديد مملوء بـ DPBS. قم بقياس طول جنين الفم. وقد وجدنا أن الأحجام تختلف باختلاف عمر الجنين.على سبيل المثال، بلغ متوسط القياس 6 ملم بعد 8.5 أيام من التلقيح، و11 ملم بعد 10.5 أيام من التلقيح، و16 ملم بعد 12.5 يوماً من التلقيح. يتم إزالة الذيول لإجراء استخلاص الـ DNA. المواد التالية مطلوبة لعملية التشريح: مجهر ستيريو، وكبينة سلامة بيولوجية، وPDS، ومشرط معقم.ملقط دقيق معقم، وإبرة تشريح دقيقة معقمة بمقبض، وأطباق بتري، وورق ترشيح. ضع ورقة ترشيح في طبق بتري، ثم ضع جنين الفم فوق ورقة الترشيح لتجفيف الجنين وتثبيته من أجل التشريح. باستخدام مشرط معقم، قم بإجراء قطع مستعرض لجنين الفم فوق منشأ الحبل السري تحت مجهر ستيريو.باستخدام ملاقط دقيقة معقمة وإبرة تشريح دقيقة معقمة، قم بإزالة الأمعاء والكبد حتى يصبح الجهاز البولي مرئيًا. تقع المثانة في المستوى الإنسي.يمكن تحديد الجنين على أنه ذكر لأن الجسور التناسلية تقع على جانبي المثانة. باستخدام ملقط دقيق معقم وإبرة دقيقة معقمة، قم بإزالة العرف التناسلي الذكري الأيمن عن طريق قطع الأنسجة الداعمة له. اتبع الإجراء نفسه لإزالة العرف التناسلي الذكري الأيسر.انقل كلتا الحافة التناسلية الذكرية مجهرياً إلى طبق بتري صغير يحتوي على محلول DPDS طازج. يمكنك رؤية الحافة الغدية الذكرية متصلة بـ miso ne brace. يجب أن تظهر الحواف الغدية الذكرية بشكل بيضاوي وكبير الحجم تحت المجهر الاستريو.قم بإزالة الأمعاء باستخدام ملقط دقيق معقم وإبرة تشريح دقيقة معقمة. تقع الكليتان جانبيًا في التجويف البطني، بينما تقع المثانة في موقع أكثر إنسية وذيليًا مقارنة بالكلية. يختلف العرف التناسلي في الأنثى عن العرف التناسلي في الذكر من حيث المورفولوجيا والموقع التشريحي.تكون الحواف التناسلية الأنثوية مرتبطة بإحكام بالطرف الجانبي الذيلي للكلية. باستخدام ملقط دقيق معقم وإبرة دقيقة معقمة، قم بإزالة الحافة التناسلية الأنثوية اليسرى عن طريق قطع الأنسجة التي تربطها بالكلية.كرر الإجراء نفسه لإزالة العرف الغدّي الأنثوي الأيمن. انقل كلا العرفين التناسليين الأنثويين مجهرياً إلى طبق بتري صغير يحتوي على PDS طازج. يمكنك رؤية العرف الغدّي الذكري وهو متصل بـ Neso Nera.يجب ملاحظة أن القمم التناسلية للإناث تكون ذات شكل مستطيل وأصغر حجماً مقارنة بالقمم التناسلية للذكور، وذلك باستخدام إبر معقمة ودقيقة وحادة. افصل القمم التناسلية الأنثوية عن النسيج المتوسط والأنسجة الجسدية الأخرى باستخدام إبر معقمة ودقيقة وحادة. افصل القمم التناسلية الذكرية عن النسيج المتوسط والأنسجة الجسدية الأخرى.من المهم إزالة الـ meso Neros من الـ ne Natal ridge لأنها أنسجة جسدية ستنمو بشكل مفرط خلال عملية اشتقاق الـ PGC. قم بجمع الـ gona ridge في قطرة بحجم 0.5 µL من محلول DPVS الطازج مع محاليل collagenase distaste. وتحت المجهر المجسم، يتم تقطيع أنسجة الغدد التناسلية إلى قطع صغيرة باستخدام إبر معقمة دقيقة وحادة.تُنقل أطباق بتري إلى حضانة عند 37 درجة Celsius لمدة 15 دقيقة. بعد مرور 15 دقيقة، يمكن تفكيك الأنسجة عن طريق السحب والضخ باستخدام ماصات شعرية زجاجية مسحوبة ذات أقطار مختلفة تتراوح بين 40 و100 ميكرون. يتم تفتيت القطع عن طريق عملية السحب والضخ المتكرر.سيؤدي ذلك إلى تكوين تكتلات صغيرة. تُغسل هذه التكتلات الصغيرة في 0.5 µL من DPDX بعد عملية الغسل. ثم تُنقل هذه التكتلات إلى مكعبات Eend بسرعة 2000 RPM لمدة خمس دقائق.عند درجة حرارة الغرفة وبعد عملية الطرد المركزي، يتم إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب في 0.5 milliliters من وسط knockout المكمل والخالي من المصل والمسخن مسبقاً عند 37 degrees Celsius لمدة 24 ساعة. قبل هذه العملية، يجب تحضير طبقة مغذية من خلايا أرومات ليفية جنينية لفأر مبطلة المفعول (MEF CCF1) مباشرة قبل زراعة الخلايا الجرثومية البدائية (PGC). كما يجب إزالة الوسط الغذائي من الطبقة المغذية المحضرة.بعد ذلك، أضف بضعة ملليلترات من وسط استنبات الخلايا المعطلة (knockout media) المدعم، والذي تم تسخينه مسبقاً عند 37 °C، فوق طبقة الخلايا المغذية (meth feeder layer). وتحت المجهر المجسم، وباستخدام توزيع متماثل، يتم توزيع كميات صغيرة من PT GC فوق طبقات الخلايا المغذية. وإذا كانت هذه القطع متقاربة، فإنها تميل إلى التجمع وتكوين مستعمرات كثيفة تلتصق بشكل ضعيف أو تبدأ في تمايز المزرعة.يجب وضع ملصقات على الأطباق تتضمن اسم سلالة الخلايا الجرثومية الجنينية، ورقم الممر، والتاريخ. انقل أطباق الزراعة بعناية إلى حضانة عند 37 درجة Celsius و5% CO₂، وبعد 10 أيام من العزل، يمكنك التعرف على مستعمرات الخلايا الجرثومية الجنينية بناءً على شكلها المورفولوجي المميز. كما يمكن تحديدها بعد الممر الأول من خلال تعبيرها عن مؤشرات تعدد القدرات مثل alpha lime phosphatase، وOP four SSEA one، وso two.سنقوم اليوم بتوضيح كيفية جمع وعزل واستنبات الخلايا الجرثومية الجنينية من الخلايا الجرثومية البدائية (PGC) في الفئران عند اليوم 10.5 و11.5 بعد الإخصاب. إن توصيف الخلايا الجرثومية الجنينية كسلائف للأمشاج أمر أساسي للأبحاث المتعلقة بتكوين الأمشاج في الخصوبة والسرطان.شكرًا لمشاهدة الفيديو الخاص بنا. بالتوفيق في تجربتكم.

isolation-and-derivation-of-mouse-embryonic-germinal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لعزل واستزراع خلايا القشرة الدماغية الأولية من الدماغ الظهري الجانبي لأجنة الفئران.

عزل واستزراع الخلايا من الدماغ الظهري الجانبي لجنين الفأر

في السنوات الأخيرة وقد تجلى تشكيل الخلايا الجرثومية باستخدام أساليب الثقافة في المختبر باستخدام عدة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية الجسدية. هذه المادة سوف يقدم بصريا التفريق بين الأطفال حديثي الولادة الماوس الخلايا الجذعية المشتقة إلى أوائل الخلايا الشبيهة البويضة.

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

لقد طورنا بروتوكولا لتوليد مجاميع الخلايا الجذعية الجنينية للفأر التي تعرض التنظيم الذاتي وكسر التماثل والاستطالة بالتوازي مع التطور المحوري. تسمح هذه التقنية بدراسة العمليات التنموية المحورية وتوليد أنواع الخلايا التي يصعب إجراؤها في الثقافة أحادية الطبقة.

جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ<em&gt; في المختبر</em

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمية، وحيدة الخلية في التحليل الموقعي للتعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في أجنة الفئران قبل الغرس. الإجراءات اللازمة لتحصيل الكيسات الأريمية، بكل جبل كشف مناعي للبروتينات، وصفت التصوير العينات على المجهر متحد البؤر، وتجزئة النووية وتحليل الصور.

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

للدم الجذعية والسلف الخلايا (HSPC) مستمدة من المتخصصة (مكون للدم) الخلايا البطانية خلال تطوير، ولكن لا يعرف الكثير عن العملية التي بعض الخلايا البطانية تحدد لتصبح تكوين الدم. ونحن لشرح طريقة التدفق الخلوي على أساس السماح العزلة في وقت واحد من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC من الأنسجة الجنينية في الفئران.

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

يوضح البروتوكول الموصوف هنا بالتفصيل تحريض برنامج متولد الدم في الخلايا الليفية الجنينية للفأر عن طريق الإفراط في التعبير عن مجموعة ضئيلة من عوامل النسخ. يمكن ترجمة هذه التقنية إلى الجهاز البشري لتوفير منصات للدراسة المستقبلية لتكون الدم وأمراض الدم وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم.

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

هنا، نحن نقدم تقنية microsurgical رواية لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الماوس الجنين ه13 ganglionic نيافة.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

هنا نقدم طريقة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا الجرثومية الحية الميوتيك وما بعد الومياء من الخصيات الماوس الكبار. باستخدام السمية الخلوية المنخفضة ، وصبغة ملزمة الحمض النووي ذات الحماس البنفسجي وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، يمكن للمرء عزل مجموعات الخلايا المنوية الغنية للغاية للعديد من تطبيقات المصب.

عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة

تهدف هذه المقالة إلى إظهار استخدام الخلايا الجذعية الجنينية الهيمونوجينية كبديل للحيوانات المنوية لبناء أجنة شبه مستنسخة.

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

تؤسس هذه الورقة خط أنابيب لمعلقات عالية الجودة للخلية المفردة والنوى لأجنة الفئران المعدة لتسلسل الخلايا المفردة والنوى.

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

تعلم عزل خلايا الفأر الجنينية البدائية من الغدد التناسلية النامية عند 10.5-11.5 يومًا بعد التلقيح. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تطور الخلايا الجرثومية والخصوبة والسرطان.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

استكشف المزيد من الفيديوهات