النمذجة باستخدام الفئران التهاب القولون ديكستران سلفات الصوديوم (DSS)

تُعطى الفئران 3%DSS في مياه الشرب لمدة أربعة أيام. وبينما يتم تسجيل الوزن ووجود الإسهال والدم في البراز يومياً، يتم استبدال TSS بماء معقم بجهاز الأوتوكلاف بعد اليوم الرابع. وبعد ثلاثة أيام من شرب الماء، يتم قتل الفئران رحيماً واستئصال القولون منها.

يتم قياس القولونات ووزنها. ثم يتم تشكيل القولونات إما على هيئة لفائف سويسرية (Swiss rolls) أو نقانق، وفحصها تحت المجهر. سيوضح هذا المقال المرئي كيفية حصاد ومعالجة القولونات في نموذج فأري للتهاب القولون.

يُستخدم هذا الإجراء لدراسة التهاب القولون في مختبر الدكتور Christopher Williams بقسم بيولوجيا السرطان في جامعة Vanderbilt قبل البدء في العلاج بكبريتات ديكستران الصوديوم. يتم الحصول على أوزان أساسية طوال فترة التجربة. يتم تسجيل الأوزان يومياً بعد وزن الفئران، ثم يتم تحضير محلول ملحي من كبريتات ديكستران الصوديوم، أو DSS، بتركيز 3% وزن/حجم في الماء.

يجب أن يكون لـ DSS وزن جزيئي منخفض ليكون هذا النموذج فعالاً؛ قم بتحضير كمية كافية من محلول DSS لملء زجاجة مياه لكل قفص من الفئران، وقم بترشيح المحلول باستخدام مرشح أسيتات السليلوز بمسامية 0.45 micrometer. استبدل زجاجة مياه الشرب في قفص الفئران بزجاجة تحتوي على محلول DSS بتركيز 3%. إذا كانت مؤسستك تستخدم نظام ري آلي، فضع رؤوس استبعاد على فوهات الري لضمان عدم وصول الفئران إلى أي مصدر آخر للمياه.

بعد مرور أربعة أيام، يتم وزن الفئران مرة أخرى لتقدير التبعات الجهازية لالتهاب القولون. يشيع حدوث فقدان في الوزن عند الإصابة الشديدة، ومع ذلك، قد لا يكون ذلك واضحاً لعدة أيام إضافية في اليوم ذاته. وفي اليوم الرابع، يتم استبدال محلول DSS بالماء لمدة ثلاثة أيام إضافية للسماح ببعض التعافي في الظهارة القولونية.

بعد ثلاثة أيام، في اليوم السابع، يتم وزن الفئران مرة أخرى. يمكن بعد ذلك استئصال القولون من الفئران التي تم قتلها رحيمًا كما هو موضح في القسم التالي. لاستئصال القولون، يتم كشف الجانب البطني للفأر المقتل رحيمًا لضمان الوصول دون عوائق إلى منطقة البطن.

بلل منطقة البطن تماماً باستخدام 70%ethanol. أمسك خط المنتصف في البطن بواسطة ملاقط الأنسجة وارفعها للأعلى، وبذلك يتم شد الجلد باستخدام مقص دقيق الرأس.

قم بشق البطن للكشف عن محتوياتها. مد الشق وصولاً إلى طرف الناتئ الخنجري عند الخط الناصف، ثم مده على طول الجانب السفلي للحواف الضلعية من كلا الجانبين. حدد مكان الأعور والأمعاء الغليظة في الأمعاء الدقيقة.

قم بتشريح أو فصل القولون بعناية عن المساريقا المحيطة به. بعد ذلك، قم بقطع القولون في عمق الحوض لتحرير القولون القاصي من المستقيم.

يجب توخي الحذر لضمان عدم قطع أي شرايين أو أوردة. كما يجب الانتباه إلى أن القولون يمكن أن يتمزق بسهولة؛ لذا قم بإزالة القولون من المساريقا برفق.

اقطع القولون عند حافة Colona sequel لتحرير القولون الداني. قم بإزالة القولون وبشكل كامل، وباستخدام إبرة تغذية عيار 20 ومحقنة سعة 10 milliliter، قم بإدخال أنبوب في القولون وغسله بمحلول PBS بارد جداً حتى يصبح EIT خالياً تماماً من البراز. من المهم الحفاظ على التوجيه الصحيح للقولون من خلال إبقاء الطرف القاصي من القولون هو الأقرب إليك.

ابدأ بقياس طول القولون باستخدام القدمة ذات الورنية الرقمية. ويعد طول القولون مؤشراً آخر على شدة الإصابة، حيث يؤدي التهاب القولون إلى زيادة الوذمة وتقصير الطول الإجمالي للقولون.

في هذه المرحلة، يمكن إما معالجة القولونات التي تم جمعها كـ "نقانق" (sausages) لإجراء التحليل العياني، أو تحويلها إلى "لفافة سويسرية" (Swiss roll) للتحليل النسيجي لالتهاب القولون الحاد. سنوضح هذه التقنيات في الأقسام التالية لمعالجة القولون كـ "نقانق". ولإجراء التحليل العياني للقولون بأكمله، من المهم الحفاظ على التوجه الصحيح للقولون؛ لذا، اجعل الطرف القاصي للقولون هو الأقرب إليك.

قم بقص قطعتين من خيوط جراحية غير قابلة للامتصاص، طول إحداهما بوصة واحدة تقريباً والأخرى بوصتان. استخدم قطعة الخيط التي يبلغ طولها بوصتين لربط الطرف القاصي من القولون في أقرب نقطة ممكنة من الحافة مع ضمان إحكام الغلق. بعد ذلك، ضع إبرة تغذية مقاس 20 gauge تحتوي على 5 mL من محلول formalin phosphate المنظم بتركيز 10% في الطرف الداني من القولون.

اربط القطعة المتبقية من خيط الجراحة ربطاً رخواً مباشرة قبل بصلة إبرة التغذية. الآن، أمسك القولون بإحكام عند بصلة إبرة التغذية وقم بحقن كمية كافية من formalin مع التأكد من تمدد القولون. شد العقدة في خيط الجراحة أثناء سحب إبرة التغذية، وبذلك يظل القولون المحقون متمدداً.

عند تحضير العينة كقطعة نقانق، املأ أنبوباً مخروطياً سعة 15 milliliter بمحلول منظم من الفورمالدهيد والفوسفات بتركيز 10%، ثم ضع ملصقاً تعريفياً على الأنبوب. ضع القولون في الأنبوب وثبته لمدة 24 ساعة. بعد مرور 24 ساعة، اسكب الفورمالين في حاوية نفايات مناسبة واستبدله بـ 70% ethanol لمدة 24 ساعة إضافية.

يمكن تخزين القولونات في ethanol بتركيز 70% إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة. وعندما تصبح مستعداً لتحليل القولون، قم بإخراجه من الأنبوب المخروطي. اقطع الخيوط الموجودة على كل طرف باستخدام المشرط مع الحرص على عدم إتلاف القولون.

تذكر أن الطرف القاصي يحتوي على أطول قطعة من الخيط. يتم قص القولون طولياً من الطرف القاصي إلى الطرف الداني بحيث يشكل ورقة طويلة. يمكن الآن فحص القولون تحت مجهر التشريح.

اقطع القولون طولياً وبسطه كشرائح مسطحة. يتطلب لف القولون زوجين من الملاقط وتقنية تعتمد على استخدام كلتا اليدين. أمسك الحافتين الجانبيتين لهامش القولون القاصي باستخدام الملاقط، ثم ابدأ بلف القولون بالتتابع عن طريق تدوير الملاقط وتحريرها والتحرك باتجاه الهامش الداني، مما يؤدي إلى تكوين لولب ثلاثي الأبعاد أو ما يعرف بـ "اللفافة السويسرية" (Swiss roll).

إذا التصق القولون بورق واتمان (watman paper)، بلل الورق والقولون بكمية صغيرة من PBS للحفاظ على الشكل. أمسك اللفافة بإحكام باستخدام الملقط وقم بقطعها باستخدام إبرة قياس 27.5. ثبت اللفافة عن طريق ثني الإبرة عند خروجها من اللفافة.

الآن، ضع اللفافة في كاسيت أنسجة مصنف، ثم ضع الكاسيت في وعاء يحتوي على محلول فورمالين فوسفات منظم بتركيز 10%. اتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة لتثبيت الأنسجة. بعد مرور 24 ساعة، قم بسكب الفورمالين واستبدله بإيثانول بتركيز 70% لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات إضافية.

يمكن تخزين القولونات في إيثانول بتركيز 70% لفترة غير محددة في درجة حرارة الغرفة. يتيح هذا النموذج للباحث استخراج القولونات وتثبيتها وتحليلها، مما يسمح بتحليل شدة التهاب القولون. ولإجراء تحليل عياني للقولون بأكمله، يمكن معالجة القولون كـ "سجق" يتم غمره في الفورمالين وتمديده بالكامل.

يجب أن يكون السجق المفتوح مستوياً. إذا تم تنفيذ طريقة السجق بشكل صحيح، فسيكون القولون المثبت متوسعاً، ويمكن التحكم في كامل السطح المخاطي ومعاينته بسهولة تحت مجهر التشريح. ولأغراض التحليل النسيجي، يمكن معالجة القولون على شكل لفافة سويسرية (Swiss roll).

يتم تثبيت اللفافة باستخدام إبرة ثم توضع في كاسيت للأنسجة من أجل التثبيت. وعندما يتم تقطيع اللفافة وتركيبها، يجب أن تشكل شريحة ممثلة للقولون بأكمله إذا تم لفها بشكل صحيح؛ ويمكن صبغ مقاطع من "اللفافة السويسرية" (Swiss roll) باستخدام الهيماتين وASIN لتحديد مدى الإصابة القولونية. مع مراعاة أن الطرف القاصي من القولون يقع في مركز اللفافة على الشريحة.

في هذا المثال، يبدو الالتهاب وتضرر الخبايا واضحاً في القولون المعالج بـ DSS مقارنة بمجموعة الضبط المعالجة بالماء. لقد عرضنا لكم للتو كيفية استئصال ومعالجة القولون من نموذج فئران مصاب بالتهاب القولون الحاد. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تكون منظماً جيداً قبل عملية التضحية بالحيوان.

على سبيل المثال، يجب وضع ملصقات تعريفية على جميع الأنابيب والكاسيتات الخاصة بكل فأر، مع توفير جميع الأدوات والكواشف اللازمة. بالإضافة إلى ذلك، يجب الاحتفاظ بسجلات مفصلة لوزن الفأر وطول القولون. وأخيراً، تأكد من تخصيص وقت كافٍ لعملية المعالجة.

يستغرق الأمر عادةً 15 دقيقة لكل فأر بالنسبة للمبتدئين، ومن ست إلى ثماني دقائق للشخص الأكثر خبرة في هذه التقنية.