باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد ظروف التثقيب الكهربائي المثلى لنقل الجينات إلى خطوط الخلايا الأولية باستخدام الأرومات الليفية الجنينية للفئران أو mfs. وعلى سبيل المثال، يتم تحميل خلايا MF والحمض النووي المختار في لوحة تثقيب كهربائي مكونة من 96 بئراً متصلة بنظام gene Pulser MX cell، وهو ما يسمح باختبار ظروف تثقيب كهربائي متعددة في تشغيلة واحدة. وفي تجارب التحسين، يتم استزراع الخلايا بعد التثقيب الكهربائي وتحليلها لتقييم كفاءة عفن الجينات.

باستخدام المجهر الفلوري فوق البؤري وتدفق الخلايا (flow cytometry)، يمكن بعد ذلك اختيار أكثر ظروف التثقيب الكهربائي كفاءة لعمليات عفن الخلايا المستقبلية. مرحباً، أنا آدم مكوي، كبير العلماء في قسم التعبير الجيني في مختبرات BioRad. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحديد أفضل ظروف التثقيب الكهربائي لعملية عفن خطوط الخلايا الأولية بسهولة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التعبير الجيني في هذه الخلايا. سأستخدم اليوم ثلاثة أرقام ممرات مختلفة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر (mes). إنني أستخدم مزارع بأرقام ممرات مختلفة لسببين.

أولاً، سأوضح مدى أهمية صحة الخلايا؛ فبالنسبة لخطوط الخلايا الأولية، يمكن أن يؤدي مجرد بقائها لبضعة أيام إضافية في المزرعة إلى إحداث فارق في كفاءة عفن الخلايا (transfection efficiency). ثانياً، أريد أن أبين أن عملية تحديد الظروف المثلى تظل كما هي، على الرغم من انخفاض كفاءة عفن الخلايا مع الخلايا الأقدم. ومن المرجح أن تجربتكم لن تتضمن خلايا بأعمار مختلفة.

يمكنك اتباع نفس الإجراء مع تصميمك التجريبي الخاص. إذا كنت ترغب في مقارنة التعبير الجيني بين الخلايا الضابطة والخلايا المعالجة، يمكنك أولاً تحديد الظروف المثلى ثم إجراء تجربتك باستخدام الظروف التي حددتها. أو يمكنك إجراء عملية التحسين والتجربة معاً.

كما سأوضح اليوم، سأستخدم بلازميداً يشفر GFP لفحص كفاءة عفن الخلايا (transfection) بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry). ولكن إجراء التثقيب الكهربائي (electroporation) سيكون هو نفسه حتى لو كنت تقوم بشيء مختلف، مثل إدخال irna وفحص التعبير الجيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR). لذا، فلنبدأ.

تعتبر الخلايا الليفية الجنينية للفئران، أو mets المستخدمة في هذا البروتوكول، خلايا ملتصقة. لذا، فإن الخطوة الأولى في التعامل مع هذه الخلايا هي فصلها عن قاع الدورق باستخدام بروتوكولات زراعة الأنسجة القياسية التي تتضمن عملية التريپسنة (trypsinization). وبعد انفصال الخلايا عن الدورق، يتم تحييد التريپسين باستخدام وسط يحتوي على المصل وجمع الخلايا في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter.

بعد الجمع، قم بطرد الخلايا مركزياً حتى تترسب. يجب غسلها عن طريق إعادة تعليقها في حجم معلوم من PBS. وبمجرد إعادة التعليق الكامل، قم بعد الخلايا مع العلم أن هناك حاجة لتركيز يبلغ 1 مليون خلية لكل milliliter لتجارب التثقيب الكهربائي.

احسب العدد المناسب من الخلايا بناءً على تعداد الخلايا وانقلها إلى أنبوب نظيف. استخدم جهاز الطرد المركزي لترسيب الخلايا في القاع. ثم قم بإزالة السائل الطافي بعناية.

أعد تعليق الخلايا في محلول التثقيب الكهربائي بتركيز مليون خلية لكل مليلتر وأضف 20 ميكروغرام لكل مليلتر من البلازميد. تنقسم الصفائح إلى 96 بئراً، حيث تحمل الأعمدة تسميات من 1 إلى 12 والصفوف من A إلى H؛ وتتشارك كل مجموعة مكونة من أربع آبار، أو مجموعة آبار، في زوج من صفائح الأقطاب الكهربائية بحيث تتعرض الخلايا في تلك الآبار لنفس النبضة. فعلى سبيل المثال، تكون الخلايا في الآبار 1A و 1B و 1C و 1D متصلة كهربائياً في مجموعة آبار واحدة وتتلقى جميعاً النبضة ذاتها.

ستتلقى المجموعة التالية المكونة من أربعة آبار، 2A و2B و2C و2D، النبضة الثانية عند بدء البروتوكول؛ ورغم أن المعايير قد تكون متطابقة، إلا أن لوحة التثقيب الكهربائي ذات الـ 96 بئراً مصممة بحيث يتم تقسيم النصف العلوي والسفلي من اللوحة. لذا، فإن الآبار 1E و1F و1G و1H في الجزء السفلي من اللوحة قد تلقت جميعها نبضة واحدة، ولكنها تختلف عن النبضة التي تلقتها الآبار 1A و1B و1C و1D في الجزء العلوي.

في هذه التجربة، سيتم استخدام نصف الطبق فقط. تحتوي الآبار الثلاثة الأولى من كل مجموعة آبار على خلايا بأعمار مختلفة. لقد تم تمرير الخلايا الموجودة في الصف العلوي الصف A خمس مرات.

تم تمرير الخلايا في الصف B تسع مرات، بينما تم تمرير الخلايا في الصف C ثلاث عشرة مرة. يحتوي الصف D على محلول التثقيب الكهربائي (electroporation buffer) فقط قبل عملية التثقيب الكهربائي. ومن الجيد مراجعة البروتوكول الخاص بك للتأكد من صحة الإعدادات.

سيوفر هذا البروتوكول ست نبضات اضمحلال أسي تليها ست نبضات موجة مربعة. تزداد نبضات الاضمحلال الأسي من 200 فولت إلى 450 فولت، وتستخدم جميعها 350 micro farads فقط، وذلك بسبب المقاومة المنخفضة لمنظم نبضات الجينات أو محلول التثقيب الكهربائي المستخدم.

تختلف نبضات الموجة المربعة من حيث الجهد ومدة النبضة. يجب ضبط إعداد السعة الكهربائية للجهاز ليتناسب مع موصلية خليط التثقيب الكهربائي. وفي حال استخدام محلول منظم ذي مقاومة أعلى للتثقيب الكهربائي مثل DMEM، يمكن استخدام نطاق الجهد نفسه، ولكن مع سعة كهربائية أكبر مثل 950 micro ferrets لنبضات الاضمحلال الأسي.

إذا كانت السعة الكهربائية المثلى للمنظم الذي تستخدمه غير معروفة، فستحتاج أيضًا إلى تغيير السعة في ظروف التثقيب الكهربائي التي تقوم باختبارها. الخطوة التالية هي تحميل 150 µL من خليط الخلايا والبلازميد في كل بئر مستخدم في هذه التجربة. ويتم ملء البئر الرابع من كل مجموعة آبار مستخدمة بمنظم التثقيب الكهربائي.

بعد تحميل الطبق، ضعه في حجرة أطباق MXL وأغلق الغطاء. ثم اضغط على زر النبض (pulse) لتحويل الخلايا. يقوم الجهاز بإرسال النبضات الكهربائية بالتتابع إلى كل بئر وفقاً للشروط المحددة في البروتوكول المختار.

يستغرق الرش الكهربائي لجميع الخلايا بضع ثوانٍ. وبمجرد اكتمال النبضة، أخرج الطبق من غرفة الأطباق. انقل الخلايا من كل بئر إلى طبق زراعة يحتوي على وسط زراعة مُدفأ مسبقاً.

يتم تنمية هذه الخلايا في وسط DMEM مكمل بـ 10% FBS. يتم أخذ عينات الضبط التي لم تتعرض للثقب الكهربائي من خليط الخلايا والبلازميد المتبقي، وتضاف إلى أطباق استزراع تحتوي على وسط الاستزراع الذي تم تسخينه مسبقاً وبنفس تركيب الوسط المستخدم مع الخلايا التي تعرضت للثقب الكهربائي. أخيراً، يتم الرج بحركة دائرية.

بعد ذلك، قم بالنقر على الطبق لتوزيع الخلايا قبل وضعها في الحاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 °C و5% carbon dioxide قبل تحليل كفاءة عفن الخلايا (transfection efficiency) وتحديد ظروف التثقيب الكهربائي (electroporation) الأفضل لتجربتك. وبمجرد تحديد ظروف التثقيب الكهربائي المثلى، هناك خياران من طرق التثقيب الكهربائي للتجارب المستقبلية؛ حيث يمكن للباحث إما الاستمرار في معالجة الخلايا في أطباق ذات 96 بئراً أو معالجة الخلايا في كوفيتات (cuvettes) عينة واحدة في كل مرة.

لا يمكن للكوفيتات (Cuvettes) استيعاب سوى عينة واحدة في المرة الواحدة، وتتطلب أربعة أضعاف الحجم المطلوب لبئر واحد في أطباق 96 بئراً، ولكن الكوفيتات الفردية أقل تكلفة وسهلة الاستخدام عندما تكون هناك حاجة لعدد قليل من العينات فقط. وقد صُمم نظام Gene Pulse أو MX cell بحيث يمكن استخدام نفس إعدادات التثقيب الكهربائي في الأطباق والكوفيتات في آن واحد. وبدلاً من حجرة الأطباق، استخدم mxl shock pod المخصص للكوفيتات.

افصل غرفة الأطباق من الجزء الخلفي للجهاز وقم بتوصيل وحدة الصدمات (shock pod). نظرًا لأن وحدة الصدمات تقدم فقط النبضة المبرمجة للمجموعة A، B، C، D 1 من الآبار، فقد يتطلب الأمر اختيار برنامج مختلف. لاختيار برنامج تم حفظه مسبقًا، اضغط على زر الصفحة الرئيسية (home).

بعد ذلك، اختر الخيار الثالث "بروتوكولات المستخدم". إذا كنت موجوداً بالفعل في مجلد المستخدم الصحيح، اضغط على مفتاح Enter لاختيار بروتوكولات المستخدم ثم قم بالتمرير لأسفل. ولتحديد البرنامج المطلوب، اضغط على مفتاح Enter لاختيار ذلك البرنامج.

الجهاز الآن جاهز. بعد اختيار البرنامج، قم بتجهيز الكيوفيتات. يتم تحضير خليط البلازميد وخلايا MEFs بنفس الطريقة التي تم عرضها سابقاً.

قم بتعبئة كل أنبوب 0.4 سنتيمتر بنفس الحجم المستخدم لمجموعة الآبار الكاملة في أطباق 96 بئرًا. بما أن مجموعة الآبار تتكون من أربعة آبار، وقد استُخدم 150 ميكرولتر من المحلول المنظم أو خليط الخلايا لكل بئر، فقد تم استخدام 600 ميكرولتر من خليط خلايا البلازميد لكل أنبوب.

بعد ذلك، ضع الـ vet في حجرة وحدة الصدمات الكهربائية، واضغط على زر النبض (pulse) لتوجيه الصدمة الكهربائية إلى الخلايا. بعد عملية التثقيب الكهربائي، تابع الإجراءات كما في طريقة الطبق؛ اخلط الخلايا ثم انقل حصصاً منها إلى أطباق زراعة الخلايا المملوءة بوسط غذائي مُدفأ مسبقاً، مع تحديد مجموعة ضابطة من الآبار التي لم تخضع للتثقيب الكهربائي، ثم قم بتدوير الطبق والنقر عليه.

ثم تُترك الخلايا للتعافي لمدة 24 ساعة عند 37 درجة Celsius و5% من ثاني أكسيد الكربون قبل تحليل كفاءة عفن التحول بعد عملية النقل الجيني والسماح للخلايا بالتعافي. يتم تحليل كفاءة عفن التحول نوعياً باستخدام المجهر الفلوري العاكس (epi fluorescent microscopy) وكمياً باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry)؛ حيث تظهر الخلايا التي تم إدخال المادة الوراثية إليها بنجاح عبر التثقيب الكهربائي وتعبر الآن عن جين GFP باللون الأخضر تحت المجهر الفلوري العاكس، ويظهر هنا نموذج لنتيجة ناجحة. كما يتيح فحص الخلايا تحت تباين الطور (phase contrast) رؤية كل من الخلايا التي خضعت لعفن التحول والخلايا التي لم تخضع له.

تظهر هنا الخلايا التي تعرضت لنبضة التثقيب الكهربائي بأدنى جهد كهربائي عند 200 volts. وتكاد تكون الخلايا متلاحمة تماماً بسبب الكثافة الخلوية العالية. ويظهر نفس المجال الرؤي تحت مجهر الفلورسنت فوق الخلية (epi fluorescence) أن عدداً من الخلايا تعبر عن علامة GFP، ولكن هذه الخلايا لا تمثل سوى نسبة مئوية صغيرة من الخلايا التي ظهرت في الصورة السابقة عند 250 volts.

ينخفض العدد الإجمالي للخلايا الحية المرئية تحت مجهر تباين الطور قليلاً تحت مجهر الفلورسنت الشامل. ونلاحظ أن عدد الخلايا التي تعبر عن GFP قد زاد عند أعلى جهد كهربائي تم تطبيقه وهو 375 فولت. ومع ذلك، تظهر خلايا حية أقل، ولكن نسبة كبيرة من الخلايا المتبقية تعبر عن GFP.

تعتمد الحالة المثلى على تصميم التجربة؛ ففي بعض التجارب، قد يكون الحصول على أكبر عدد من الخلايا المنقولة جينيًا هو الأمر الأمثل، بينما في تجارب أخرى، قد تكون أعلى نسبة نقل جيني هي الأفضل.

نحن مهتمون بنسبة الخلايا الموجبة لبروتين GFP تحت كل حالة، وكيف تختلف هذه النسب مع تدفق عمر الخلايا. يمكن أن يوفر قياس التدفق الخلوي معلومات كمية حول نتائج عفن التحول (transfection) تحت كل حالة من حالات التثقيب الكهربائي المختلفة. يظهر هنا النسبة المئوية للخلايا الموجبة لبروتين GFP في الممر.

خمس خلايا. وتحت كل حالة من حالات التثقيب الكهربائي الـ 12، بلغت أقصى نسبة ترنسفكشن حوالي 80% تحت أعلى جهد للاضمحلال الأسي. حالة النبض السادسة والسابعة تحت أقوى نبضة موجة مربعة تم اختبارها في الحالة 12 مع تمرير الخلايا تسع مرات قبل عملية التثقيب الكهربائي.

إن النمط العام لنسبة ترنسفكشن (transfection) متطابق تقريباً، ولكن مع انخفاض طفيف جداً في نسب الترنسفكشن الموضحة. وفيما يلي نسب خلايا GFP في خلايا الممر 13، والتي تظهر انخفاضاً ملحوظاً في نسبة الترنسفكشن مقارنة بالخلايا الأصغر سناً. وكانت أعلى نسب ترنسفكشن تعادل تقريباً نصف ما تم تحقيقه مع الخلايا الأصغر سناً، مما يبرهن على أهمية استخدام خلايا سليمة في أقرب وقت ممكن بعد عملية العزل.

لقد أوضحتُ لك للتو كيفية استخدام نظام التثقيب الكهربائي MXL لتحديد الظروف المثالية للتثقيب الكهربائي لخلايا MAPs أو السلالات الخلوية الأولية الأخرى. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام خلايا سليمة في أقرب وقت ممكن بعد العزل، واستخدام ظروف تثقيب كهربائي متوافقة مع محلول التثقيب الكهربائي المنظم. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.