يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

hemocytes ذبابة الفاكهة تفريق أكثر من مجمل الجنين النامية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تحميل الصور وهذه الهجرات استخدام الاجنة مع hemocytes fluorescently المسمى.

يوضح هذا الفيديو إجراء لتركيب أجنة ذبابة الفاكهة لتصوير الخلايا الدموية. البلاعم الجنينية. يتم وضع الأجنة بواسطة الذباب على ألواح أجار عصير التفاح في قفص بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، تتم إزالة الصفيحة الزراعية وغسل الأجنة من الصفيحة الزراعية إلى مصفاة الخلية بعد الغسيل الإضافي لإزالة الحطام. يتم غمر مصفاة الخلية التي تحتوي على أجنة في مادة التبييض لطلاء الأجنة. بعد غسل المبيض ، يتم نقل الأجنة إلى قطرة ماء.

ثم يتم شفط قطرة الماء وتغطية الأجنة بزيت الكربون مرحبا. يتم نقل الأجنة التي تم تنظيمها بشكل مناسب مع الخلايا المرئية إلى بتري لكل غشاء بين زلتين مثبتتين للغطاء ومحاذاة بعناية في الزيت. ثم يتم وضع زلة غطاء ثالثة فوق الأجنة ولصقها في مكانها باستخدام طلاء الأظافر.

يمكن الآن تصوير حركة الخلايا الدموية داخل الجنين من خلال زلة الغطاء العلوي على المجهر. مرحبا ، أنا جينيفر زايد من مختبر بريان سترم في قسم التأجير في سيول والفيزياء الحيوية الجزيئية في كينغز كوليدج لندن. وأنا إيان إيفانز من مختبر وود في قسم علم الأحياء والكيمياء الحيوية في جامعة باث.

سنعرض لك اليوم إجراء لتركيب جوزيف بريو على صورة حية ، وموقع hemo ، والضامة الجنينية لهذا الكائن الحي. نستخدم هذا الإجراء لدراسة التشتت التنموي واستجابة الرياح لهذه الخلايا المناعية المهمة وآلية الهيكل الخلوي التي تستخدمها لتنفيذ هذه العمليات. لذلك دعونا نبدأ.

ابدأ هذا الإجراء من خلال الحصول على خطوط TROs OAL المناسبة التي تحتوي على أربعة محركات خاصة بالخلايا الدموية ومراسلي الفلورسنت المشفرين وراثيا تحت سيطرة الطائرات بدون طيار. هنا ، يتم استخدام الثعبان غال أربعة لدفع التعبير عن علامة نووية حمراء فلورية من UAS Red Stinger. لمناقشة مجموعة السائقين الأربعة الموصى بها GAL وتركيبات الطائرات بدون طيار ، يرجى الاطلاع على البروتوكول المكتوب المصاحب الذي يضع 20 ذبابة الفاكهة من كل جنس في قفص وضع.

يتكون قفص التمديد من صفيحة زراعية من عصير التفاح سعة 55 مليلتر مثبتة في قاع أنبوب بلاستيكي مع شاش يغطي الطرف الآخر للسماح بتدفق الهواء. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ذروة بلاستيكية بسيطة مع الثقوب. تثقيب القاعدة ، اسمح للذباب بالتأقلم مع قفص التمديد لمدة يومين على الأقل بعد أن يتأقلم الذباب مع التغيير إلى شبكة عصير التفاح الجديدة الدافئة والسماح للذباب بالاستلقاء طوال الليل عند 25 درجة مئوية.

للحصول على معلومات حول جمع الأجنة التي تم تنظيمها بشكل أكثر سرية ، يرجى الاطلاع على البروتوكول المكتوب المصاحب. بمجرد احتضان الذباب للفترة المناسبة من الوقت لوضعه ، استخدم زجاجة غسيل لتطبيق ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من الماء على اللوحة. ثم باستخدام فرشاة رسم ناعمة الرؤوس ، قم بإزاحة الأجنة من عصير التفاح ، يمكن رؤية الأجنة المخلولة بسهولة بالعين المجردة التي تمسك مصفاة خلية فوق دورق

صب الماء من عصير التفاح في مصفاة الخلية لجمع الأجنة. ثم أضف المزيد من الماء إلى عصير التفاح. آتي. كرر عملية الإجهاد حتى يتم جمع العدد المطلوب من الأجنة.

بعد ذلك ، باستخدام زجاجة غسيل ، اغسل الأجنة في مصفاة الخلية باستخدام حوالي 10 مل من الماء. بمجرد غسل الأجنة ، ضع مصفاة الخلية في غطاء عصير التفاح Aerate. أضف مبيضا أنيقا بدرجة كافية لتعليق الأجنة في مصفاة الخلية لتغليف الأجنة.

انقل مصفاة الخلية وغطاء طبق بتري إلى مجهر تشريح لمتابعة زخرفة الأجنة. تحت إضاءة المجال الساطع ، تكتمل الزخرفة عندما تذوب الزوائد الظهرية ، والتي يجب أن تحدث في غضون دقيقتين. بعد اكتمال الزخرفة ، قم بإزالة مصفاة الخلية التي تحتوي على الأجنة من المبيض ، مرة أخرى ، مع إمساك المصفاة فوق دورق

استخدم زجاجة غسيل لغسل المبيض المتبقي برفق ولكن تماما. ضع مناديل المختبر ذات اللون الأزرق على الجانب السفلي من مصفاة الخلية لمسح الماء المتبقي. في حالة تغير اللون الأزرق إلى المبيض الأبيض أو الوردي ، استمر في الغسيل مع التأكد من إزالة جميع آثار المبيض قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

إزالة الماء الزائد من مصفاة الخلية يجعل من السهل التقاط الأجنة بفرشاة الرسم في الخطوة التالية. بمجرد إزالة كل مواد التبييض من الأجنة ، ضع قطرة من الماء في غطاء طبق بتري بفرشاة رسم دقيقة. اجمع كل الأجنة المطلية من المصفاة وأعد تعليقها في القطرة.

بعد ذلك ، ضع منديلا كيميائيا على الجزء الخارجي من مصفاة الخلية لتجفيف الأجنة. بمجرد تجفيف الأجنة ، أضف قطرة من زيت الكربون هالة ، 700 لتغطية جميع الأجنة. ثم ضع قطرة صغيرة ثانية من الزيت بجوار القطرة التي تحتوي على الأجنة.

افحص الأجنة تحت مجهر تشريح الفلورسنت. تحديد الأجنة التي تم تنظيمها بشكل مناسب من النمط الجيني المطلوب لتصوير الهجرة الجانبية للسريات. على خط الوسط البطني.

اختر المرحلة من 13 إلى 14 أجنة. في هذا المثال ، يتم التعرف على الخلايا بواسطة نوى الفلورسنت وتكون مرئية في الرأس وعلى طول الحبل العصبي البطني وتطوير الأوعية الدموية لتصوير حركة الدمى بعد التشتت فوق الجنين ، اختر المرحلة 15 من الأجنة. في هذه المرحلة ، سوف ينتشر الدماف على الجنين بأكمله.

ومع ذلك ، يجب أن تكون ثلاثة خطوط متوازية من الدماف مرئية على الجانب البطني من الجنين بعد الهجرة الجانبية من خط الوسط. بمجرد اختيار الأجنة، استخدم زوجا من ملقط صانعي الساعات المنحني رقم خمسة لالتقاط الأجنة المختارة. الحرص على عدم ثقب أغشية القارورة.

ثم ضع الأجنة في القطرة الثانية من الزيت على الجانب السفلي من طبق بتري بيرم لوماكس 50 ملم. ضع قطرتين صغيرتين من زيت Halo Caron 700 على بعد حوالي سنتيمتر واحد. ضع زلة غطاء على كل قطرة تحت إضاءة المجال الساطع على مجهر التشريح.

انقل ما يصل إلى 15 جنينا بعناية باستخدام ملقط منحني. محاذاة الجانب البطني للأجنة لأعلى وبالتوازي مع حافة الغطاء. ينزلق بمجرد محاذاة الأجنة عند قطرة صغيرة من الزيت والسماح لها بالانتشار لتشكيل طبقة متجانسة بين زلات الغطاء.

بعد انتشار الزيت ، قد يستغرق ذلك بضع دقائق. تأكد من أن الأجنة لا تزال بطنية. الجانب لأعلى إذا تدحرجت الأجنة قليلا.

أعد وضعها مرة أخرى باستخدام الملقط. أخيرا باستخدام الملقط رقم ثلاثة. ضع زلة غطاء ثالثة فوق الأجنة.

سد بين زلات الغطاء الملتصقة سابقا. الغراء زلة الغطاء هذه على الغطاء. يدعم الانزلاق باستخدام طلاء الأظافر.

الأجنة جاهزة الآن للتصوير. تم تركيب جنين SRP gal four UAS Red Stinger على الجانب البطني لأعلى وتم الحصول على صور الفاصل الزمني على مجهر تشريح الفلورسنت Leica M 2 0 5. يتم تصور الخلايا من خلال نواتها ذات العلامات الحمراء.

يبدأ الفيلم في المرحلة من 12 إلى 13 من التطور عندما يغادر الرأس ويهاجر إلى أسفل خط الوسط البطني. بعد حوالي ساعة واحدة ، تبدأ الخلايا في الهجرة من خط الوسط لتشتت إلى أوضاع جانبية على طول السطح البطني. لبقية التنمية.

الخلايا الدموية نشطة للغاية ، وتهاجر في جميع أنحاء الجنين. علينا أن نوضح لك كيفية مراقبة جنين جوزيف لمتابعة الحركة أو الجانب الهيمو يعيش في الجسم الحي. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم التعامل مع الأجنة بعناية ، خاصة على طبق بتروبيرم ، لتجنب التلف بمجرد أن تصبح الأجنة في الزيت ، فهي مقاومة نسبيا للجفاف ، ولكن يجب الحرص على عدم تبييض الأجنة لفترة طويلة عند إزالة التاج.

أخيرا ، من خلال تركيب العديد من الأجنة ، ستمنح نفسك أفضل فرصة ممكنة للحصول على جنين في الاتجاه المثالي للتصوير الحي. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.