Name: التصوير إصلاح عدم تطابق والردود الخليوي الى الحمض النووي من التلف في /em (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: اكتشف بروتوكول تصوير مركبات إصلاح الحمض النووي في خلايا Bacillus subtilis باستخدام بروتينات GFP المدمجة. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات إصلاح عدم التطابق في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب نود أن نشكر الدكاترة. Philina س. لي وألان غروسمان دال للتدريب في البداية في LAS المجهري مضان. الكتاب أيضا أن أشكر الدكاترة. ميلاني Berkmen كوباياشي وهاجيمي طلبا للمساعدة ونصائح للتصوير. وأيد هذا العمل عن طريق بدء الأموال من كلية الآداب والعلوم والآداب والعلوم من قسم علم الأحياء الجزيئية والخلوية والتنموية في جامعة ميشيغان.

تزايد الثقافات من الخلايا للفحص المجهري 1. واحد أو يومين قبل التصوير ، وإعداد B. سلالة الرقيقة التي تحتوي على البروتين الانصهار متعدية كنت ترغب في تصور. سوف جولات محاكمة 1A 1B الخطوات وتكون ضرورية لتحديد حالة النمو التي توفر أفضل الصور من سلالة الخاص بك. في معظم الحالات ، ينبغي تصوير الخلايا خلال مرحلة النمو المتسارع. <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة لبعض B. سلالات الرقيقة (في السلالات ، ولا سيما التي تنمو بشكل سيئ نتيجة لاندماج بين الانصهار متعدية الجينات في المصالح وGFP في مكان به الذاتية) ، والنمو الأولي لمدة يومين قبل التصوير ضروري للصور ذات جودة عالية. في اليوم الأول ، على خط باء الرقيقة إلى سلالة يمكن تصوير أغار على LB مع المضادات الحيوية الانتقائية (ق) ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، تطعيم 100 ميكرولتر من المياه المالحة 0.85 ٪ مع مستعمرة واحدة وأداء ثلاث التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف على لوحات أجار LB (مع المضادات الحيوية الانتقائية) ، والطلاء 100 ميكرولتر من كل التخفيف ، وتليها الحضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في اليوم الثالث ، حدد لوحة التخفيف مع النمو متموجة ضوء الخلايا. وسيكون معدل النمو متموجة الضوء على طبق تقديم المتوسطة النمو مع قيحة صحية ، وبدء تزايد أضعافا مضاعفة العائد المحتمل نتائج التصوير الممتاز (راجع الخطوة 4). هذه الخطوة هي مفيدة بشكل خاص للتصوير بجودة أعلى الغشاء مع 64 FM4 وصمة عار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باء أخرى ببساطة قد الرقيقة سلالات انتقائية تطبق على LB المتوسطة أغار على المستعمرات واحدة بعصا العقيمة في اليوم قبل التصوير واحتضان ليلا 30 درجة مئوية. في اليوم التالي ، والخلايا على هذا الطبق يكون كافيا لاستخدامها كعامل قيحة للتصوير (راجع الخطوة 4). ملاحظة : للحصول على B. الرقيقة والثقافات بين عشية وضحاها في المتوسط ​​السائل ليست مناسبة بسبب وجود مزيج من تشكيل بوغ والاستجابات النصاب القانوني ، والذي يؤدي لفترة طويلة من النمو مرحلة متخلفة 1. </li></ol> 2. في صباح يوم من التصوير ، ووضع 10 مل من المتوسط ​​50 S7 1-3 في قارورة 125 مل مخروطي العقيمة. 3. Resuspend الخلايا في لتصل إلى 2 مل من المتوسط ​​من 50 S7 LB طبق آغار مع واحد أو مستعمرات الخلايا ضوء متموجة للحصول على اللقاح. 4. إضافة ما يكفي من S7 50 خلية متوسطة قيحة إلى دورق مخروطي يحتوي على 10 مل 50 S7 المتوسطة لثقافة ذات الكثافة الضوئية الأولي تقاس في 600 نانومتر (OD 600) من ~ ،08-،1. في هذه الخطوة من المهم أن يكون ما لا يقل عن 10 الهواء أضعاف لتصل إلى نسبة متوسطة. وبالتالي ، فإننا نستخدم 10-12،5 مل من المتوسط ​​تلقيح في دورق مخروطي 125 مل. 5. تنمو كل ثقافة في 30 درجة مئوية حتى يصل إلى ثقافة OD 600 ~ 0،5-0،8. ويفضل حمامات المياه تهتز مع الثورات في الدقيقة الواحدة 150-200. وينبغي أن الثقافات تحدى مع وكلاء حمل الحمض النووي تلف أو عدم تطابق تكون في مرحلة النمو المتسارع في وقت مبكر من هذا القبيل 600 OD أن الخلايا ستصل إلى الهدف OD 600 مع الفترة الإضافية للنمو المطلوب للعلاج (انظر الجدول رقم 1) على سبيل المثال ، 2 - aminopurine يتطلب ساعة واحدة من العلاج ، ولذا تعامل مع ثقافة aminopurine - 2 ينبغي أن تكون في OD 600 ~ 0،3-0،4 ، على ان يكون ساعة واحدة من العلاج / نتائج النمو في OD 600 ~ 0،5-0،8 ، حيث الخلايا جاهزة للتصوير. تحضير العينة 1. ماصة 300 ميكرولتر من الخلايا المستزرعة في أنبوب مل microcentrifuge 1.5. 2. إذا كان المطلوب تصوير الأغشية الخلوية ، إضافة 1:1000 تخفيف FM4 - 64 غشاء صمة عار (Invitrogen) لكل عينة من حل سهم 1 ملغ / مل. قد تكون هناك حاجة لمعايرة 64 FM4 لتحقيق إشارة مضان المطلوب. مجموعة المعايرة النموذجية 1:100 ، 1:1000 ، و1:10،000. 3. السماح لعينات من الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عشر دقائق أو حين يجري إعداد الشريحة مع agarose 1 ٪ في المتوسط ​​Spizizens 1X كما هو موضح أدناه (راجع الخطوة 1 من "إعداد الشرائح"). 4. إذا كان المطلوب التركيز من الخلايا ، ونحن نفضل تصفية الخلايا باستخدام ميكرومتر 0.2 فلتر مع جهاز فراغ. ويمكن عندئذ أن تغسل الخلايا بلطف من سطح المرشح مع برنامج تلفزيوني ، آخر العازلة المناسبة أو متوسطة قبل التصور. إعداد الشريحة 1. إعداد agarose 1 ٪ مع 1X Spizizens. إضافة 5 مل من الأسهم لddH2O Spizizens 10X 45 مل مع agarose ز 0.5 ، والميكروويف لتذوب. agarose المنصهرة الساخنة يصعب ماصة ، وطدت agarose لن تدخل طرف ماصة. ينبغي أن يكون agarose معايرتها في حمام الماء إلى درجة حرارة من 55-65 درجة مئوية ~ لكي تدخل طرف ماصة دون ترسيخ داخل الحافة. 2. رسم ميكرولتر من 20 Spizizens مع agarose ذاب 1 ٪ في تلميح ماصة. ماصة قطرة واحدة (حوالي 1-2 ميكرولتر) من الحل agarose في كل شريحة جيدا (15 نستخدمها بشكل جيد الشرائح ، انظر الجدول رقم 2) لتشكيل منصات agarose الضحلة. سوف يصلب agarose على الفور. ويجب أيضا أن يتم قبل الشرائح فورا إلى تطبيق الخلايا. إذا ترك وسادات agarose في درجة حرارة الغرفة وحدها ، فإنها يمكن أن يذوى في غضون دقائق وتصبح غير صالحة للاستعمال. وينبغي أن تتركز منصات Agarose وملء كل بئر ولكن ارتفاع الحد الأدنى لتجنب تعطيل ساترة ، وإذا قطرات مرتفعة جدا (مثل فقاعة) أو إذا كان نموذج ينتشر ما وراء الحدود بشكل جيد ، انتقد ببساطة نظيفة بشكل جيد مع Kimwipe وتطبيق منصة جديدة agarose. 3. تطبيق كامل 300 عينة ميكرولتر (راجع الخطوة 6) إلى الشريحة ، وزعت على رأس كل وسادة agarose. وينبغي أن هذا المبلغ من الخلايا تكون كافية لتغطية كل بئر على الشريحة. 4. السماح للشريحة محملة الخلايا على الجلوس في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لنحو عشر دقائق. وهذه الخطوة تسمح للخلايا ليستقر على منصة متحركة وagarose تصبح جاهزة للتصوير. لتلبية الاحتياجات المتخصصة درجة الحرارة هذه قد تحتاج إلى تغيير ، على سبيل المثال ، عند إجراء التجارب التي تتطلب تحولا في درجة الحرارة 4. 5. نضح بعيدا المتوسطة الزائدة من كل جانب دون إزالة منصات أنفسهم. 6. تطبيق ساترة إلى الشريحة ، والضغط بقوة وبشكل متساو ، ولكن بلطف ، وعبر مساحة الشريحة. تحقق للتأكد من أن تنزلق الغطاء ضد الشريحة والتي لم يتم رفع الغطاء ينزلق فوق الشريحة. التصور من الخلايا 1. فإن العديد من المجاهر مضان مختلفة تعمل بشكل جيد. فمن الأهمية بمكان أن يكون الانغماس النفط 100X العدسة. يستخدم مختبر سيمونز : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اوليمبوس BX61 المجهر مجهزة 1،45 NA النفط 100X TIRFM عدسة الهدف الغمر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبريد هاماماتسو ORCAR 2 كاميرا CCD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجويف معدني قوس 200 (قبل) مصدر الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن GFP (FITC) ، تصفية الإثارة وانبعاث 460-500 510-560 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن 64 FM4 (TRITC) ، 510-560 تصفية الإثارة وانبعاث 572-648. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم القبض على الصور باستخدام SlideBook 4.2 (الشكل 1) </li></ul> 2. جعل الخلايا في التركيز باستخدام الضوء الأبيض. 3. التقاط الصور باستخدام المرشحات المناسبة لكل fluorophore. ممثل النتائج وتظهر الصور ممثل (الشكل 1). وينبغي أن تحدد بؤر GFP جيد ، في حين FM4 - 64 تلطيخ ينبغي أن يكون مشرقا وواضحا 4-7. يمكن GFP أو الغشاء تكون الصور الملونة الزائفة مع أي لون ، للسماح للصورة عالية الجودة لتقديمها دون فقدان أية بيانات. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 : صور الممثل GFP باء وترد الرقيقة البروتينات الانصهار متعدية. البروتينات GFP باللون الأخضر ، في حين أظهرت تلطيخ FM4 غشاء - 64 باللون الأحمر. شريط النطاق الأبيض يشير 3 ميكرومتر (A) MutS - GFP [الوراثي ذات الصلة : mutS -- GFP (SPC) ، amyE : Pspac mutL (القط)]. في وجود 600 ميكروغرام / مل 2 و 1 aminopurine IPTG ملم. لم يتم تقديم FM4 - 64 في إشارة إلى النظام أكثر وضوحا تظهر بؤر MutS - GFP (B) MutL - GFP [الوراثي ذات الصلة : mutL : mutL - GFP (SPC)].. في وجود aminopurine - 2 (C) DnaX - GFP [الوراثي ذات الصلة : dnaX : dnaX - GFP (SPC)]. (D) RecA - GFP [الوراثي ذات الصلة : recA : recA - GFP (SPC)] في وجود من 20 نانوغرام / مل mitomycin C. (E) - TagC GFP [الوراثي ذات الصلة : tagC : tagC - GFP (SPC) ] في وجود من 1 ميكروغرام / مل جيم mitomycin <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المعاملة / الاعتقال أو مقدار </td><td> وظيفة </td><td> وقت الحضانة </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20-150 نانوغرام / مل] </td><td> الحمض النووي عامل مؤلكل </td><td> 1 ساعة </td></tr><tr><td> 2 - aminopurine (2 - AP) [600 ميكروغرام / مل] </td><td> تطابق حمل </td><td> 1 ساعة </td></tr><tr><td> هيدروكسي يوريا (HU) </td><td> يستنزف dNTPs </td><td> 3 ساعات </td></tr><tr><td> الأشعة فوق البنفسجية (UV) 20 J/m2 </td><td> الثايمين ، والثايمين dimers برومة 6-4 </td><td> تختلف تبعا للمصدر ، وعادة 20 ثانية </td></tr><tr><td> الرمادي (الإشعاع المؤين) 5-100 غراي </td><td> فواصل حبلا مزدوجة ، فواصل حبلا واحدة وقاعدة الضرر المواقع </td><td> تختلف تبعا للمصدر </td></tr></tbody></table>"&gt; الجدول 1. ملخص من الحمض النووي الضارة والعلاجات إحداث تطابق <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> Multitest الشريحة ، كذلك 15 </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> مجهر غطاء زجاج </td><td> الصياد </td><td> 12-544 - B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> الصياد </td><td> BP160 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> سيغما </td><td> M0503 - 2MG </td><td> المغير ، والقفازات ارتداء </td></tr><tr><td> 2 - Aminopurine </td><td> سيغما </td><td> A3509 - 250MG </td><td> قفازات </td></tr><tr><td> هيدروكسي يوريا </td><td> سيغما </td><td> H8627 - 25G </td><td> قفازات </td></tr><tr><td> FM4 - 64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> ضوء حساسية </td></tr></tbody></table> الجدول 2. قائمة محددة من الكواشف والمعدات :

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

مطلوبة التجربة والخطأ لإيجاد ظروف التعرض للصور عالية الجودة لكل سلالة ، نجد أن 1 ميلي ثانية واحدة غير مناسبة للصور الضوء الأبيض ، في حين أن التعرض لل100-2000 مللي المناسبة لGFP (FITC) وFM4 64 (TRITC ) الصور. وزمن التعرض تختلف تبعا لمعدات التصوير المستخدمة. نوصي باستخدام سلالة واحدة لكل شريحة المجهر 15 - جيدا لأبسط التصوير ، ونوعية اللوحة ونشر الخلايا من الحدود منصة يمكن ان يعقد اذا تمايز سلالة سلالات متعددة موجودة على الشريحة نفسها. جودة الصورة تعتمد بشكل مباشر على نوعية لوحة agar...

وصفات محددة حل 1 : S7 10X 50 أملاح 0.5 اجتماعات الأطراف M 100 ملي سلفات الأمونيوم 50 فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ملي فلتر تعقيم ، والتفاف وسائل الاعلام في 50 S7 احباط قبل التخزين 100X المعادن 0.2 م 2 MgCl 70 ملم CaCl 2 5 ملم MnCl 2 0.1 ملم ZnCl 2 100 ميكروغرام / مل حمض الهيدروكلوريك الثيامين 2 ملم حمض الهيدروكلوريك 0.5 مم FeCl 3 * 2 O درهم للحجم النهائي * ينبغي أن يضاف 3 FeCl الماضي ، لمنع هطول الأمطار. بعد التصفية والتعقيم ، والمعادن 100X التفاف الحل في احباط. S7 50 وسائل الإعلام 1X S7 50 أملاح 1X معدنية 1 ٪ جلوكوز 0.1 ٪ جلتاميت 40 ميكروغرام / مل تريبتوفان 40 ميكروغرام / مل فينيلالاناين المقطر H 2 O للحجم النهائي 10X Spizizens (جرام / لتر) كبريتات الامونيوم 151.4 ملم (20G / L) 803.8 فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ملم (140G / L) 440.9 فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ملم (60g / L) 34.0 ملي سترات الصوديوم (10G / L) 16.6 ملي MgSO 4 (2G / L) 2 O درهم للحجم النهائي فلتر تعقيم

التصوير إصلاح عدم تطابق والردود الخليوي الى الحمض النووي من التلف في<emالعصوية الرقيقة></em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى لرد على الحمض النووي من التلف من خلال مجموعة معقدة من التغيرات الفسيولوجية. ويمكن حفز تغييرات في التعبير الجيني ، وإعادة توزيع البروتينات الموجودة ، والتجمع من البروتين مجمعات جديدة من جانب مجموعة متنوعة من آفات الحمض النووي وغير متطابقة أزواج قاعدة الحمض النووي. وقد تم استخدام المجهر مضان كأداة تجريبية قوية لتصور وقياس هذه وغيرها من الردود على آفات الحمض النووي DNA ، ورصد حالة النسخ المتماثل داخل البنية التحت خلوية معقدة للخلية الحية. وقد استخدمت متعدية اندماج بين البروتينات الفلورية مراسل ومكونات وآليات تكرار الحمض النووي لتحديد إصلاح العظة ان البروتينات التي تستهدف إصلاح الحمض النووي لهذه الآفات وما شابه ذلك<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; وعلى فهم كيف يتم تنظيم هذه البروتينات داخل الخلايا البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت اندماج النسخي ومتعدية مرتبطة المروجين DNA محرض الضرر الذي الخلايا ضمن مجموعة من السكان من تنشيط استجابات التوتر السامة. في هذا الاستعراض ، ونحن نقدم تفصيلية لبروتوكول باستخدام المجهر مضان لصورة التجمع للإصلاح الحمض النووي DNA والمجمعات النسخ في الخلايا البكتيرية واحد. على وجه الخصوص ، هذا العمل يركز على إصلاح البروتينات التصوير تطابق ، إعادة التركيب مثلي ، تكرار الحمض النووي والبروتينات في SOS - محرض<emالعصوية الرقيقة&gt;</em&gt;. كل الإجراءات المذكورة هنا هي قابلة بسهولة للمجمعات البروتين التصوير في مجموعة متنوعة من أنواع البكتيريا.

ووصف مفصل لبروتوكول التصوير تشكيل الوقت الحقيقي من المجمعات في إصلاح الحمض النووي<emالعصوية الرقيقة&gt;</em&gt; الخلايا.

تستجيب كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى لتلف الحمض النووي (DNA) من خلال مجموعة معقدة من التغيرات الفسيولوجية. وتؤدي التغيرات في التعبير الجيني، وإعادة توزيع...

سلالات Baus TLU التي تحمل اندماجات ترجمية لبروتينات إصلاح عدم التطابق. يتم تخطيط البروتينات المندمجة مع GFP على أوساط اختيارية. وتُستخدم الخلايا المخططة كلقاح حديث للزراعة السائلة.تُنمى الخلايا حتى تصل الكثافة الضوئية OD 600 إلى 0.3 إلى 0.4، وعند هذه النقطة يتم تطبيق معالجات تحفيز عدم التطابق حسب الرغبة، وتُستأنف تنمية الخلايا حتى تصل الكثافة الضوئية OD 600 إلى 0.5 إلى 0.8 ثم تُجمع الخلايا. يُضاف صبغ الغشاء FM 4 64 إذا لزم الأمر، وتوضع الخلايا على شرائح تحتوي على وسادات aros مُجهزة، وتُترك لتترسب بعد إزالة الوسط الزائد عن طريق الشفط.يتم وضع غطاء الشريحة وفحص الخلايا باستخدام المجهر. مرحبًا، أنا د. Andrew Kow من مختبر د. Lyle Simmons في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية والنمائية بجامعة ميشيغان آن أربور. سنعرض لكم اليوم إجراءً يُستخدم لتصور الاندماجات الترجمية لبروتينات إصلاح عدم تطابق DNA، بالإضافة إلى بروتينات الإصلاح والبروتينات الريبوسومية الأخرى في Bacillus subtilis.نستخدم هذا الإجراء لدراسة التفاعل بين بروتينات إصلاح عدم تطابق DNA والبروتينات الريبوسومية في الخلايا الحية لبكتيريا bacillus subtles. لذا، فلنبدأ. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير سلالات B sublist التي تحتوي على بروتين الاندماج الترجمي الذي ترغب في تصويره لبعض السلالات.يكفي البدء قبل يوم واحد من التصوير. ومن الأمثلة على ذلك السلالات التي تنمو جيداً عندما يتم دمج الاندماج الترجمي بين GFP والجين المستهدف في الموقع الداخلي للجين، مثل MU LGFP. عند البدء قبل يوم واحد من التصوير، استخدم عصا معقمة تحت ظروف معقمة لوضع البكتيريا على أطباق تحتوي على وسط LB agro الانتقائي.من أجل تنمية مستعمرات مفردة، يتم التحضين طوال الليل عند 30 درجة مئوية، وفي اليوم التالي، ستُستخدم هذه المستعمرات كلُقاح بدائي. تتطلب بعض سلالات B sublist يومين من النمو قبل الفحص المجهري للحصول على صور عالية الجودة. السلالات المحددة التي تتطلب يومين من النمو هي تلك التي يضعف نموها بسبب الاندماج الترجمي مثل rec A GFP؛ في اليوم الأول، يتم تخطيط البكتيريا على وسط LB AED الانتقائي والتحضين طوال الليل.في اليوم الثاني، قم بإجراء تخفيف تسلسلي. أولاً، اختر مستعمرة واحدة لتلقيح 100 µL من محلول ملحي بتركيز 0.85%، ثم قم بإجراء أربعة تخفيفات تسلسلية بمعدل عشرة أضعاف، وزع 100 µL من كل تخفيف ملحي، بالإضافة إلى المستعمرة الأولية والمحلول الملحي، على أطباق LB aerates تحتوي على مضادات حيوية اختيارية. قم بحضن الأطباق طوال الليل، عادةً عند 30 °C. بعد فترة الحضن الثانية طوال الليل، اختر طبق التخفيف الذي يُظهر نمواً خفيفاً متصلاً للخلايا.توفر هذه الطريقة لقاحاً أولياً ينمو بشكل أسي وصحي، مما قد يؤدي إلى نتائج تصوير ممتازة. وهذا مفيد بشكل خاص للحصول على أعلى جودة تصوير لصبغ الغشاء. عند استخدام FM 4 64 في صباح يوم التصوير، ضع 10 milliliters من وسط S seven 50 في دورق معقم سعة 125 milliliter.وبذلك يتم الحفاظ على نسبة هواء إلى وسط زراعي لا تقل عن عشرة أضعاف. أعد تعليق الخلايا في ما يصل إلى 2 milliliters من وسط S seven 50 من اللوحة (lppl) التي تحتوي على مستعمرات منفردة أو خلايا وصلت إلى حالة الالتحام (confluence) للحصول على اللقاح. أضف كمية كافية من لقاح الخلايا في وسط S seven 50 إلى دورق إرلن-ماير الذي يحتوي على 10 milliliters من وسط S seven 50 بحيث تكون الكثافة الضوئية الأولية للزراعة عند طول موجي 600 نانومتر (OD 600) حوالي 0.08 إلى 0.1.بعد ذلك، قم بتنمية كل مستنبت عند درجة الحرارة المناسبة لسلالة القائمة الفرعية B المراد تصويرها. يُفضل استخدام حمامات مائية هزازة بسرعة تتراوح من 150 إلى 200 دورة في الدقيقة. استمر في تنمية المستنبتات حتى تصل قيمة OD 600 إلى حوالي 0.5 إلى 0.8.بالنسبة للمزارع التي يتم تعريضها لعوامل تسبب تلف الحمض النووي DNA أو تحفز حدوث عدم تطابق، يجب تخطيط المعالجة بحيث يتزامن انتهاء فترة الحضانة مع العامل المغير للحمض النووي DNA مع وقت الوصول إلى الكثافة الضوئية المستهدفة OD 600. على سبيل المثال، يتطلب ثنائي أمينو بيورين، وهو نظير يعتمد على DNA يحاكي القاعدة غير المتطابقة عند دمجه في الجينوم، حضانة لمدة ساعة واحدة ويؤدي إلى تكوين بؤر من بروتينات إصلاح عدم التطابق مثل mut LGFP. ومع ذلك، يتطلب تكوين بؤر REC A GFP حضانة لمدة ساعة واحدة مع ميتوميسين C أو أي كاشف آخر يتلف الحمض النووي DNA لتحفيز كسور DNA مزدوجة السلسلة؛ حيث يتم إضافة كل من ثنائي أمينو بيورين وميتوميسين C.عندما تصل المزارع إلى كثافة ضوئية OD 600 تبلغ حوالي 0.3 إلى 0.4، وبعد مرور ساعة واحدة من النمو المطلوبة مع أي من المعاملتين، من المرجح أن تكون المزارع قد وصلت إلى كثافة ضوئية OD 600 تتراوح بين 0.5 إلى 0.8 وتصبح جاهزة للتصوير. ابدأ بنقل 300 µL من الخلايا المستزرعة باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. إذا كان المطلوب هو تصوير الأغشية الخلوية بتخفيف 1 إلى 1000 من صبغة الغشاء FM 4 64 بتركيز 1 mg/mL لكل عينة، فقد يلزم إجراء معايرة لـ FM 4 64 لتحقيق إشارة الفلورسنس المطلوبة.يتراوح نطاق المعايرة النموذجي من 1 إلى 100، أو من 1 إلى 1001 إلى 10,000. تُترك العينات لمدة تصل إلى 10 دقائق أو أثناء تحضير الشريحة. وإذا كان من الضروري معرفة تركيز الخلايا، يتم ترشيح الخلايا باستخدام مرشح سعة 0.2 micrometer مع جهاز تفريغ.بعد ذلك، اغسل الخلايا برفق من على المرشح باستخدام المنظم أو الوسط المناسب أثناء فترة تحضين عينات الخلايا مع FM 4 64. قم بتحضير 1% agros مع 1x zens عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من stock 10x zen إلى 45 ملليلتر من الماء المقطر مع 0.5 غرام من agros، ثم استخدم الميكروويف للإذابة.اترك درجة حرارة الـ aros تتوازن في حمام مائي لتصل إلى 65 درجة مئوية تقريبًا، ثم اسحب 20 µL من الأنواع. ينتهي الأمر بـ 1% من الـ aros المصهور في طرف الماصة. يمثل الـ aros شديد السخونة صعوبة في السحب بالماصة، بينما سيتصلب الـ agros البارد ولن يدخل في طرف الماصة.بعد ذلك، استخدم شريحة ذات 15 بئراً متعددة الاختبارات، وانقل بواسطة الماصة قطرة واحدة بحجم يتراوح تقريباً بين 1 إلى 2 µL من محلول aros إلى كل بئر في الشريحة لتكوين وسادات aros ضحلة؛ حيث سيتصلب aros على الفور.يتم تحضير الشرائح مباشرة قبل إضافة الخلايا لتجنب الجفاف، والذي من شأنه أن يجعل الشرائح غير صالحة للاستخدام. يجب أن تكون منصات aros متمركزة وتملأ كل بئر، ولكن بأقل ارتفاع ممكن لتجنب إزاحة غطاء الشريحة. إذا كانت القطرات مرتفعة جداً أو تشبه الفقاعات، أو إذا انتشرت العينة خارج حدود البئر، فما عليك سوى مسح البئر جيداً باستخدام منديل kim wipe ثم وضع منصة aros جديدة.بعد تجهيز الشريحة، ضع عينة الـ 300 microliter كاملة، والتي تم عزلها مسبقاً في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، على الشريحة مع توزيع العينة فوق كل وسادة aeros. يجب أن تكون هذه الكمية من الخلايا كافية لتغطية كل بئر على الشريحة. اترك الشريحة المحملة بالخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريباً.ستسمح هذه الخطوة للخلايا بالاستقرار على وسادة agros وتصبح غير متحركة، وبالتالي تكون جاهزة للتصوير في نهاية فترة الحضانة التي تستمر لمدة 10 دقائق. اشفط الوسط الزائد من كل بئر دون إزالة الوسادات نفسها. ضع غطاء الشريحة على الشريحة مع الضغط بقوة وبشكل متساوٍ، ولكن بلطف عبر منطقة الشريحة، وتحقق من أن غطاء الشريحة ملاصق للشريحة وأنه ليس مرتفعاً فوقها.انتقل إلى التصوير، حيث ستعمل العديد من المجاهر الفلورية المختلفة بشكل جيد. ومن الضروري توفر عدسة غمر زيتية بقوة 100x. يستخدم مختبر Simmons مجهر Olympus BX 61 مجهزاً بعدسة شيئية غمر زيتية بقوة 100x وفتحة عددية 1.45 مناسبة للمجهر الفلوري ذو الانعكاس الداخلي الكلي أو turf m.المجهر مجهز أيضاً بكاميرا CCD مبردة ومصدر ضوء معدني قوسي LU 200. ابدأ بضبط تركيز الخلايا باستخدام الضوء الأبيض. استخدم المرشح المناسب لكل فلورا.يستخدم الفلتر الرابع للكشف عن GFP. واستخدم فلتر الإثارة من 460 إلى 500 والانبعاث من 510 إلى 560 للكشف عن FM 4 64. واستخدم فلتر الإثارة من 510 إلى 560 والانبعاث من 572 إلى 648.التقط الصورة باستخدام المرشحات المناسبة لكل طبقة. أربعة باستخدام برنامج slide book 4.2. إليك بعض النتائج النموذجية لتصوير بروتين إصلاح عدم تطابق DNA المسمى MU L، والذي تم دمجه ترجمياً مع GFP.تُظهر المزرعة الضابطة غير المعالجة من MU LGFP عدداً ضئيلاً من البؤر، حيث تحتوي معظم الخلايا على مستويات سيتوبلازمية فقط من البروتين الاندماجي mut LGFP. ومع ذلك، فإن غالبية الخلايا التي نُميت في وجود 2-amino purine، والذي يحاكي القاعدة غير المتطابقة عند دمجه في الجينوم، تمتلك بؤر GFP، مما يشير إلى أن بروتين mutal GFP يشارك في التعرف على القواعد غير المتطابقة في DNA وإصلاحها.تتحقق نتائج مماثلة باستخدام سلالة REC A GFP التي نمت في وجود عقار mitomycin C المحفز لتلف الحمض النووي. هنا، تحتوي غالبية الخلايا على بؤرة من rec A GFP بعد المعالجة بـ mitomycin C، مما يشير إلى أن rec A GFP قد استجاب لتلف الحمض النووي وبدأ عملية الإصلاح، بينما لا يُلاحظ ذلك في حالة عدم المعالجة بـ mitomycin C. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية تصور بروتينات الإصلاح في خلايا bacillus subtilis الحية. عند إجراء هذا الإجراء.من المهم تذكر ضرورة التروي عند ضبط تركيز الخلايا بدقة، وقد يتطلب القيام بذلك بعض التدريب. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نقدم الإجراء الذي يمكن أن تستخدم ثنائي الأبعاد agarose هلام تحليل لتحديد هيكل وسيطة النسخ التالية التي تحدث للاشعة فوق البنفسجية.

تصور الوسطيات المتماثل للأشعة فوق البنفسجية يتسبب في E. القولونية ثنائي الأبعاد باستخدام Agarose جل التحليل

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يمكن للتصوير الطيفي الإلكتروني تصوير وتمييز الحمض النووي عن البروتين بدقة نانومتر. يمكن دمجه مع نظام miniSOG ، القادر على تسمية البروتينات الموسومة على وجه التحديد في عينات المجهر الإلكتروني الناقل. نوضح استخدام هذه التقنيات باستخدام بؤر إصلاح كسر مزدوجة الخيط كمثال.

تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

والهدف من هذا البروتوكول لوصف كيفية استخدام الليزر ميكرويرادييشن لحمل أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي، بما في ذلك فواصل حبلا بسيطة نسبيا والأضرار معقدة، لدراسة الحمض النووي الضرر إشارات وإصلاح عامل الجمعية في مواقع الضرر الحية .

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

الأسفار [كنفوكل] مجهرية والليزر أدوات العرض الجزئي-التشعيع لإحداث ضرر الحمض النووي، ورصد الاستجابة للبروتينات إصلاح الحمض النووي في المجالات النووية الفرعي المحدد. هذا الأسلوب قد دفعة قوية لمعرفتنا بالكشف عن الأضرار، والإشارات، والتوظيف. هذه المخطوطة يوضح هذه التكنولوجيات لدراسة إصلاح كسر حبلا مفردة ومزدوجة.

تطبيق الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة واحدة ومزدوجة حبلا كسر إصلاح في خلايا الثدييات

إصلاح فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي عملية دينامية، تتطلب ليس فقط تشكيل مجمعات إصلاح فواصل، ولكن أيضا على القرار بعد معالجة الآفة. هنا، نستخدم مجهرية الفلورة لفواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل عابرة وطويلة الأمد كأداة لتشريح هذه الآلية صيانة الجينوم.

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

لم يتم بشكل كامل تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). يوفر هذا البروتوكول إجراءً خطوة بخطوة للكشف عن البؤر الناجمة عن الإشعاع (RIF) من البروتينات الإصلاح عن طريق تلطيخ المناعة في خطوط خلايا سرطان القولون البشرية بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط.

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

بعد تلف الحمض النووي، تقوم الخلايا البشرية بتنشيط مسارات الإصلاح الأساسية لاستعادة سلامة جينومها. هنا، نحن وصف طريقة من المناعة غير المباشرةflufluorescence كوسيلة للكشف عن البروتينات إصلاح الحمض النووي، وتحليل توظيفها المكانية والزمانية، والمساعدة في استجواب التفاعل البروتين البروتيني في مواقع الضرر الحمض النووي.

التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

تقدم هذه المقالة الخطوات الأساسية لتثبيط المناعة والكروماتين المناعي. وتستخدم هذه البروتوكولات عادة لدراسة العمليات الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي ولتصور وقياس تجنيد البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي.

تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور على الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين كسر إشارة تنشيط ردا على الحمض النووي من التلف وكذلك التوطين خلال الانقسام.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

منارات ثنائي الجزيء Ratiometric (RBMBs) يمكن استخدامها لصورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية. هنا، نحن تصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم من RBMBs إلى الخلايا عن طريق microporation والتصوير الفلورسنت النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

اكتشف بروتوكول تصوير مركبات إصلاح الحمض النووي في خلايا Bacillus subtilis باستخدام بروتينات GFP المدمجة. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات إصلاح عدم التطابق في الوقت الفعلي.

التصوير إصلاح عدم تطابق والردود الخليوي الى الحمض النووي من التلف في

استكشف المزيد من الفيديوهات